Tách chiết, đánh giá khả năng kháng khuẩn gây bệnh từ chủng vi khuẩn được phân lập từ nem chua việt nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “TÁCH CHIẾT, ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN GÂY BỆNH TỪ CHỦNG VI KHUẨN ĐƢỢC PHÂN LẬP TỪ NEM CHUA VIỆT NAM” HÀ NỘI - 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “TÁCH CHIẾT, ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN GÂY BỆNH TỪ CHỦNG VI KHUẨN ĐƢỢC PHÂN LẬP TỪ NEM CHUA VIỆT NAM” Ngƣời thực : NGUYỄN THỊ THANH THƢ Mã sinh viên : 637079 Lớp : K63CNSHA Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC GV hƣớng dẫn : TS NGUYỄN SỸ LÊ THANH : TS BÙI THỊ THU HƢƠNG HÀ NỘI - 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực chƣa đƣợc sử dụng công bố Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực khóa luận tốt nghiệp đƣợc cảm ơn thơng tin trích dẫn đƣợc rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên Nguyễn Thị Thanh Thƣ i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin trân trọng cảm ơn ban Giám đốc Học viện, khoa Công nghệ sinh học thầy, khoa tận tình giảng dạy, giúp đỡ em suốt trình học tập, rèn luyện Học viện Nông nghiệp Việt Nam, giúp em trƣởng thành nhân cách trình độ chun mơn Với tất kính trọng, em xin bày tỏ lòng biết ơn trân thành sâu sắc đến thầy TS Nguyễn Sỹ Lê Thanh- phó trƣởng phịng CNSH Enzyme- Viện Cơng Nghệ Sinh Học- Viện Hàn lâm Khoa học Công Nghệ Việt Nam, ngƣời hết lòng hƣớng dẫn, truyền đạt kiến thức quý báu, dành nhiều thời gian, tận tâm bảo giúp đỡ tơi suốt q trình làm khóa luận m c ng xin gửi ời cảm ơn trân thành tới T Nguyễn Thị Hiền Trang c ng toàn th cán bộ, anh chị, bạn bè ph ng ông nghệ sinh học nzyme, Viện Công nghệ sinh học- Viện Hàn Lâm Khoa học ông nghệ Việt Nam bảo, giúp đỡ tận tình cho em suốt trình em thực đề tài Em xin trân thành cảm ơn cô TS Bùi Thị Thu Hƣơng, tồn th thầy giáo kỹ thuật viên Bộ môn Sinh Học, khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam nhiệt tình bảo tạo điều kiện thuận lợi cho em thực khóa luận tốt nghiệp Nhân dịp em c ng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, ngƣời thân, bạn bè, ngƣời tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ em vƣợt qua khó khăn q trình học tập, nghiên cứu c ng nhƣ hoàn thành khóa uận tốt nghiệp Với điều kiện thời gian c ng nhƣ kinh nghiệm c n hạn chế c a sinh viên, đồ án khóa luận khơng th tránh đƣợc thiếu sót bảo, đóng góp m mong nhận đƣợc kiến c a thầy đ có điều kiện bổ sung, nâng cao kiến thức c a mình, phục vụ tốt cơng tác thực tế sau Em xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên Nguyễn Thị Thanh Thƣ ii MỤC LỤC LỜI AM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH viii TÓM TẮT ix PHẦN 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu 1.2.2 Yêu cầu Ý nghĩa thực tiễn PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Thành phần lên men nem chua 2.1.1 Giới thiệu nem chua 2.1.2 Vi khuẩn sản xuất nem chua 2.2 Phát chất bảo quản thực phẩm quý nem chua c a Việt Nam 2.3 Tổng quan Lactobacillus plantarum 2.3.1 Phân loại Đặc m chung c a vi khuẩn Lactobacillus plantarum 3 Đặc tính sinh hóa c a Lactobacillus plantarum 10 2.3.4 Ứng dụng c a vi khuẩn L plantarum 10 2.4 Bản chất chế c a L plantarum kháng khuẩn 12 2.4.1 Bacteriocins 12 2.4.2 Acid hữu 15 2.4.3 Chất tạo bề mặt sinh học 17 iii 2.5 Tình hình nghiên cứu nƣớc Lactobacillus 20 2.5.1 Các nghiên cứu giới 20 2.5.2 Các nghiên cứu nƣớc 21 Định danh vi sinh vật 21 2.6.1 Định danh vi sinh vật theo phƣơng pháp truyền thống 21 Định danh vi sinh vật dựa vào vật liệu di truyền 22 PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN ỨU 24 3.1 Vật liệu 24 3.1.1 Nguyên liệu 24 3.1.2 Dụng cụ Hóa chất 24 3 Môi trƣờng nuôi cấy 26 Địa m thời gian nghiên cứu 26 Phƣơng pháp nghiên cứu 26 3.2.1 Phân lập ch ng vi khuẩn Lactobacillus 27 3.2 Đánh giá khả kháng khuẩn gây bệnh c a Lactobacillus 27 3.2.3.Ki m tra sơ tính chất c a hoạt chất kháng khuẩn 28 3.2 Định danh vi khuẩn Lactobacillus phƣơng pháp sinh học phân tử 28 3.2.5 Tách chiết hoạt chất thứ cấp dung môi phân cực 32 3.2.6 Tinh sơ protein 32 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ KẾT LUẬN 34 4.1 Phân lập ch ng vi khuẩn Lactobacillus 34 4.2 Phổ kháng khuẩn c a ch ng LAB nghiên cứu 36 Đánh giá tính chất c a hợp chất kháng khuẩn 37 4 Định danh ch ng vi khuẩn dựa giải trình tự 16S rDNA 38 4 Định danh ch ng 22A 39 4.4 Định danh ch ng L1 42 4.5 Tách chiết hoạt chất thứ cấp dung môi phân cực 44 4.6 Tinh sơ protein 45 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 iv 5.1 Kết luận 48 5.2 Kiến nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC 55 v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT LAB: Lactic Acid Bacteria ( vi khuẩn Lactic) MRS: De Man- Rogosa- Sharpe CFS: Cell Free Supernatant (phần không tế bào) MT: Môi trƣờng VK: Vi khuẩn VSV: Vi sinh vật PE: Polyethylene NCBI: National Center for Biotechnology Information- Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia PCR: Polymerase Chain Reaction- Phản ứng chuỗi polymerase rRNA: Ribosomal ribonucleic acid CFU: Colony Forming Unit- đơn vị hình thành khuẩn lạc Cs: Cộng vi DANH MỤC CÁC BẢNG ảng 3.1: Các thiết bị đƣợc sử dụng 24 Bảng 3.2 Danh sách hóa chất đƣợc sử dụng 25 Bảng 3.3 Danh sách dung dịch đệm đƣợc sử dụng 25 Bảng 3.4: Thành phần c a phản ứng PCR 30 Bảng 4.1 Hình thái khuẩn lạc phân lập đƣợc từ nem chua 35 Bảng Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn c a số ch ng vi khuẩn phân lập đƣợc 36 Bảng 4.3 Kết so sánh mức độ tƣơng đồng trình tự c a ch ng Lactobacillus 22A với loài vi khuẩn ngân hàng liệu gene c a NCBI 40 Bảng 4.4 Kết so sánh mức độ tƣơng đồng trình tự c a ch ng L1 với loài vi khuẩn ngân hàng liệu gene c a NCBI 42 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Nem chua Hình 2.2 Hợp chất P antacyc in 21AG đƣợc phân lập từ nem chua có khả tiêu diệt vi khuẩn có hại Hình 2.3 Cấu trúc protein c a hợp chất bền, khó bị phá vỡ Hình Lactobaci us p antarum dƣới kính hi n vi điện tử 10 Hình Đĩa phân ập ch ng N1 (A); Đĩa àm ch ng vi khuẩn N1 (B) 34 Hình Đĩa kháng aureus c a ch ng L1, N1, 22A 36 Hình 4.3 Khả kháng khuẩn c a chất kháng khuẩn với nhiệt protease K 38 Hình 4 Điện di sản phẩm PCR khuếch đại vùng 16s rARN c a ch ng 22A, N1, L1 gel agarose 0.8% 39 Hình ây phát sinh ồi ch ng 22A 40 Hình 4.6 Cây phát sinh lồi ch ng L1 43 Hình 4.7 Hoạt tính kháng khuẩn c a dịch chiết 22A, L1 sau quay 45 Hình 4.8 Hoạt tính kháng khuẩn c a ch ng N1 sau thẩm tích loại muối amonisunfat 46 viii amoni sulfat nồng độ 50% Phần t a sau h a tan với đệm P 1X đem thẩm tích oại muối thu đƣợc kết nhƣ hình Từ kết cho thấy kết t a protein nồng độ 50% hoạt động kháng khuẩn c a hợp chất kháng khuẩn sinh tƣơng đối mạnh với ch ng khuẩn ki m định S aureus với bề rộng vòng kháng ên đến mm Tuy nhiên, quan sát thấy phần dịch sau y tâm t a c ng xuất vòng kháng khuẩn nhƣng vòng kháng tƣơng đối nhỏ Nguyên nhân nồng độ này, protein chƣa t a hết Vì vậy, đ tăng hiệu suất thu hồi đạt cao ta nên oại cặn tiếp tục tăng nồng độ muối amoni sunfat lên 60% Hình 4.8 Hoạt tính kháng khuẩn chủng N1 sau thẩm tích loại muối amonisunfat Chú thích: Đối chứng (+): Cloramphenicol 0,4%; Đối chứng (-): dịch sau ly tâm (5000v/phút, 15 phút) tủa amonisunfat chủng N1 Ở phƣơng pháp kết t a protein muối, Tính tan c a protein bị ảnh hƣởng ion Ở nồng độ ion thấp (