Bước đầu nghiên cứu enzyme xylanolytic và cellulolytic từ một chủng vi khuẩn ưa nhiệt

Bước đầu nghiên cứu enzyme xylanolytic và cellulolytic từ một chủng vi khuẩn ưa nhiệt Bước đầu nghiên cứu enzyme xylanolytic và cellulolytic từ một chủng vi khuẩn ưa nhiệt Bước đầu nghiên cứu enzyme xylanolytic và cellulolytic từ một chủng vi khuẩn ưa nhiệt Bước đầu nghiên cứu enzyme xylanolytic và cellulolytic từ một chủng vi khuẩn ưa nhiệt Bước đầu nghiên cứu enzyme xylanolytic và cellulolytic từ một chủng vi khuẩn ưa nhiệt Bước đầu nghiên cứu enzyme xylanolytic và cellulolytic từ một chủng vi khuẩn ưa nhiệt Bước đầu nghiên cứu enzyme xylanolytic và cellulolytic từ một chủng vi khuẩn ưa nhiệt Bước đầu nghiên cứu enzyme xylanolytic và cellulolytic từ một chủng vi khuẩn ưa nhiệt Bước đầu nghiên cứu enzyme xylanolytic và cellulolytic từ một chủng vi khuẩn ưa nhiệt

MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cấu trúc lignocellulose 1.1.1 Cấu trúc thành tế bào thực vật 1.1.2 Cellulose 1.1.3 Lignin 11 1.1.4 Hemicellulose 15 1.2 Enzyme thủy phân lignocellulose 17 1.2.1 Enzyme cellulolytic 18 1.2.2 Enzyme xylanolytic 20 1.3 Ứng dụng enzyme lignocellulolytic 22 CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 24 2.1 Nguyên liệu 24 2.1.1 Mẫu đất 24 2.1.2 Hóa chất 24 2.1.3 Thiết bị 24 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 24 2.2.1 Sàng lọc phân lập vi khuẩn kị khí xylanolytic-cellulolytic ƣa nhiệt 24 2.2.2 Nhận dạng chủng vi khuẩn kị khí xylanolytic-cellulolytic ƣa nhiệt 25 2.2.2.1 Kiểm tra hình thái tế bào vi khuẩn 25 2.2.2.2 Tách chiết ADN tổng số 25 2.2.2.3 Định lƣợng ADN cách đo độ hấp thụ tử ngoại bƣớc sóng 260 nm 280 nm 26 2.2.2.4 PCR nhân đoạn gen mã hóa cho ARN ribosome 16S 27 2.2.2.5 Gắn sản phẩm PCR vào vector p-GEM T 27 2.2.2.6 Tách ADN plasmid từ vi khuẩn E.coli DH5α 28 2.2.2.7 Đọc trình tự đoạn gen mã hóa cho ARN ribosome 16S 29 2.2.3 Thu nhận chế phẩm enzyme 30 2.2.4 Xác định hoạt độ enzyme 31 2.2.4.1 Xác định hoạt độ enzyme 31 2.2.4.2 Ảnh hƣởng pH hoạt độ độ bền enzyme 33 2.2.4.3 Ảnh hƣởng nhiệt độ hoạt độ độ bền enzyme 33 2.2.5 Xác định protein 33 2.2.6 Thủy phân chất lignocellulose 33 2.2.7 Tách phức hệ multienzyme từ dịch lỏng môi trƣờng nuôi cấy 33 2.2.8 Điện di gel kỹ thuật zymogram 34 2.2.9 Sắc ký mỏng (TLC) 34 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Sàng lọc phân lập vi khuẩn kị khí xylanolytic-cellulolytic ƣa nhiệt 35 3.1.1 Sàng lọc vi khuẩn ƣa nhiệt kỵ khí môi trƣờng làm giàu nuôi cấy nhiệt độ cao 35 3.1.2 Sàng lọc chủng vi khuẩn có hoạt tính xylanolytic-cellulolytic 39 3.2 Kết nhận dạng vi khuẩn kị khí xylanolytic-cellulolytic ƣa nhiệt 40 3.2.1 Xác định hình thái tế bào vi khuẩn 40 3.2.2 Nhận dạng vi khuẩn đọc trình tự đoạn gen mã hóa cho ARN ribosome 16S 41 3.2.2.1 Tách chiết ADN hệ gen chủng vi khuẩn NKP13 41 3.2.2.2 Nhân đoạn gen mã hóa cho ARN ribosome 16S chủng vi khuẩn NKP13 PCR 42 3.2.2.3 Nhân dòng gen mã hóa cho ARN ribosome 16S chủng vi khuẩn NKP13 vào vector p-GEM T 44 3.2.2.4 Giải trình tự gen mã hóa cho ARN ribosome 16S chủng vi khuẩn NKP13… 47 3.3 Nghiên cứu phức hệ enzyme xylanolytic-cellulolytic chủng NKP13 49 3.3.1 Khả sinh tổng hợp xylase CMCase 49 3.3.2 Ảnh hƣởng pH lên hoạt độ xylanase CMCase 51 3.3.2.1 pH phản ứng tối ƣu 51 3.3.2.2 Độ bền pH 52 3.3.3 Ảnh hƣởng nhiệt độ lên hoạt độ enzyme xylanase CMCase độ bền nhiệt enzyme 53 3.3.3.1 Nhiệt độ phản ứng tối ƣu 53 3.3.3.2 Độ bền nhiệt 53 3.3.4 Khả thủy phân nguyên liệu lignocellulose enzyme 54 3.3.5 Điện di chế phẩm enzyme gel polyacrylamide có SDS 56 KẾT LUẬN 58 KIẾN NGHỊ 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 MỞ ĐẦU Cùng với phát triển nông nghiệp, hàng năm hàng triệu chất lignocellulose bắt nguồn từ hoạt động nông nghiệp, đƣợc thải môi trƣờng Điều không làm tăng thêm gánh nặng môi trƣờng mà làm lãng phí nguồn sinh khối, cần phải thực nghiêm ngặt tiêu chuẩn việc thải chất thải vào môi trƣờng Các phƣơng pháp xử lý hóa học sinh học thông thƣờng ngày khó đạt đƣợc mức độ cần thiết để loại bỏ chất ô nhiễm Vì cần phải triển khai biện pháp xử lý cho vừa nhanh hơn, rẻ hơn, hiệu hơn, đáng tin cậy vừa đem lại lợi ích kinh tế Ngày nay, với phát triển khoa học kỹ thuật, công nghệ sinh học đƣợc ứng dụng rộng rãi xử lý chất thải nông nghiệp Thế hệ nhiên liệu sinh học dựa đƣờng, tinh bột dầu thực vật, nhiên chƣa thực có đƣợc ứng dụng rộng rãi công nghiệp Lignocellulose đƣợc xem hệ nhiên liệu sinh học thứ hai Đối với môi trƣờng ngành kinh tế, chất thải lignocellulose đƣợc sử dụng nhƣ nguồn nguyên liệu để sản xuất chất hóa học, nhiên liệu vật chất tƣơng hợp khác Bên cạnh đó, nguồn nguyên liệu đƣợc đặc biệt quan tâm giá thành thấp nguồn cung cấp dồi Quá trình biến đổi sinh học chất thải thành nhiên liệu mang đến lợi nhuận kinh tế nhƣ môi trƣờng [1] Lignocellulose (sinh khối thực vật) bao gồm polysaccharide chủ yếu cellulose, hemicellulose (xylan) lignin, cellulose hemicellulose chiếm tỉ lệ cao Cellulose chiếm phần lớn, khoảng từ 35% đến 50% khối lƣợng khô thực vật, hai hợp chất, hemicellulose lignin lần lƣợt chiếm khoảng 20-30% 5-20% khối lƣợng khô thể thực vật [23] Với tính sẵn có lignocellulose trở thành nguồn lƣợng tái tạo dồi [36] Nhiều nghiên cứu chứng minh khả triển vọng sử dụng enzyme vào việc biến đổi sinh học chất thải lignocellulose để tạo đƣờng đơn hữu ích từ phế phụ liệu chứa lignocellulose [3] Nhằm thu đƣợc enzyme có hoạt tính thủy phân lignocellulose hiệu thành đƣờng đơn đƣờng đôi từ phế phụ liệu nông nghiệp, để từ đƣa vào ứng dụng rộng rãi sản xuất sản phẩm có giá trị đời sống ngƣời, thực đề tài: “ Bước đầu nghiên cứu enzyme xylanolytic cellulolytic từ chủng vi khuẩn ưa nhiệt” CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cấu trúc lignocellulose 1.1.1 Cấu trúc thành tế bào thực vật Trong tự nhiên, lớp thành tế bào thực vật đƣợc minh họa mô hình gỗ (Hình 1.1) Ở tế bào, có hợp chất đóng vai trò nhƣ keo dán gắn kết tế bào lại với nhau, lớp gian bào (middle lamella) Lớp cấu tạo từ chất keo, có chất pectin tác động quang học Bên thành tế bào sơ cấp (primary wall) Hình 1.1: Cấu trúc thành tế bào thực vật [37] Thành tế bào sơ cấp đƣợc chia thành mặt bên mặt bên Sự xếp vi sợi thành tế bào sơ cấp phân tán tăng dần từ mặt mặt Tiếp đến thành tế bào thứ cấp gồm lớp: lớp (S1), lớp (S2) lớp (S3) Sự phân chia thành tế bào thứ cấp thành ba lớp S chủ yếu định hƣớng khác vi sợi ba lớp Điển hình vi sợi định hƣớng xoắn vách tế bào Lớp thành tế bào thứ cấp, vi sợi đƣợc định hƣớng cấu trúc xoắn chéo có độ nghiêng tạo thành góc lớn với trục dọc tế bào Lớp lớp dày lớp có góc nhỏ độ nghiêng sợi xoắn ốc vi sợi lớp đƣợc xếp nhƣ lớp ngoài, với góc rộng với trục dọc tế bào Ngoài số trƣờng hợp, mặt thành tế bào có lớp sần sùi (W) Chức thành tế bào chống đỡ cho quan đặc biệt vách dày cứng Thành tế bào giữ chức quan trọng nhƣ hấp thụ, thoát nƣớc hay vận chuyển tiết Lignocellulose thành phần triển điều kiện khác Thành cấu trúc thực vật thân gỗ phần lignocellulose đƣợc trình bày thực vật khác nhƣ cỏ, lúa, bảng 1.1 [9] ngô…Trong tự nhiên, tìm thấy lignocellulose thực vật hay chất thải nông nghiệp, lâm nghiệp chất thải rắn thành phố Thành phần chủ yếu lignocellulose cellulose, hemicellulose lignin (Hình 1.2) Cellulose hemicellulose đại phân tử cấu tạo từ gốc đƣờng khác nhau, lignin polymer dạng vòng đƣợc tổng hợp từ tiền phenylpropanoid Thành phần cấu tạo phần trăm polymer khác loài Hơn nữa, thành phần cấu tạo hay khác khác dựa vào Hình 1.2: Thành phần chủ yếu độ tuổi, giai đoạn sinh trƣởng, phát lignocellulose Bảng 1.1: Thành phần lignocellulose rác thải phế phụ liệu nông nghiệp phổ biến [9] Nguồn lignocellulose Cellulose (%) Hemicellulose (%) Lignin (%) Thân gỗ cứng 40-55 24-40 18-25 Thân gỗ mềm 45-50 25-35 25-35 Vỏ lạc 25-30 25-30 30-40 Lõi ngô 45 35 15 Giấy 85-99 0-15 Vỏ trấu 32.1 24 18 Vỏ trấu lúa mì 30 50 15 Rác phân loại 60 20 20 Lá 15-20 80-85 Hạt 80-95 5-20 Giấy báo 40-55 25-40 18-30 Giấy thải từ bột giấy hóa học 60-70 10-20 5-10 Chất rắn nƣớc thải ban đầu 8-15 - 24-29 Chất thải lợn 28 - Phân bón gia súc 1.6-4.7 1.4-3.3 2.7-5.7 Cỏ bờ biển Bermuda 25 35.7 6.4 Cỏ mềm 45 31.4 12.0 Các loại cỏ (trị số trung bình cho loại) 25-40 25-50 10-30 Bã thô 33.4 30 18.9 Lƣợng lớn lignocellulose đƣợc thải từ ngành lâm nghiệp, nông nghiệp, công nghiệp giấy gây ô nhiễm môi trƣờng Tuy nhiên, lƣợng lớn sinh khối thực vật dƣ thừa đƣợc coi rác thải đƣợc biến đổi thành nhiều sản phẩm có giá trị khác nhƣ nhiên liệu sinh học, hóa chất, nguồn lƣợng rẻ cho trình lên men, bổ sung chất dinh dƣỡng cho ngƣời thức ăn cho động vật [15] 1.1.2 Cellulose Cellulose hợp chất hữu có công thức cấu tạo (C6H10O5)n, thành phần chủ yếu thành tế bào thực vật, gồm nhiều cellobiose liên kết với nhau, 4-O- (β-DGlucopyranosyl)-D-glucopyranose (Hình 1.3) Cellulose hợp chất hữu nhiều sinh quyển, hàng năm thực vật tổng hợp đƣợc khoảng 1011 cellulose (trong gỗ, cellulose chiếm khoảng 50% chiếm khoảng 90%) Hình 1.3: Công thức hóa học cellulose Các mạch cellulose đƣợc liên kết với nhờ liên kết hydro liên kết van Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc tinh thể vô định hình Trong vùng tinh thể, phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, vùng khó bị công enzyme nhƣ hóa chất Ngƣợc lại, vùng vô định hình, cellulose liên kết không chặt với nên dễ bị công [40] Có hai mô hình cấu trúc cellulose đƣợc đƣa nhằm mô tả vùng tinh thể vô định hình nhƣ hình 1.4 [29] Hình 1.4: Mô hình Fringed fibrillar mô hình chuỗi gập Trong mô hình Fringed Fibrillar: phân tử cellulose đƣợc kéo thẳng định hƣớng theo chiều sợi Vùng tinh thể có chiều dài 500 Å xếp xen kẽ với vùng vô định hình Trong mô hình chuỗi gập: phân tử cellulose gấp khúc theo chiều sợi Mỗi đơn vị lặp lại có độ trùng hợp khoảng 1000, giới hạn hai điểm a b nhƣ hình vẽ Các đơn vị đƣợc xếp thành chuỗi nhờ vào mạch glucose nhỏ, vị trí dễ bị thủy phân Đối với đơn vị lặp lại, hai đầu vùng vô định hình, vào giữa, tính chất kết tinh cao Trong vùng vô định hình, liên kết β - glycoside monomer bị thay đổi góc liên kết, cuối đoạn gấp, phân tử monomer xếp tạo thay đổi 180o cho toàn mạch Vùng vô định hình dễ bị công tác nhân thủy phân vùng tinh thể thay đổi góc liên kết liên kết cộng hóa trị (β - glycoside) làm giảm độ bền liên kết, đồng thời vị trí không tạo đƣợc liên kết hydro [2] Cellulose có cấu tạo tƣơng tự carbohydrate phức tạp nhƣ tinh bột glycogen Các polysaccharide đƣợc cấu tạo từ đơn phân glucose Cellulose glucan không phân nhánh, gốc glucose kết hợp với qua liên kết β- 10 48 Chúng nhận thấy trình tự đoạn gen mã hóa cho ARN ribosome 16S chủng NKP13 có 98% giống với đoạn gen mã hóa cho ARN ribosome 16S vi khuẩn Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum HM585225 công bố ngân hàng gen giới (Hình 3.10) Hình 3.10: Cây phân loại chủng Thermoanaerobacterium 3.3 Nghiên cứu phức hệ enzyme xylanolytic-cellulolytic chủng NKP13 3.3.1 Khả sinh tổng hợp xylase CMCase Để đánh giá khả sinh tổng hợp enzyme xylase CMCase theo thời gian, chủng NKP13 đƣợc nuôi cấy môi trƣờng BM 60oC, lắc 200 vòng/phút Dịch enzyme đƣợc thu thời gian khác (từ đến ngày) để xác định hoạt độ enzyme Trong trình sinh trƣởng chủng vi khuẩn, enzyme xylanase cellulase ngoại bào tăng giải phóng enzyme từ tế bào vào môi trƣờng nuôi cấy Kết phân tích (Hình 3.11) cho thấy, hoạt độ enzyme CMCase cao hoạt độ enzyme xylanase, điều khả liên kết với tế bào xylanase mạnh CMCase Sau ngày hoạt độ enzyme tăng nhanh Hoạt độ xylanase đạt 30 49 U/l hoạt độ CMCase đạt 43 U/l Sau hoạt độ enzyme tăng chậm ngày hoạt độ enzyme đạt tối đa (xylanase: 47 U/l; CMCase: 58 U/l) Sau ngày hoạt độ enzyme giảm dần Nhƣ vậy, thời gian thích hợp cho chủng 70 3.5 60 50 2.5 40 30 1.5 20 10 0.5 Protein đường khử (g/l) Hoạt tính xylanase CMCase (U/l) NKP13 sinh tổng hợp xylanase CMCase ngày 0 Thời gian nuôi cấy (ngày) Xylanase CMCase Protein Đƣờng khử Hình 3.11: Khả sinh tổng hợp xylanase, cellulase, protein đƣờng khử chủng NKP13 nuôi cấy điều kiện kỵ khí với vỏ ngô nguồn chất Trong thời gian, nồng độ protein môi trƣờng nuôi cấy tăng với sinh trƣởng vi khuẩn Quá trình sản sinh enzyme xylanase cellulase liên quan tới nồng độ protein môi trƣờng nuôi cấy Lƣợng đƣờng khử đƣợc giải phóng môi trƣờng tăng lên tới khoảng 0,3 g/l ngày nuôi cấy thứ theo trình sinh trƣởng vi khuẩn Tuy nhiên, sau ngày nuôi cấy, lƣợng đƣờng giảm nhẹ, đến ngày thứ lƣợng đƣờng khử lại khoảng 0,15 g/l (Hình 3.11), điều lƣợng đƣờng đƣợc chủng vi khuẩn sử dụng để tiếp tục tăng trƣởng Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn với vỏ ngô làm chất sau ngày đƣợc đem ly tâm thu dịch tủa để xác định khả sinh tổng hợp hệ enzyme xylanolytic cellulolytic Kết cho thấy, chủng NKP13 có khả sinh hệ enzyme xylanolytic 50 cellulolytic Do đó, hệ enzyme không thủy phân đƣợc vỏ ngô mà thủy phân đƣợc nhiều chất khác Bảng 3.3: Hoạt tính enzyme dịch enzyme thô chủng vi khuẩn NKP13 sản sinh mọc môi trường chứa vỏ ngô Hoạt độ enzyme/ protein tổng số (U/g protein) 16,25 4,21 1,63 0,018 Hệ enzyme xylanolytic Xylanase Arabinofuranosidase β-xylosidase Acetyl esterase Hoạt độ enzyme/ protein tổng số (U/g protein) 20,16 0,19 1,18 0,067 Hệ enzyme cellulolytic CMCase Avicelase β-glycosidase Cellobiohydrolase 3.3.2 Ảnh hưởng pH lên hoạt độ xylanase CMCase 3.3.2.1 pH phản ứng tối ưu pH môi trƣờng có ảnh hƣởng lớn tới hoạt tính xúc tác enzyme, ảnh hƣởng tới mức độ ion hóa chất, enzyme ảnh hƣởng tới độ bền enzyme Để khảo sát pH tối ƣu enzyme xylanase CMCase, phản ứng enzyme với chất CMC (đối với enzyme CMCase) chất xylan lúa mạch (đối với enzyme xylanase) Cơ chất đƣợc pha đệm có pH khác từ pH đến pH 50oC sau phút ủ Hoạt tính tương đối (%) 100 80 60 40 20 pH Xylanase Hình 3.12: Ảnh hƣởng độ pH hoạt tính enzyme 51 Hoạt độ xylanase đạt cực đại pH tƣơng đối cao pH (hoạt độ enzyme đạt đƣợc 90%) Còn hoạt độ CMCase đạt cực đại pH giảm nhẹ pH (93%) pH hoạt độ enzyme đạt đƣợc 70% (Hình 3.12) 3.3.2.2 Độ bền pH pH ảnh hƣởng tới độ bền enzyme, nên việc lựa chọn pH thích hợp để bảo quản enzyme quan trọng Tùy loại protein enzyme mà có độ bền môi trƣờng pH định Ở độ bền enzyme xylanase CMCase đƣợc khảo sát đệm khác với dải pH từ pH đến pH 100 Hoạt tính tương đối (%) 90 80 70 60 50 40 30 20 10 pH Xylanase CMCase Hình 3.13: Ảnh hƣởng độ pH đến độ bền enzyme Kết cho thấy sau 30 phút ủ, có pH hoạt độ tƣơng đối enzyme xylanase CMCase đạt cực đại Ở pH riêng hoạt độ xylanase giữ đƣợc 90%, pH lại giảm mạnh loại enzyme, giảm mạnh pH trở lên, hoạt độ enzyme lại khoảng 35% Nhƣ vậy, xylanase CMCase chủng NKP13 bền pH sau 30 phút ủ (Hình 3.13) 52 3.3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt độ enzyme xylanase CMCase độ bền nhiệt enzyme 3.3.3.1 Nhiệt độ phản ứng tối ưu Nhiệt độ phản ứng ảnh hƣởng mạnh tới tốc độ xúc tác thủy phân chất enzyme Mỗi enzyme có nhiệt độ phản ứng thích hợp Để nghiên cứu nhiệt độ enzyme tối ƣu xylanase CMCase, dịch enzyme tinh chất xylan lúa mạch (đối với xylanase) CMC (đối với CMCase) đƣợc ủ nhiệt độ khác từ 40oC đến 90oC, pH phút Hoạt tính tương đối (%) 100 80 60 40 20 40 50 60 70 80 90 Nhiệt độ (oC) Xylanase CMCase Hình 3.14: Ảnh hƣởng nhiệt độ hoạt tính enzyme Hoạt độ enzyme tăng dần khoảng từ 10-100% dải nhiệt độ từ 40-70oC đạt tối đa 70oC Khi nhiệt độ tiếp tục tăng hoạt độ enzyme giảm dần, đạt 61% 80oC; 20% 90oC enzyme CMCase 23% 80oC; 10% 90oC enzyme xylanase (Hình 3.14) 3.3.3.2 Độ bền nhiệt Dƣới tác động nhiệt độ, enzyme bị biến tính nhiều bị ảnh hƣởng tới hoạt tính Một số liên kết hydro tham gia vào giữ vững cấu trúc trung tâm hoạt động enzyme bị đứt gãy nhiệt độ Mức độ ảnh hƣởng tùy thuộc vào thời gian 53 nhiệt độ ủ enzyme Dịch enzyme tinh đƣợc ủ nhiệt độ khác (40oC đến 90oC) 30 phút ủ Hoạt tính tương đối (%) 100 80 60 40 20 40 50 60 70 Nhiệt độ (oC) Xylanase 80 90 CMCase Hình 3.15: Ảnh hƣởng nhiệt độ độ bền enzyme Kết thu đƣợc hình 3.15 cho thấy, xylanase trì gần 100% hoạt độ 60oC, sau hoạt độ enzyme giảm dần nhiệt độ tăng Còn hoạt độ CMCase gần 100% hoạt độ 50oC, hoạt độ enzyme giảm dần 73% nhiệt độ tăng lên 60oC Hoạt độ enzyme hoàn toàn bị xử lý 90oC (Hình 3.14) Với kết thu đƣợc thấy rằng, enzyme xylanase CMCase chủng vi khuẩn NKP13 bền với nhiệt Một số nghiên cứu cho biết vài enzyme cellulase từ vi khuẩn chịu nhiệt khác nhƣ C Thermocellum [21,28] loài Thermoactinomyces [13] với nhiệt độ tối ƣu 70oC Các enzyme chịu nhiệt có đặc tính có lợi cho ứng dụng lĩnh vực chế biến số ứng dụng công nghệ sinh học khác 3.3.4 Khả thủy phân nguyên liệu lignocellulose enzyme Lignocellulose nguồn nguyên liệu thô dồi tái tạo đƣợc sẵn có Tuy vậy, polymer cần đƣợc biến đổi thành đƣờng đơn giản thông qua trình thủy phân Quá trình thủy phân làm thay đổi đặc tính lignocelluloses, đƣa chúng dạng dễ xử lý chuyển thành sản phẩm có giá trị Phƣơng pháp đƣợc ứng dụng nhiều thủy phân hóa học thủy phân enzyme 54 Ngày nay, phƣơng pháp thủy phân enzyme đƣợc ứng dụng rộng rãi, có hiệu kinh tế Chính muốn khảo sát khả thủy phân lignocellulose hệ enzyme xylanolytic-cellulolytic Ba loại lignocellulose đƣợc dùng nghiên cứu là: vỏ ngô, lõi ngô bã mía Cả ba loại lignocellulose đƣợc thủy phân môi trƣờng đệm phosphate trung tính 50oC Sản phẩm thủy phân thu vào khoảng thời gian khác nhau: 10 phút; 20 phút; 30 phút; 40 phút; 50 phút; 60 phút đƣợc xác định thông qua lƣợng đƣờng khử đƣợc giải phóng môi trƣờng nuôi cấy Kết thu đƣợc hình 3.16 cho thấy, NKP13 sản sinh enzyme thủy phân đƣợc ba loại lignocellulose, khả phân hủy vỏ ngô enzyme cao (lƣợng đƣờng khử = 52,0 mg/l) sau nuôi cấy, tiếp đến enzyme thủy phân đƣợc bã mía (45 mg/l) lõi ngô (23 mg/l) Qua đó, kết luận enzyme NPK13 tạo có khả thủy phân cellulose hemicellulose có hợp chất lignocellulose 60 Đường khử (mg/l) 50 40 30 20 10 0 10 20 30 40 50 60 Thời gian nuôi cấy (phút) Vỏ ngô Bã mía Lõi ngô Hình 3.16: Quá trình thủy phân lignocellulose enzyme chủng NKP13 50oC Tiếp theo, chọn sản phẩm thủy phân từ vỏ ngô đem phân tích phƣơng pháp sắc ký mỏng (TLC) để xác định số lƣợng đƣờng từ enzyme thủy phân 55 G1 X1 G2 X2 xylooligosaccharide Hình 3.17: Kết sắc ký mỏng sản phẩm thủy phân vỏ ngô enzyme chủng vi khuẩn NKP13 Trong đó: Cột 1: Thang chuẩn glucose (G1) cellobiose (G2) Cột 2: Thang chuẩn xylose (X1), xylobiose (X2) xylooligosaccharide Cột 3: Sản phẩm thủy phân vỏ ngô enzyme Kết sắc ký mỏng cho thấy enzyme chủng vi khuẩn NKP13 có khả thủy phân phế thải nông nghiệp thành loại đƣờng đơn giản nhƣ đƣờng xylose, xylobiose đƣờng xylooligosaccharide (Hình 3.17) Các loại đƣờng đƣợc sử dụng để sản xuất sản phẩm có giá trị nhƣ ethanol, thức ăn cho động vật chất dinh dƣỡng cho ngƣời 3.3.5 Điện di chế phẩm enzyme gel polyacrylamide có SDS Thành phần protein phức hệ enzyme tách chiết từ dịch enzyme thô đƣợc phân tích điện di native-PAGE, SDS-PAGE zymogram Trong đó, có sử dụng xylan hòa tan CMC làm chất để xác định hoạt độ enzyme phân đoạn chế phẩm Kết điện di native-PAGE kiểm tra enzyme đƣợc tách chiết (Hình 3.18A, cột 2) cho thấy có băng với khối lƣợng phân tử cao Hơn nữa, qua trình chạy điện di SDS-PAGE protein có gắn cellulose đƣa 10 băng với kích thƣớc từ 44 đến 225 kDa (Hình 3.18B, cột 2), zymogram xác định enzyme xylanase CMCase enzyme thu đƣợc gồm xylanase 56 (Hình 3.18C, cột 3) CMCase (Hình 3.18C, cột 4) Kết cho thấy enzyme đƣợc sản sinh chủng vi khuẩn NKP13 phức hệ enzyme 2 M 225 185 137 125 97 84 72 64 50 kDa 225 225 185 137 150 125 97 100 84 72 75 64 50 225 185 137 125 97 84 64 50 44 35 25 A B C Hình 3.18: Kết phân tích protein enzyme đƣợc tách chiết từ dịch thô điện di native-PAGE (A), SDS-PAGE (B) Zymogram enzyme xylanase CMCase (C) Trong đó, Cột 1: enzyme thô; Cột 2: Protein liên kết cellulose; Cột 3: Xylanase; Cột 4: CMCase; Cột M: Marker tiêu chuẩn Chủng vi khuẩn NKP13 sản xuất hệ thống enzyme xylanolytic-cellulolytic ngoại bào gồm enzyme xylanase enzyme CMCase mọc môi trƣờng có vỏ ngô làm chất Các enzyme đƣợc xếp phức hệ enzyme mà thủy phân chất thải lignocellulose chúng có khả kết dính vào cellulose xylan thông qua vị trí gắn cellulose xylan [5,30] Dạng phức hệ enzyme cellulase xylanase hoạt động tƣơng tác lẫn suốt trình thủy phân hợp chất không tan Hơn nữa, số tài liệu tham khảo đề cập dựa vào nhân tố kết dính cellulose xylan mà số vi sinh vật sản sinh phức hệ enzyme xylanolytic-cellulolyitc thủy phân chất thải lignocellulose cách hiệu nhƣ C thermocellum, C cellulovorans [6,27] 57 KẾT LUẬN Từ kết thu đƣợc trình nghiên cứu nêu trên, rút số kết luận nhƣ sau: Đã phân lập đƣợc số chủng vi khuẩn, có chủng NKP13 có khả phân giải lignocellulose từ 34 mẫu vi khuẩn thu thập đƣợc Đoạn gen mã hóa cho ARNr 16S NKP13 đƣợc nhân lên PCR, nhân dòng, xác định trình tự nucleotide cho thấy tƣơng đồng tới 98% so với trình tự đoạn gen tƣơng ứng từ loài vi khuẩn Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum HM585225 đƣợc công bố ngân hàng gen giới Chủng vi khuẩn NKP13 sinh trƣởng đƣợc môi trƣờng có chất vỏ ngô điều kiện kỵ khí có khả sinh enzyme xylanolytic CMCase Sản phẩm thủy phân vỏ ngô enzyme đƣờng xylose, xylobiose xylooligosaccharide Đã phát thấy 10 băng protein khác chế phẩm enzyme xylanolytic cellulolytic NKP13 phân tích điện di gel polyacrylamide có SDS, dùng zymogram phát thấy có mặt băng xylanase băng CMCase chế phẩm KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu khả sử dụng phức hệ enzyme phân giải lignocellulose chủng NKP13 công nghiệp xử lý phế phụ liệu nông nghiệp 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO I.TÀI LIỆU TRONG NƯỚC Vũ Thị Minh Đức (2001) Thực tập Vi sinh vật học Nhà xuất ĐHQGHN Nguyễn Đức Lƣợng, Công nghệ enzyme, Nhà xuất Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, 2001 Trần Đình Toại, Trần Thị Hồng (2007),”Tƣơng lai ứng dụng Enzyme xử lý phế thải”, Tạp chí Khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội, Khoa học Tự nhiên Công nghệ 23: 75-85 II TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI Baipai P (1997).“Microbial xylanolytic enzyme system: Properties and applications” Adv Appl Microbiol 43: 141-194 Bayer E.A., Morag E., and Lamed R (1994).“The cellulosome: a treasure trove for biotechnology” Trends Biotechnol 12: 379-386 Bayer E.A., Kenig R., Lamed R (1983).”Adherence of Clostridium thermocellum to cellulose” J Bacteriol 156: 818-827 Beily P (1985) “Microbial xylanolytic systems” Trends Biotechnol., 3: 286-290 Beltrame P.L., Carnitti P., Focher B (1984).” Enzymatic hydrolysis of cellulosic materials: a kinetic study” Biotechnol Bioeng 31:160-167 Betts W.B., Dart R.K., Ball A.S., Pedlar S.L (1991).“Biosynthesis and Structure of lignocellulose” In Betts (eds) Biodegradation: Natural and Synthetic Materials Springer-Verlag, Berlin, Germany: 139-155 10 Collins T., Gerday C., Feller G (2005).“Xylanases, xylanase families and extremophilic xylanases” FEMS Microbiol Rev., 29:3-23 11 Coughlan M.P and Hazlewood G.P (1993),“B-1,4-d-xylan degrading enzyme systems: Biochemistry, molecular biology and applications”, Biotechnol Appl Biochem 17: 259-289 59 12 Elberson M.A., Malekzadeh F., Yazdi M.T., Kameranpour N., Noori-Daloii M.R., Matte M.H., Shahamat M., Colwell R.R., Sowers K.R (2000) “Cellulomonas persica sp nov and Cellulomonas iranensis sp nov., mesophilic cellulose-degrading bacteria isolated from forest soils” J Syst Evol Microbiol :993 13 Hagerdal B.G.R., Ferchak J.D., Pye E.K and Forro J.R (1979) “The cellulolytic enzyme system of Thermoactinomyces in hydrolysis of cellulose: mechanisms of enzymatic and acid catalysis”, Adv Chem Ser 181:331-345 14 Higuchi T (1978) “Lignin structure and morphological distribution in plant cell walls”, in Lignin Biodegradation: Microbiology, Chemistry, and Potential Applications Vol 1, CRC Press Inc., Boca Raton: 1-17 15 Howard R.L., Abotsi E., Jansen van Rensburg and Howard S (2003) “Lignocellulose biotechnology: issues of bioconversion and enzyme production” African Journal of Biotechnology, 2: 602 – 619 16 Kohring S., Weigel J., and Mayer F (1990) “Subunit composition and glycosidic activities of the cellulase complex from Clostridium thermocellum JW20” Appl Environ Microbiol 56: 3798-3804 17 Kubata B.K., Suzuki T., Horitsu H., Kawai K., and Takamizawa K (1994) “Purification and characterization of Aeromonas caviae ME-1 xylanase V, which produces exclusively xylobiose from xylan”, Appl Environ Microbiol 60: 531-535 18 Kyu K.L., Ratanakhanokchai K., Uttapap D and Tanticharoen M (1994) “Induction of xylanase in Bacillus circulans B6” Biores Technol 48: 163-167 19 Laemmli U.K (1970) “Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4” Nature (London) 227:680–685 20 Lee S.F., Forsberg C.W and Rattray J.B (1987) “Purification and characterization of two endoxylanases from Clostridium acetobytylicum ATCC 824”, Appl Environ Microbiol., 53: 644-650 60 21 Lee B.H., and Blackburn T.H (1975) “Cellulase production by a thermophilic Clostridium species” Appl Microbiol 30:346-353 22 Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L and Randall R J (1951) “Protein measurement with the Folin phenol reagent” J Biol Chem 193:265–275 23 Lynd L.R., Cushman J.H., Nichols R.J., and Wyman C.E (1991) “Fuel ethanol from cellulosic biomass”, Science 251: 1318-1323 24 Lynd L.R., Weimer P.J., Zyl van W.H and Pretorius I.S (2002) “Microbial cellulose utilization: fundamentals and biotechnology” Microbiol Mol Biol Rev 66: 506-577 25 Mackenzie C.R., Bilous D., Scheneider H., Johnson R.J (1987) “Induction of cellulolytic and xylanolytic enzyme systems in Streptomyces spp.” Appl Environ Microbiol 53: 2835-2839 26 Marchesi J R., Sato T., Weightman A J (1998) “Design and evaluation of useful bacterium – specific PCR primers that amplify genes coding for bacterial 16S rRNA” Appl Environ Microbiol 64(2): 795-799 27 Matano Y., Park J.S., Goldstein M.A., Doi R.H (1994) “Cellulosome promotes extracellular assembly of Clostridium cellulovorans cellulosomes”, J Bacteriol 176: 6952-6956 28 Ng T.K., Weimer P.J., and Zeikus J.G (1977) “Cellulolytic and physiological properties of Clostridium thermocellum”, Arch Microbiol 114:1-7 29 Palonen H (2004) “ Role of lignin in the enzymatic hydrolysis of lignocellulose”, VTT Biotechnology: 11-39 30 Pason P., Kyu K.L., and Ratanakhanokchai K (2006) “Paenibacillus curdlanolyticus strain B-6 xylanolytic-cellulolytic enzyme system that degrades insoluble polysaccharides” Appl Environ Microbiol 72: 2483-2490 31 Poutanen K., Sundberg M., Korte H and Puls J (1990) “Deacetylation of xylans by acetyl esterases of Trichoderma reesei” Appl Microbiol Biotechnol 33: 506-510 61 32 Puls J and Schuseil J (1993) “Chemistry of hemicelluloses: relationship between hemicellulose structure and enzymes required for hydrolysis”, in Hemicellulose and Hemicellulases, Coughlan, M.P., and Hazlewood, G.P (Eds) Protland Press Ltd, London: 1-28 33 Ratanakhanokchai K., Kyu K.L and Tanticharoen M (1999) “Purification and properties of a xylan-binding endoxylanase from alkaliphilic Bacillus sp strain K-1” Appl Environ Microbiol 65:694–697 34 Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T (1989) “Molecular cloning I, II, III: A Laboratory Mannual Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1.21-1.101, 13.11-13.18, 17.3-17.32 35 Sato T., Hu JP., Ohki K., Yamaurra M., Washio J., Matsuyama J., Takahashi N., (2003), “Identification of mutans streptococci by restriction fragment length polymorphism analysis of polymerase chain reaction – amplified 16S ribosomal RNA genes” Oral Microbiol Immunol., 18: 323-326 36 Schwarz W.H (2001) “The cellulosome and cellulose degradation by anaerobic bacteria” Appl Microbiol Biotechnol 56: 634-649 37 Sjostrom E (1993) “Wood chemistry: fundamentals and applications” 2nd ed., Academic Press, San Diego: 1-70 38 Somogyi M (1952) “ Notes in sugar determination” J Biol Chem 195: 265-275 39 Sunna A and Antranikian G (1997) “Xylanolytic enzymes from fungi and bacteria” Critical Rev Biotechnol., 17: 39-67 40.Wyman C.E (1996) “Handbook on Bioethanol: Product and Utilization”, Taylor&Francis: 119-285 62 [...]... ml aceton và 30 ml axit phosphoric 80% [33] Đƣờng glucose, cellobiose, xylose và xylooligosaccharide đƣợc dùng làm chất chuẩn 34 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 3.1.1 Sàng lọc và phân lập vi khuẩn kị khí xylanolytic- cellulolytic ưa nhiệt Sàng lọc các vi khuẩn ưa nhiệt kỵ khí bằng môi trường làm giàu và nuôi cấy ở nhiệt độ cao 34 mẫu đất đƣợc thu thập ngẫu nhiên từ nông trƣờng ở vài tỉnh... PCR 9700, máy lắc nuôi cấy, nồi hấp khử trùng, tủ ổn nhiệt, máy trộn vortex 2.2 2.2.1 Phương pháp nghiên cứu Sàng lọc và phân lập vi khuẩn kị khí xylanolytic- cellulolytic ưa nhiệt Vi khuẩn đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng cơ bản gồm K2HPO4 0,15g/l, KH2PO4 0,29g/l, urea 0,21g/l, cao nấm men 0,45g/l, muối khoáng 0,02%, resazurin 0,0025%, 24 cystein 0,004% và giấy lọc 1% làm cơ chất Môi trƣờng đƣợc xử lý bằng... giải phóng phân tử D-glucose từ đƣờng cellodextrin hòa tan và một loạt các glucoside khác Hình 1.9: Tác dụng của từng enzyme trong cellulose 19 1.2.2 Enzyme xylanolytic Do tính không đồng nhất của xylan, sự thủy phân của nó đòi hỏi các ảnh hƣởng của một hệ thống enzyme phức tạp Enzyme này thƣờng bao gồm hai loại: enzyme không phân nhánh (β-1,4-endoxylanse, β-xylosidase) và enzyme phân nhánh (αarabinofuranosidase,... sạch 2.2.2 Nhận dạng chủng vi khuẩn kị khí xylanolytic- cellulolytic ưa nhiệt 2.2.2.1 Kiểm tra hình thái tế bào vi khuẩn Phƣơng pháp nhuộm Gram cải tiến nhƣ sau [1]: - Chuẩn bị chủng vi khuẩn sạch: các chủng đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng thạch đã nêu ở trên - Tím kết tinh đƣợc nhỏ để làm vết bôi và để trong 1 phút - 1-2 giọt dung dịch (lugol) đƣợc bổ sung và giữ 30 giây đến 1 phút Tiêu bản đƣợc tẩy... bền pH của enzyme đƣợc xác định bằng cách ủ enzyme ở 50oC trong 30 phút với các giá trị pH khác nhau (10 mM) Sau đó hoạt độ enzyme còn lại đƣợc xác định theo phƣơng pháp đã nêu ở trên 2.2.4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đối với hoạt độ và độ bền của enzyme Nhiệt độ tối ƣu của enzyme đƣợc xác định bằng cách đo hoạt độ ở dãy nhiệt độ 40oC đến 90oC, pH 7 Độ bền nhiệt của enzyme đƣợc đo bằng cách ủ enzyme ở pH... vi sinh vật cellulolytic và xylanolytic không ở trong môi trƣờng riêng biệt mà chúng tồn tại cùng với các loài khác nhƣ nấm và vi khuẩn Các chủng này sẽ đóng vai trò nhƣ trung tâm thủy phân polymer để tạo ra đƣờng và các sản phẩm thủy phân khác 1.2.1 Enzyme cellulolytic Enzyme thủy phân cellulose có khả năng thủy phân chất thải chứa cellulose, chuyển hóa các hợp chất kiểu lignocellulose và cellulose... trùng và ủ ở 60oC, pH 7 Quá trình sinh trƣởng của vi khuẩn đƣợc quan sát hàng ngày và các bƣớc sàng lọc đƣợc tiến hành vài lần cho đến khi thu đƣợc kết quả tốt Sau đó 1 ml mỗi mẫu đƣợc dàn đều lên đĩa thạch 2,5% với môi trƣờng tƣơng tự nhƣ trên có chứa bã giấy 1% rồi ủ ở 60oC từ 2-3 ngày trong buồng cấy kị khí Các khuẩn lạc đƣợc sàng lọc vài lần đến khi đƣợc tinh sạch 2.2.2 Nhận dạng chủng vi khuẩn. .. các enzyme khác nhau để thủy phân hiệu quả hơn Mỗi polymer bị thủy phân bởi một số vi sinh vật sản xuất các enzyme hoạt động hỗ trợ nhau Nếu đúng nhƣ vậy, điều này có thể giúp chúng ta giải thích đƣợc tại sao vi sinh vật cellulolytic tổng hợp đặc trƣng nhiều enzyme cellulase khác nhau có tính đặc hiệu gối nhau và tại sao một số enzyme xylanase lại mang vùng liên kết cơ chất gần với cellulose Các vi. .. đƣợc chứng minh là sinh ra từ một số loài vi khuẩn và nấm [20,31] 1.3 Ứng dụng của enzyme lignocellulolytic Thế hệ nhiên liệu sinh học đầu tiên dựa trên đƣờng, tinh bột và dầu thực vật, không có đƣợc những ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp, vì các nguyên vật liệu này cũng đƣợc sử dụng làm thức ăn Lignocellulose đƣợc xem là thế hệ nhiên liệu sinh học thứ hai Trong thập kỷ qua, enzyme thủy phân lignocellulose... vùng miền Phetchaburi, Nakorn Pathorn và Nakorn Ratchasrima tại Thái Lan Trong nghiên cứu này, các chủng vi khuẩn kỵ khí đƣợc phân lập từ 34 mẫu đất ở các vùng nông nghiệp và các mẫu này đƣợc thu thập ở độ sâu ít nhất là 1 mét, sau đó đƣợc bảo quản ở -4oC trong điều kiện kỵ khí Trong 34 mẫu đó có 10 mẫu đƣợc lấy ở tỉnh Phetchaburi, 10 mẫu ở Nakorn Ratchasrima và 14 mẫu ở Nakorn Pathorn 2.1.2 Hóa chất ... đôi từ phế phụ liệu nông nghiệp, để từ đƣa vào ứng dụng rộng rãi sản xuất sản phẩm có giá trị đời sống ngƣời, thực đề tài: “ Bước đầu nghiên cứu enzyme xylanolytic cellulolytic từ chủng vi khuẩn. .. phân lập vi khuẩn kị khí xylanolytic- cellulolytic ƣa nhiệt 35 3.1.1 Sàng lọc vi khuẩn ƣa nhiệt kỵ khí môi trƣờng làm giàu nuôi cấy nhiệt độ cao 35 3.1.2 Sàng lọc chủng vi khuẩn có... hoạt tính xylanolytic- cellulolytic 39 3.2 Kết nhận dạng vi khuẩn kị khí xylanolytic- cellulolytic ƣa nhiệt 40 3.2.1 Xác định hình thái tế bào vi khuẩn 40 3.2.2 Nhận dạng vi khuẩn đọc