Khóa luận tốt nghiệp đánh giá đặc tính sinh học của chủng vi khuẩn ưa nhiệt và chịu kiềm có khả năng phân giải cellulose phân lập từ đống ủ trồng nấm

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA CHỦNG VI KHUẨN ƯA NHIỆT VÀ CHỊU KIỀM CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI CELLULOSE PHÂN LẬP TỪ ĐỐNG Ủ TRỒNG NẤM Sinh viên thực : Phạm Thị Kiều Loan Chuyên ngành : Nấm ăn Nấm dược liệu Giảng viên hướng dẫn : PGS.TS Nguyễn Xuân Cảnh HÀ NỘI – 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài: “Đánh giá đặc tính sinh học chủng vi khuẩn ưa nhiệt chịu kiềm có khả phân giải cellulose phân lập từ đống ủ trồng nấm” trực tiếp thực Các số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực, chưa sử dụng công bố luận văn, luận án cơng trình khoa học trước Các thơng tin, trích dẫn sử dụng khóa luận ghi rõ nguồn gốc, đảm bảo trích dẫn theo quy định Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm lời cam đoan này! Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2021 Sinh viên Phạm Thị Kiều Loan       i LỜI CẢM ƠN Sau thời gian thực tập phịng thí nghiệm mơn vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, bên cạnh cố gắng, nỗ lực thân với giúp đỡ bảo tận tình thầy cô giáo môn Công nghệ Vi sinh, tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn tất thầy giáo ngồi khoa Cơng nghệ sinh học truyền đạt cho kiến thức quý báu suốt thời gian học tập Học viện Nơng nghiệp Việt Nam Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới thầy PGS TS Nguyễn Xuân Cảnh – trưởng Khoa Công nghệ sinh học, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện tốt suốt q trình thực tập Tơi xin dành lời cảm ơn chân thành tới cô ThS Trần Thị Đào, ThS Trần Thị Hồng Hạnh, ThS Nguyễn Thị Thanh Huyền, chị Nguyễn Thị Thu thầy cô khoa Công nghệ sinh học giúp đỡ, tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa luận Tôi xin cảm ơn tất anh chị, bạn, em phịng thí nghiệm mơn Vi sinh Trung tâm Đào tạo, nghiên cứu phát triển nấm – Khoa Công nghệ sinh học hỗ trợ, giúp đỡ tơi nhiều để hồn thành khóa luận Cuối cùng, tơi xin bày lịng kính trọng, lời cảm ơn chân thành tới người thân tôi, bên cạnh động viên, tạo động lực cho tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2021 Sinh viên Phạm Thị Kiều Loan         ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG .v DANH MỤC HÌNH/ĐỒ THỊ vi BẢN TÓM TẮT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP viii Phần I MỞ ĐẦU .1 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích, yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình nghiên cứu, sản xuất nấm giới Việt Nam 2.1.1 Tình hình nghiên cứu, sản xuất nấm giới 2.1.2 Tình hình nghiên cứu, sản xuất nấm Việt Nam 2.2 Quá trình ủ nguyên liệu trước trồng nấm 2.3 Vi sinh vật đống ủ trồng nấm 2.3.1 Vi khuẩn đống ủ trồng nấm 2.3.2 Xạ khuẩn đống ủ trồng nấm .10 2.3.3 Vi nấm đống ủ trồng nấm 11 2.4 Ứng dụng vi sinh vật đống ủ trồng nấm 12 2.4.1 Vai trò đống ủ 12 2.4.2 Ứng dụng làm phân hữu compost [30] 12 2.4.3 Ứng dụng enzyme từ vi sinh vật đống ủ 13 Phần III NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1 Vật liệu nghiên cứu .18 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18 3.1.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 18   iii 3.2 Môi trường, dụng cụ, thiết bị 18 3.2.1 Môi trường 18 3.2.2 Dụng cụ thiết bị .20 3.3 Phương pháp nghiên cứu 20 3.3.1 Phương pháp thu mẫu 20 3.3.2 Phương pháp phân lập, làm 20 3.3.3 Phương pháp giữ giống vi sinh vật 20 3.3.4 Phương pháp khảo sát khả chịu nhiệt chủng vi khuẩn .21 3.3.5 Phương pháp kiểm tra khả sinh enzyme chủng vi khuẩn chịu nhiệt 21 3.3.6 Xác định hoạt độ Cellulase định lượng đường khử với thuốc thử DNS .22 3.3.7 Nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố môi trường đến hoạt độ enzyme Cellulase chủng vi khuẩn phân lập 24 3.3.8 Khảo sát số đặc điểm hóa sinh .25 Phần IV: KẾT QUẢ 28 4.1 Kết phân lập chủng vi khuẩn 28 4.2 Kết khảo sát khả chịu nhiệt chủng vi khuẩn 29 4.3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn chịu nhiệt có khả sinh enzyme Cellulase .30 4.3.1 Sử dụng phương pháp cấy chấm điểm 30 4.3.2 Sử dụng phương pháp khuếch tán đĩa thạch 31 4.4 Hoạt độ cellulase chủng vi khuẩn tuyển chọn 33 4.4.1 Xây dựng đường chuẩn glucose 33 4.4.2 Xác định hoạt độ enzyme cellulase 34 4.5 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến khả sinh enzyme cellulase 35 4.5.1.Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh enzyme cellulase .35 4.5.2 Ảnh hưởng pH đến khả sinh enyme .37 4.5.3 Ảnh hưởng nguồn Carbon đến khả sinh enzyme 38 4.5.4 Ảnh hưởng nguồn N đến khả sinh enzyme .40 4.5.5 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh enzyme 40 4.6 Khảo sát số đặc điểm hóa sinh 41 4.6.1 Thử nghiệm Metyl Red (MR) 41   iv 4.6.2 Thử nghiệm khả biến dưỡng citrate 42 4.6.3 Thử nghiệm khả di động .42 4.6.4 Khảo sát nhuộm Gram 43 4.6.5 Phản ứng Catalase .44 Phần V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .46 5.1 Kết luận 46 5.2 Kiến nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO .47 PHỤ LỤC 49   v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Đặc tính sinh học chủng vi sinh vật đống ủ trồng nấm [34] Bảng 2.3 Một số enzyme ngoại bào Bacillus [19] Bảng 3.1 Thành phần môi trường ống nghiệm lập đường chuẩn Glucose 22 Bảng 3.2 Bảng chuẩn bị ống đối chứng, thí nghiệm đo hoạt độ cellulase .23 Bảng 4.1 Hoạt tính cellulase chủng vi khuẩn chịu nhiệt 32 Bảng 4.2 Kết đo OD dựng đường chuẩn glucose 33 Bảng 4.3 Một số đặc điểm hóa sinh hai chủng vi khuẩn nghiên cứu 44   vi DANH MỤC HÌNH/ĐỒ THỊ Hình 4.1 Một số chủng vi khuẩn phân lập từ đống ủ trước trồng nấm 29 Hình 4.2 Khả sinh trưởng chủng vi khuẩn 55 °C 30 Hình 4.3 Khả sinh enzyme chủng vi khuẩn phân lập 31 Hình 4.4 Khả sinh enzyme cellulase chủng vi khuẩn chịu nhiệt phương pháp đục giếng thạch 32 Hình 4.5 Đồ thị đường chuẩn glucose 34 Hình 4.6 Hoạt độ enzyme cellulase chủng vi khuẩn tuyển chọn 34 Hình 4.7 Ảnh hưởng thời gian ni cấy đến khả sinh enzyme cellulase 36 Hình 4.8 Ảnh hưởng pH môi trường đến khả sinh enzyme cellulase 37 Hình 4.9 Ảnh hưởng nguồn chất cảm ứng đến khả sinh enzyme cellulase chủng M5-3 M5-4 39 Hình 4.10 Ảnh hưởng nguồn N đến khả sinh enzyme cellulase chủng M5-3 M5-4 40 Hình 4.11 Ảnh hưởng nguồn N đến khả sinh enzyme cellulase chủng M5-3 M5-4 41 Hình 4.12 Kết thí nghiệm MR hai chủng vi khuẩn 42 Hình 4.13 Kết thử nghiệm citrate hai chủng vi khuẩn 42 Hình 4.14 Khả di động hai chủng vi khuẩn nghiên cứu .43 Hình 4.15 Kết nhuộm gram chủng vi khuẩn 43 Hình 4.16 Kết phản ứng Catalase chủng vi khuẩn .44   vii BẢN TÓM TẮT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên khóa luận: Đánh giá đặc tính sinh học chủng vi khuẩn ưa nhiệt chịu kiềm có khả phân giải cellulose phân lập từ đống ủ trồng nấm Giảng viên hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Xuân Cảnh Sinh viên thực hiện: Phạm Thị Kiều Loan Lớp: K62-CNSHP Hiện nhu cầu nấm ăn nấm dược liệu phát triển, loại nấm khơng cịn q xa lạ với người dân mà sử dụng thường xuyên, mệnh danh thịt sạch, rau chứa hàm lượng protein cao axit amin thiết yếu Việc trồng loại nấm không phức tạp, lại sử dụng nguyên liệu mùn cưa, rơm, bông, lõi ngô … Các nguyên liệu có thành phần chủ yếu cellulose, cần ngâm với nước vôi ủ trước nuôi trồng, nên đống ủ chứa nhiều vi sinh vật phân giải cellulose chịu nhiệt Nếu trường hợp đống ủ không lên nhiệt, việc bổ sung loại vi sinh vật cần thiết, định thực nghiên cứu phân lập chủng vi khuẩn phân giải cellulose chịu nhiệt độ cao, pH kiềm đánh giá đặc điểm sinh lý, sinh hóa chúng Trong nghiên cứu này, phân lập 14 chủng vi khuẩn từ đống ủ trước trồng nấm, có chủng vi khuẩn chịu nhiệt độ cao Sau chọn chủng vi khuẩn có khả sinh enzyme Cellulase mạnh M5-3 M5-4 với hoạt lực 69,57% 68,18% Thực khảo sát ảnh hưởng yếu tố môi trường đến khả sinh enzyme chủng vi khuẩn trên, chủng M5-3 có hoạt độ tốt 24 50°C, pH=6, bổ sung chất cảm ứng Dglucose nguồn N tối ưu cao nấm men Chủng M5-4 có hoạt độ tốt 24 50°C, pH=7, bổ sung chất cảm ứng fructose nguồn N tối ưu KNO3 Qua đánh giá số đặc điểm hóa sinh, chủng vi khuẩn trực khuẩn Gram+, có khả di động cho dương tính với phản ứng MR, Catalase, Citrate Do vậy, chúng chủng thuộc chi Bacillus   viii Phần I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Trong đời sống nay, người dân quan tâm đến vấn đề thực phẩm an toàn, lại đảm bảo dinh dưỡng Nấm ăn, nấm dược liệu loại thực phẩm thuốc đáp ứng nhu cầu Được mệnh danh ‘’ thịt sạch, rau sạch’’, nấm chứa hàm lượng protein cao, có đủ loại axit amin khơng thể thay Vì nhu cầu sử dụng nấm ngày lớn, nước Việc nghiên cứu phát triển sản xuất nấm ăn Việt Nam năm 1970, khoảng 20 năm trở lại mặt hàng ý phát triển không từ nông dân mà ngành chức Đặc biệt, kể từ ngày 16/04/2012, theo Quyết định 439 Thủ tướng Chính phủ, nấm ăn nấm dược liệu đưa vào danh mục sản phẩm quốc gia ưu tiên đầu tư phát triển Hiện nay, Việt Nam sản xuất khoảng 16 loại nấm Trong đó, tỉnh phía Nam chủ yếu trồng nấm rơm, nấm mộc nhĩ, nấm bào ngư; tỉnh phía Bắc trồng nấm hương, nấm sị, nấm linh chi với tổng sản lượng hàng năm đạt khoảng 250.000 tấn, kim ngạch xuất đạt 25 - 30 triệu USD (khơng tính xuất tiểu ngạch) [1] Là nước có điều kiện khí hậu thuận lợi đặc biệt nguồn phế phẩm nông, lâm nghiệp rơm rạ, trấu, mùn cưa, bã mía, thân gỗ… lớn (ước tính khoảng 40 triệu tấn), Việt Nam hồn tồn thu giá trị to lớn từ việc trồng nấm Theo ước tính, cần sử dụng từ 10 - 15% lượng nguyên liệu sẵn có, Việt Nam sản xuất đến triệu nấm/năm [1] Phát triển nghề trồng nấm mang lại nhiều ý nghĩa, tận dụng hiệu nguồn phế thải từ nông nghiệp, dọn đồng ruộng, giải phóng đất đai cho mùa vụ mới, mà cịn góp phần giải việc làm cho lực lượng lao động lớn nông thôn với nhiều lứa tuổi Đồng thời, nghề nấm tạo nhiều dịch vụ kèm cung ứng rơm rạ, sản xuất meo nấm, thu mua, sơ chế… Điều quan trọng nghề trồng nấm khơng địi hỏi nhiều vốn đầu tư loại trồng khác, đầu vào chủ yếu rơm rạ, mùn cưa công lao động (chiếm khoảng 70-80% giá thành sản phẩm), lại hoàn   4.5.2 Ảnh hưởng pH đến khả sinh enyme Hoạt độ enzyme phụ thuộc lớn vào pH mơi trường, pH ảnh hưởng đến mức độ hịa tan chất hữu dung dịch, ảnh hưởng đến mức độ ion hóa enzyme, trung tâm hoạt động enzyme, đến phức chất enzyme chất ảnh hưởng đến độ bền enzyme Tiến hành nuôi lỏng lắc 120 vòng/ phút chủng vi khuẩn nghiên cứu môi trường LB lỏng 30 °C giá trị pH khác : 5,6,7,8,9,10,11 Nuôi 72 chủng vi khuẩn M5-3, nuôi 48 chủng vi khuẩn M5-4 Sau li tâm thu enzyme, đo OD bước sóng 540 nm để xác định pH nuôi cấy tối ưu để chủng vi khuẩn nghiên cứu cho hoạt độ enzyme cellulase cao Kết thí nghiệm trình bày hình 4.8 1.2 1.002 Hoạt độ (U/ml) 0.8 0.855 0.771 0.693 0.688 0.6 M5‐3 0.449 M5‐4 0.4 0.2 0.187 0.2 0.203 0.093 0.128 0.089 0.119 0.076 10 11 PH Hình 4.8 Ảnh hưởng pH môi trường đến khả sinh enzyme cellulase Tại giá trị pH khác hoạt độ enzyme cellulase chủng vi khuẩn nghiên cứu biến đổi khác Kết thí nghiệm cho thấy chủng vi khuẩn M53 cho hoạt độ enzyme celluase cao sau pH chủng M5-4 pH Hai chủng vi khuẩn thích hợp sinh trưởng môi trường axit yếu trung tính Nhưng mức pH kiềm pH 8, chủng vi khuẩn nghiên cứu cho hoạt độ enzyme cellulase cao bắt đầu giảm mạnh pH 9,10,11   37 Giá thể trước trồng nấm cần trải qua giai đoạn ủ, trước ủ, người ta phải bổ sung nước vôi cho nguyên liệu nên môi trường đống ủ trồng nấm có tính kiềm Qua kết bảng 4.9 ta thấy, hai chủng vi khuẩn nghiên cứu thích hợp cho việc xử lý đống ủ giá thể trước trồng nấm, chịu pH kiềm Kết tương đồng với kết Nguyễn Thùy Dương nghiên cứu tổng hợp cảm ứng Cellulase số chủng Bacillus phân lập từ đất vườn (2012) [14] Trong kết đó, Nguyễn Thùy Dương phân lập chủng Bacillus có hoạt tính cellulase cao pH ban đầu thích hợp cho sinh trưởng sinh cellulase chủng Bacillus từ 6,5 – 7,5 Chủng ĐM19.1 cho hoạt độ cellulase cao pH = 7,0, chủng ĐM20.2 cho hoạt độ cellulase cao pH = 6,5 Nếu pH ngả kiềm hay acid không tốt cho sinh trưởng chủng Bacillus Điều khác với chủng phân lập từ đống ủ trồng nấm, M5-3 M54 sinh trưởng cho hoạt tính cellulase cao pH kiềm 4.5.3 Ảnh hưởng nguồn Carbon đến khả sinh enzyme Tìm chất cảm ứng phù hợp cho chủng vi khuẩn nghiên cứu Hiện tượng cảm ứng tượng làm tăng tổng hợp enzyme tế bào, bổ sung chất vào mơi trường ni cấy tổng hợp enzyme phân giải chất tăng lên đáng kể Hiện tượng cảm ứng thường biểu nhạy cảm vi sinh vật, hẳn động vật, thực vật Trong số enzyme vi sinh vật tổng hợp, số enzyme bình thường tổng hợp với lượng ít, hàm lượng chúng tăng gấp lên nhiều lần cho thêm số chất định vào môi trường nuôi cấy Monob Cohn (1952) gọi enzyme enzyme cảm ứng Chất gây nên hiệu gọi chất chất cảm ứng Cơ chất cảm ứng thường coi yếu tố quan trọng dùng để điều khiển trình sinh tổng hợp enzyme Bổ sung chất cảm ứng vào dịch nuôi lỏng lắc vi khuẩn Cellulase enzyme cảm ứng enzyme cấu trúc Khi bổ sung chất khác ảnh hưởng đến việc kích thích sinh enzyme Vì cần nghiên cứu để tìm nguồn chất cảm ứng thích hợp cho hoạt độ cellulase tạo lớn   38 Tiến hành nuôi lỏng lắc 120 vịng/ phút 30°C mơi trường LB, pH=6 với chủng M5-3, pH =7 với chủng M5-4 , bổ sung nguồn chất cảm ứng : CMC, sobitol, tinh bột, xylose, D- glucose, fructose, lactose, sucrose Nuôi 72 chủng vi khuẩn M5-3, nuôi 48 chủng vi khuẩn M5-4 Sau li tâm thu enzyme, đo OD bước sóng 540 nm để xác định pH ni cấy tối ưu để chủng vi khuẩn nghiên cứu cho hoạt độ enzyme cellulase cao Kết thí nghiệm trình bày hình 4.9 0.929 0.9 0.8 0.684 0.7 0.607 0.6 Hoạt độ (U/ml) 0.783 0.765 0.501 0.478 0.489 0.5 0.4 M5‐3 0.316 0.3 0.202 0.312 0.248 0.233 0.2 M5‐4 0.226 0.194 0.15 0.1 D‐Glucose CMC Xylose Lactose Sucrose Tinh bột Sobitol Fructose Hình 4.9 Ảnh hưởng nguồn chất cảm ứng đến khả sinh enzyme cellulase chủng M5-3 M5-4 Các chất cảm ứng sử dụng ảnh hưởng khác đến hoạt độ cellulase chủng M5-3 M5-4 Trong đó, D-glucose nguồn chất thích hợp cho việc tổng hợp enzyme cellulase chủng M5-3, cellulase sinh chủng M5-4 có hoạt độ cao ni mơi trường có bổ sung glucose fuctose Kết tương tự với kết Sonia Sethi cộng nghiên cứu hoạt tính cellulase chủng vi khuẩn phân lập từ đất (2013) [22] Trong   39 nghiên cứu đó, chủng Bacillus có hoạt tính cellulase mạnh bổ sung chất cảm ứng fructose glucose 4.5.4 Ảnh hưởng nguồn N đến khả sinh enzyme Tiến hành ni lỏng lắc 120 vịng/ phút 30°C môi trường LB, pH=6, thêm chất D-glucose với chủng M5-3, pH =7, chất cảm ứng fructose với chủng M5-4 Nuôi 72 chủng vi khuẩn M5-3, nuôi 48 chủng vi khuẩn M5-4 Hoạt độ cellulase sinh chủng vi khuẩn tuyển chọn thể hình 4.10 2.5 2.014 2.002 Hoạt độ (U/ml ) 1.965 1.573 1.5 1.296 1.089 1.001 0.922 M5‐3 0.955 0.849 0.794 M5‐4 0.496 0.5 0.243 0.149 cao nấm  men NH4H2PO4 KNO3 NaNO3 NH4NO3 Na2SO4 NH4Cl Hình 4.10 Ảnh hưởng nguồn N đến khả sinh enzyme cellulase chủng M5-3 M5-4 Các nguồn N khác ảnh hưởng khác đến khả sinh enzyme chủng vi khuẩn nghiên cứu Cao nấm men nguồn N tốt cho chủng M5-3, KNO3 nguồn N tốt cho chủng M5-4 4.5.5 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh enzyme Nhiệt độ nhân tố môi trường quan trọng ảnh hưởng đến khả sinh trưởng vi sinh vật Trong phạm vi nhiệt độ định, nhiệt độ tăng khả sinh trưởng vi sinh vật cao Nhưng nhiệt độ vượt giới hạn vi sinh vật chúng ngừng phát triển chết   40 Tiến hành ni lỏng lắc 120 vịng/ phút mơi trường LB, pH=6, thêm chất D-glucose với chủng M5-3, pH =7, chất cảm ứng Fructose với chủng M5-4, nhiệt độ khác : 40°C,45°C,50°C 55°C ngày Kết thí nghiệm trình bày hình 4.11 1.800 1.568 Hoạt độ (U/ml) 1.600 1.374 1.400 1.126 1.200 1.000 0.800 0.985 0.914 M5‐3 0.763 M5‐4 0.600 0.471 0.400 0.247 0.200 0.000 40°C 45°C 50°C 55°C Hình 4.11 Ảnh hưởng nguồn N đến khả sinh enzyme cellulase chủng M5-3 M5-4 Hai chủng vi khuẩn khảo sát tổng hợp cellulase mạnh nuôi 50°C Khi nuôi nhiệt độ 40°C,45°C hoạt độ enzyme cellulase tăng dần, sau ngưỡng nhiệt độ thích hợp 50°C, hoạt độ cellulase chủng vi khuẩn giảm Kết tương đồng với thí nghiệm Nguyễn Thị Huyền (2014) nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh enzyme chủng vi khuẩn phân lập từ đống ủ trồng nấm Trong thí nghiệm đó, chủng vi khuẩn SH8 SH10 cho hoạt tính cellulase cao 50°C giảm dần nuôi 55°C 60°C 4.6 Khảo sát số đặc điểm hóa sinh 4.6.1 Thử nghiệm Metyl Red (MR) Hai chủng vi khuẩn nghiên cứu cho kết dương tính chứng tỏ khả sản xuất trì acid bền trình lên men Kết thí nghiệm thể hình 4.12   41 Hình 4.12 Kết thí nghiệm MR hai chủng vi khuẩn 4.6.2 Thử nghiệm khả biến dưỡng citrate Hai chủng vi khuẩn nghiên cứu cho kết dương tính (mơi trường chuyển từ màu xanh sang màu xanh dương ) Chứng tỏ chủng vi khuẩn M5-3 M5-4 có khả sử dụng citrate làm nguồn C Kết thí nghiệm thể hình 4.13 Hình 4.13 Kết thử nghiệm citrate hai chủng vi khuẩn 4.6.3 Thử nghiệm khả di động Sau khảo sát khả di động chủng vi khuẩn M5-3 M5-4 môi trường thạch mềm cho thấy, vi khuẩn mọc lan quanh đường cấy nên chủng có khả di động   42 Kết thí nghiệm thể hình 4.14 \ Hình 4.14 Khả di động hai chủng vi khuẩn nghiên cứu 4.6.4 Khảo sát nhuộm Gram Nhuộm Gram chủng vi khuẩn soi vật kính X100, hai chủng vi khuẩn M5-3 M5-4 trực khuẩn có màu tím, giữ màu getinian tím, chúng Gram dương Kết thí nghiệm thể hình 4.15 M5‐3 M5‐4         Hình 4.15 Kết nhuộm gram chủng vi khuẩn   43 4.6.5 Phản ứng Catalase Thử nghiệm Catalase thử nghiệm để xác định lồi vi khuẩn Sự có mặt Catalase tế bào vi khuẩn phụ thuộc vào môi trường dinh dưỡng điều kiện nuôi cấy chúng Thử nghiệm catalase với thuốc thử H2O2 3% chủng M5-3 M54 thấy xuất bọt khí, kết dương tính Kết thí nghiệm thể hình 4.16 Hình 4.16 Kết phản ứng Catalase chủng vi khuẩn Tổng hợp lại, đặc điểm hóa sinh chủng vi khuẩn nghiên cứu sau: Bảng 4.3 Một số đặc điểm hóa sinh hai chủng vi khuẩn nghiên cứu   Tên phản ứng Chủng M5-3 Chủng M5-4 Phản ứng MR + + Phản ứng citrate + + Khả di động + + Phản ứng Catalase + + Gram + + Tế bào Trực khuẩn Trực khuẩn 44 Dựa vào đặc điểm hình thái số đặc điểm hóa sinh, hai chủng M5-3 M5-4 chủng thuộc chi Bacillus Kết tương đồng với nghiên cứu phân lập vi khuẩn Bacillus Subtilis từ đất Sataputevà cộng (2012) [21]   45 Phần V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận - Đã phân lập 14 chủng vi khuẩn từ đống ủ trước trồng nấm, có chủng vi khuẩn chịu nhiệt độ cao - Chọn chủng vi khuẩn có khả sinh enzyme Cellulase mạnh M5-3 M5-4 với hoạt lực 69,57% 68,18% - Chủng M5-3 có hoạt độ tốt 72 30°C 24 50°C, pH=6, bổ sung chất cảm ứng D-Glucose nguồn N tối ưu cao nấm men - Chủng M5-4 có hoạt độ tốt 48 30°C 24 50°C, pH=7, bổ sung chất cảm ứng Fructose nguồn N tối ưu KNO3 - Dựa vào đặc điểm sinh lý sinh hóa chủng: Gram+, cho dương tính với phản ứng MR, Catalase, Citrate, thí nghiệm khả di động, bước đầu kết luận chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus 5.2 Kiến nghị - Thực định danh chủng vi khuẩn sinh học phân tử - Thử nghiệm sử dụng chủng vi khuẩn bổ sung vào đống ủ trồng nấm để xem xét tính khả thi - Nghiên cứu sử dụng chủng việc làm nước thải, công nghiệp giấy, …   46 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Cơng Phiên, 2012 Nấm - Dịng sản phẩm chủ lực Báo Sài Gịn Giải Phóng Đặng Thị Mai Phương (2010), Nghiên cứu tổng hợp cảm ứng pectinase số chủng Bacillus, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm TP.HCM, tr 24-33 Đặng Thị Thu Thảo(2011) Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn Lactic có khả kháng khuẩn từ sản phẩm thủy sản lên men Đinh Xuân Linh, Thân Đức Nhã, Nguyễn Hữu Đống, Nguyễn Thị Sơn, Nguyễn Duy Trình, Ngơ Xn Nghiễn (2012) Kỹ thuật trồng, chế biến Nấm ăn Nấm dược liệu, Nhà xuất Nông Nghiệp, Hà Nội Đồng Thị Thanh Thu (1998), Giáo trình sinh hố bản, tủ sách Đại học KHTN-ĐH Quốc gia TP.HCM Đồng Thị Thanh Thu (2003), Sinh hóa ứng dụng, tủ sách Đại học KHTN-ĐH Quốc gia TP.HCM Đường Hồng Dật (2002) Kỹ thuật trồng nấm mỡ, nấm rơm, nấm sò, nấm hương mộc nhĩ, Nhà xuất Hà Nội Nguyễn Hữu Chấn (1996), Enzyme xúc tác sinh học, NXB Y học , Hà Nội Nguyễn Lân Dũng (2004) Công nghệ nuôi trồng nấm, Tập (Tái lần thứ 2), Nhà xuất Nông Nghiệp, Hà Nội 10 Nguyễn Lân Dũng (2011).Giáo trình Vi sinh vật học 11 Nguyễn Thị Hoàng Hải (2009), Nghiên cứu thu nhận enzyme α – amylase từ trực khuẩn cỏ khô, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm TP.HCM, tr 4-8 12 Nguyễn Thị Huyền (2014) Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn ưa nhiệt phân lập từ đống ủ nguyên liệu trồng nấm 13 Nguyễn Thị Minh (2016) Nghiên cứu xử lý phế phụ phẩm trồng nấm làm giá thể hữu trồng rau an toàn 14 Nguyễn Thùy Dương(2012) Nghiên cứu tổng hợp cảm ứng cellulase số chủng Bacillus phân lập từ đất vườn Luận văn thạc sĩ 15 Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến (1998), Công nghệ enzyme, NXB Nông nghiệp TP.HCM Tài liệu nước 16 A.A Hussein, Saad H Khudhair, Melad K Mohammed (2017) Isolation and Sceening of Thermophilic Bacteria for Producing Cellulase Enzyme Using Agriculture Waste 17 Bulla J.A, Costilow R, Sappe E.S (1978), “Biology of Bacillus popippiae”, Adv Appl Microbiol 23: 1-18 18 Harunor Rashid Khan, Mohiuddin, Rahman, (2008).Enumeration, Isolation and Identification of Nitrogen-Fixing Bacterial Strains at Seedling Stage in Rhizosphere of Rice Grown in Non-Calcareous Grey Flood Plain Soil of Bangladesh   47 19 Magdi A.M Younis, Francis F.Hezayen, Moustafa (2010), Sciences Journal”, Microbiology and Biotechnology, 7(1), 31-37 “World Applied 20 Ponnuswany (2013) Isolation and characterization of green microalgae for carbon sequestration, waste water treatment and bio-fuel production 21 Satapute, P P., Olekar, H S., Shetti, A A., Kulkarni, A G., Hiremath, G B., Patagundi, B I., Shivsharan, C T and *Kaliwal, B Isolation and characterization of nitrogenfixing Bacillus Subtilis strain AS-4 from agriculture soil B Post Graduate Department of Biotechnology and Microbiology, Karnatak University, Dharwad- 580003 22 Sonia Sethi, Aparna Datta, B Lal Gupta, and Saksham Gupta (2013) Optimization of Cellulase Production from Bacteria Isolated from Soil Department of Biotechnology, Dr B Lal Institute of Biotechnology, Malviya Industrial Area, Malviya Nagar, Jaipur 302017, India 23 Stanier J Y, Ingraham J L, Wheellis M L, Paninter D, R (1990), General Microbiology, Macmilan Education Ltd Fith adition: 475 – 486 Tài liệu từ internet 24 Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 7538-1:2006 ISO 10381-1:2002 Chất lượng đất - Hướng dẫn lập chương trình lấy mẫu 25 docs.4share.vn/Resources/Flashs/1/45326.swf 26 https://cdn.vietnambiz.vn/171464876016439296/2021/1/20/bao-cao-thi-truong-gao-nam2020-16111472504561619634030.pdf 27 Streptomyces- Wikipedia tiếng Việt 28 https://vi.thpanorama.com/articles/biologa/saccharomyces-cerevisiae-caractersticasmorfologa-y-ciclo-de-vida.html 29 https://www.slideshare.net/pjgeon1990/trichoderma 30 https://vi.wikipedia.org/wiki/Ph%C3%A2n_compost 31 https://ktcn.vhu.edu.vn/vi/tin-moi-1/ung-dung-cua-enzyme-trong-doi-song 32 https://nguyenlieuhoaduoc.vn/ung-dung-cua-enzyme-amylase/ 33 https://biofix.com.vn/qua-trinh-u-hieu-khi-va-cac-yeu-to-anh-huong-den-qua-trinh-uhieu-khi/ 34 http://www1.vnua.edu.vn/tapchi/Upload/512017so%2011%20ban%20bong%205.7_10.pdf     48 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Ảnh hưởng thời gian đến hoạt độ enzyme Cellulase chủng vi khuẩn       Thời  gian  OD 540 nm  Chủng  M5‐3  M5‐4  M5‐3  M5‐4  M5‐3  M5‐4  M5‐3  M5‐4  Ngày 1  Ngày 2  Ngày 3  Ngày 4  Lặp 1  0,579 0,475 0,848 0,549 0,984 0,472 0,027 0,038 Lặp 2  0,568 0,481 0,861 0,567 1,002 0,457 0,039 0,047 Hoạt độ Cellulase(U/ml)  Lặp 3  0,569 0,482 0,856 0,571 0,992 0,459 0,038 0,048 Lặp 1  0,290 0,238 0,424 0,275 0,492 0,236 0,014 0,019 Lặp 2  0,284 0,241 0,431 0,284 0,501 0,229 0,020 0,024 Lặp 3  0,285 0,241 0,428 0,286 0,496 0,230 0,019 0,024 Trung  bình  0,677  0,571  1,000  0,666  1,157  0,552  0,064  0,075  Sai  số  0,003 0,002 0,003 0,006 0,005 0,004 0,003 0,003 Phụ lục 2: Ảnh hưởng pH đến hoạt độ enzyme Cellulase chủng vi khuẩn       PH  Chủng  M5‐3  5  M5‐4  M5‐3  6  M5‐4  M5‐3  7  M5‐4  M5‐3  8  M5‐4  M5‐3  9  M5‐4  M5‐3  10  M5‐4  M5‐3  11  M5‐4    OD 540 nm  Lặp 1  0,554  0,141  0,912  0,167  0,736  0,663  0,592  0,371  0,142  0,069  0,076  0,051  0,089  0,037  Lặp 2  0,571 0,152 0,841 0,148 0,719 0,641 0,586 0,362 0,154 0,052 0,087 0,065 0,074 0,058 Lặp 3  0,579 0,136 0,818 0,147 0,729 0,658 0,568 0,386 0,175 0,062 0,110 0,055 0,086 0,040 Hoạt độ Cellulase(U/ml)  Lặp 1  0,656 0,185 1,065 0,215 0,864 0,781 0,700 0,448 0,186 0,103 0,111 0,082 0,126 0,066 49 Lặp 2  0,676 0,198 0,984 0,193 0,845 0,756 0,693 0,437 0,200 0,084 0,123 0,098 0,109 0,090 Lặp 3  0,685 0,179 0,958 0,192 0,856 0,775 0,672 0,465 0,224 0,095 0,150 0,087 0,122 0,070 Trung bình  0,693  0,187  1,002  0,200  0,855  0,771  0,688  0,449  0,203  0,093  0,128  0,089  0,119  0,076  Sai  số  0,015 0,009 0,056 0,013 0,010 0,013 0,014 0,014 0,019 0,010 0,020 0,008 0,009 0,013 Phụ lục 3: Ảnh hưởng nguồn C đến hoạt độ enzyme Cellulase chủng vi khuẩn       OD 540 nm  Nguồn C  Chủng  Lặp 1  Lặp 2  Lặp 3  M5‐3  0,857  0,778  0,744  D‐ Gucose  M5‐4  0,667  0,628  0,653  M5‐3  0,555  0,586  0,594  CMC  M5‐4  0,445  0,407  0,401  M5‐3  0,402  0,406  0,385  Xylose  M5‐4  0,413  0,392  0,416  M5‐3  0,245  0,266  0,256  Lactose  M5‐4  0,165  0,176  0,127  M5‐3  0,283  0,237  0,236  Sucrose  M5‐4  0,183  0,204  0,201  M5‐3  0,166  0,196  0,187  Tinh bột  M5‐4  0,518  0,501  0,513  M5‐3  0,157  0,140  0,150  Sobitol  M5‐4  0,187  0,168  0,175  M5‐3  0,116  0,109  0,106  Fructose  M5‐4  0,631  0,676  0,688  Lặp 1  1,002  0,785  0,657  0,532  0,483  0,496  0,304  0,212  0,347  0,233  0,214  0,615  0,203  0,238  0,157  0,744  Hoạt độ Cellulase(U/ml)  Lặp 2  Lặp 3  Trung bình  0,912  0,873  0,929  0,741  0,769  0,765  0,693  0,702  0,684  0,489  0,482  0,501  0,487  0,464  0,478  0,472  0,499  0,489  0,328  0,316  0,316  0,225  0,169  0,202  0,295  0,294  0,312  0,257  0,254  0,248  0,248  0,237  0,233  0,596  0,610  0,607  0,184  0,195  0,194  0,216  0,224  0,226  0,148  0,145  0,15  0,796  0,809  0,783  Sai số  0,066 0,022 0,024 0,027 0,012 0,015 0,012 0,029 0,030 0,013 0,017 0,010 0,010 0,011 0,006 0,034 Phụ lục 4: Ảnh hưởng nguồn N đến hoạt độ enzyme Cellulase chủng vi khuẩn    Nguồn N  cao nấm  men     Chủng  M5‐3  M5‐4  OD 540 nm  Hoạt độ Cellulase(U/ml)  Lặp 1  Lặp 2  Lặp 3  Lặp 1  Lặp 2  Lặp 3  Trung bình  Sai số  1,754  1,854  1,623  2,026  2,140  1,876  2,014 0,132  0,953  0,885  0,961  1,112  1,034  1,121  1,089 0,048  NH4H2PO4 M5‐3  M5‐4  0,958  0,798  0,843  0,771  0,768  1,117  0,986  0,900  0,791  0,935  0,904  0,927  1,001 0,922 0,109  0,016  KNO3 M5‐3  M5‐4  M5‐3  M5‐4  0,803  1,750  0,655  1,662  0,824  1,719  0,665  1,745  0,820  1,731  0,704  1,696  0,960  1,999  0,827  1,959  0,955 2,002 0,794 1,965 0,012  0,018  0,029  0,047  NH4NO3 M5‐3  M5‐4  0,428  1,124  0,402  1,107  0,411  0,512  0,483  0,493  1,113  1,307  1,287  1,294  0,496 1,296 0,015  0,010  Na2SO4 M5‐3  M5‐4  M5‐3  M5‐4  0,349  0,733  0,092  1,325  0,203  0,742  0,113  1,374  0,023  0,693  0,123  1,373  0,243 0,849 0,149 1,573 0,186  0,030  0,018  0,032  NaNO3 NH4Cl   50 0,941  2,021  0,772  1,921  0,422  0,861  0,129  1,536  0,964  1,986  0,783  2,015  0,256  0,871  0,153  1,592  0,051  0,815  0,165  1,591  Phụ lục 5: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ enzyme Cellulase chủng vi khuẩn    Nhiệt độ  40°C  45°C  50°C  55°C       Chủng  M5‐3  M5‐4  M5‐3  M5‐4  M5‐3  M5‐4  M5‐3  M5‐4  OD 540 nm  Lặp 1  Lặp 2  Lặp 3  0,950 0,831 0,746 0,664 0,622 0,656 0,959 0,976 0,961 0,814 0,769 0,756 1,344 1,358 1,357 1,172 1,193 1,184 0,401 0,387 0,386 0,202 0,187 0,197 Hoạt độ Cellulase(U/ml)  Lặp 1  Lặp 2  Lặp 3  Trung bình  1,108 0,972 0,875 0,985  0,782 0,734 0,773 0,763  1,119 1,138 1,121 1,126  0,953 0,902 0,887 0,914  1,558 1,574 1,572 1,568  1,361 1,386 1,375 1,374  0,482 0,466 0,465 0,471  0,255 0,237 0,249 0,247  51 Sai số 0,117  0,026  0,010  0,035  0,009  0,013  0,010  0,009