Lựa chọn các điều kiện lên men xốp tối ưu và nghiên cứu các đặc tính xylanase từ các chủng vi khuẩn ưu nhiệt

 nh x    i hc Khoa hc T nhiên  ngành: ; 60 42 40   2011 Abstract:      Keywords: ; ; Lên men;  Content MỞ ĐẦU 1. Lý do lựa chọn đề tài                                    2                       -amylase, fructosyl transferase, lipase, pectinase,            “Lựa chọn các điều kiện lên men xốp tối ưu và nghiên cứu đặc tính xylanase từ các chủng vi khuẩn ưa nhiệt”. 2. Nhiệm vụ và mục đích nghiên cứu -                  enzyme xylanase cao. -   -                    -  3. Những đóng góp mới của đề tài             ,             .        Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. XYLAN 1.1.1. Xylan  Xylan và giúp lignocellulose  --1,4, - -              3 - trong    - khô   1.1.2. Cấu trúc của xylan -xylose l  -1,4--1,4- D-  (a) (b) Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của xylan [35]  1.2.3. Tính chất của xylan     - 200 o  -130 o    4 (a) (b) Hình 1.2. Cấu trúc xylan trong cây gỗ (b)  1.2. ENZYME PHÂN GIẢI XYLAN - XYLANASE    này ngo khác tham gia vào quá trình tách dòng. 1.2.1. Nguồn gốc xylanase                       là các quá trình ph         1.2.2. Phân loại xylanase Xylan  5       [7].  gia  amic (Sinnot,    -glycosyl (Collin &      phân các liên    nhóm alkaline xylanase [36]. 1.2.3. Cấu trúc                    11      trên. Trung tâm    ngón tay cái, lòng bàn tay và ngón tay. 6 Hình 1.3. Cấu trúc không gian xylanase của Bacillus subtilis [18] Xylanase  -1,4-- nhau. 1.2.4. Đặc tính của xylanase                enzyme là axit glutamic [2].   enzyme xylanolytic. Hình 1.4. Các enzyme cần thiết phân cắt hoàn toàn xylan [36] 1.2.5. Ảnh hƣởng của một số yếu tố đến hoạt động của enzyme xylanase 1.2.5.1. 1.2.5.1. Ảnh hưởng của một số ion kim loại 1.2.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ 1.2.5.3. Ảnh hưởng của pH 1.2.5.4. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ và các chất tẩy rửa 7 1.2.6. Ứng dụng của xylanase 1.2.6.1. Ứng dụng của xylanase trong công nghiệp thực phẩm 1.2.6.2. Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy 1.2.6.3. Ứng dụng của xylanase trong sản xuất nguyên liệu sinh học 1.2.6.4. Ứng dụng trong công nghiệp vải sợi 1.2.6.5. Ứng dụng trong nông nghiệp 1.2.6.6. Ứng dụng của xylanase trong xử lý môi trường 1.2.7. Vi sinh vật sinh xylanase              Streptomyces, Bacillus, Trichoderma, Aspergillus, Thermobacillus …[36].               Bacillus và Streptomyces Bacillus  Bacillus    -        Bacillus    chi này [3]. Chi Streptomyces   Streptomyces               ,          ,   ,         .  , Streptomyces  , trong  1.3. LÊN MEN XỐP 1.3.1. Khái niệm lên men xốp                   1.3.2. Ƣu điểm của kỹ thuật lên men xốp    8      trì     -   -  -    -  -    -   -  2   -   1.4. TINH SẠCH ENZYME XYLANASE Tinh sch enzyme là mt chui các quá trình liên tip nhm tách riêng mt loi enzyme t hn hu. Tinh sch enzyme là quá trình thit y c các c tính v cu trúc - chng lc h xúc tác và s a các loi enzyme quan trng. Nguyên liu khc s dng cho quá trình tinh sng là mt loi mô sinh hc hoc dch nuôi cy vi sinh vt. Quá trình tinh sch enzyme cho phép tách chit mt loi enzyme t mt hn hu có cha lon có bn cht là protein và phn không có bn cht là protein trong hn hp. Quá trình tách chit này là mt quá trình khá phc tc tách chit này dc phân t, c tính lý hóa, kh ho sinh hc ca tng loi enzyme. Ma vic tinh sch enzyme nhm tho xúc tác ca enzyme, tinh sch tc enzyme và nghiên cc tính ca chúng. Tinh sc ng dng rc y t và công nghip. Mun tinh sc enzyme mà vn gi c tính ca nó thì chúng ta có th s dng nhia vào nhi, n proton (pH), hoc các tác nhân hóa hc (các mui trung tính (NH 4 ) 2 SO 4 , Na 2 SO 4  9  tinh sng s dng kt hng thi nhiu k thut khác nhau: thu hi enzyme bng mui ammonisunfat, sn di SDS-PAGE n di trên gel hot tính. 1.4.1. Tủa enzyme bằng muối ammonisunfat 1.4.2. Tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ 1.4.3. Sắc ký  a pha     n các cht nh quá trình sc ký. 1.4.3.1. Sắc ký lọc gel 1.4.3.2. Sắc ký trao đổi ion 1.4.3.3. Sắc ký ái lực 1.4.3.4. Sắc ký tương tác kỵ nước 1.4.3.5. Các kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao - HPLC 1.4.4. Điện di                 1.4.4.1. Điện di trên gel agarose 1.4.4.2. Điện di trên gel polyacrylamide CHƢƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 CHỦNG VI SINH VẬT, MÔI TRƢỜNG VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 2.1.1. Chủng vi sinh vật -      - N 2.1.2. Môi trƣờng nghiên cứu 2.1.2.1. Môi trường nhân giống (g/l) - Xn m( -10, Glucose-- 1, pH-7). ùng 121 o C trong 15 phút. - V m(Peptone - - - 1, pH 7.0). K o C trong 15 phút. 2.1.2.2. Môi trường nuôi dịch thể 10 a. Môi trường nuôi vi khuẩn- V5.  0 C, 15 phút. b. Môi trường nuôi xa ̣ khuâ ̉ n: 5          1   5.  0 C, 15 phút. 2.1.2.3. Môi trường kiểm tra hoạt độ enzyme  (g/l): Xylan - 1, agar - 16, -HCl 50 mM, pH 7.0, k trùng 121 o C trong 15 phút. 2.1.2.4. Môi trường nuôi xốp       :   , , , malt,    ( này     ). 2.1.3. Thiết bị nghiên cứu  - - -3100 Avant . - - . - - Centrif. - -. - Máy soi gel Bio-. - - AES 1010 Speed Vac System-. - - . - ernational -. - -Dry, FTS Systems, Inc. - - Máy rung (Eyela Cute Mixer-1000 -. - Máy ly tâm (A15-B.Braun-. - Máy cô quay chân không (RV05-ST, KIKA Labortechnik -. - -). - -. - -. -  - . - , 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phƣơng pháp xác định hoạt tính xylanase 2.2.1.1. Phương pháp định tính (khuếch tán trên thạch)     0 C  xylanase  (VPG) (D-d, m  [...]... tích trình tự và xây dựng cây phát sinh chủng loại 2.2.4.2 Quan sát hình thái a Hình thái tế bào và khuẩn lạc vi khuẩn b Quan sát hình thái xạ khuẩn 2.2.5 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp cho khả năng tổng hợp xylanase ở các chủng vi sinh vật nghiên cứu 2.2.5.1 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy giống thích hợp cho khả năng tổng hợp xylanase ở các chủng nghiên cứu a Môi trường thích hợp b Nhiệt độ thích... hưởng của các ion kim loại đến hoạt độ enzyme Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KẾT QUẢ TUYỂN CHỌN 3.1.1 Lựa chọn các chủng có hoạt độ xylanase cao 3.1.2 Lựa chọn các chủng vi sinh vật bền nhiệt có hoạt tính xylanase cao Từ 26 chúng ban đầu chúng tôi chọn ra được hai chủng B2H2 và 118, là các chủng bền nhiệt có hoạt độ xylanase cao nhất để tiến hành nghiên cứu sâu hơn 3.2 PHÂN LOẠI 3.2.1 Chủng B2H2... thích hợp cho enzyme xylanase của chủng B2 H2 là pH6 Nhiệt độ phản ứng tối ưu là 50oC Độ bền nhiệt là 600C Ion kim loại làm tăng hoạt độ xylanase mạnh nhất là Ca2+ KIẾN NGHỊ 1 Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về đặc tính enzyme từ chủng 118 2 Tiếp tục tách chiết và tinh sạch xylanase từ chủng B2H2 và nghiên cứu đặc tính của enzyme xylanase tinh sạch sinh ra từ chủng này References TIẾNG VI T 1 Phạm Thị Trân... cho giống khởi động 2.2.5.2 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy xốp thích hợp cho khả năng tổng hợp xylanase ở các chủng nghiên cứu a Lựa chọn cơ chất b Lựa chọn thời gian nuôi cấy c Lựa chọn độ ẩm d Lựa chọn tỷ lệ giống cấy e Lựa chọn nguồn cacbon bổ sung f Lựa chọn nguồn nitơ bổ sung 12 g Lựa chọn nguồn khoáng 2.2.6 Thu hồi enzyme 2.2.6.1 Chiết enzyme 2.2.6.2 Thu hồi enzyme bằng các dung môi hữu cơ 2.2.6.3... sung các nguồn cacbon khác nhau vào cơ chất nuôi cấy của cả 2 chủng vi khuẩn và xạ khuẩn đã gây ra sự ức chế khả năng tổng hợp enzyme xylanase của 2 chủng này Hoạt độ xylanase của chủng vi khuẩn B2H2 giảm từ 2147 U/g xuống còn 1711 U/g khi thêm 4% glucose vào cơ chất nuôi cấy Đối với chủng xạ khuẩn 118, khi bổ sung thêm nguồn 17 cacbon hoạt độ xylanase thu được giảm mạnh (hoạt độ xylanasegiảm từ 2379... enzyme ban đầu), tiếp đó là Mn2+ và ion Fe2+, ion Mg2+ làm giảm hoạt độ của enzyme mạnh nhất (giảm 44%) 25 ́ KÊT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1 Từ 26 chủng vi sinh vật được lưu giữ ở Bảo tàng giống Vi sinh vật đã chọn được 2 chủng vi khuẩn và xạ khuẩn có khả năng sinh xylanase cao 2 Kết hợp phân tích trình tự DNAr 16S và đặc điểm hình thái, chủng B 2H2 thuô ̣c loài Bacillus subtilis và chủng 118 thuộc loài Streptomyces... được 2 loại xylanase từ chủng 118 chúng tôi tiến hành xác định đặc tính của 2 loại enzyme này 3.6.1 Đặc tính enzyme xylanase từ chủng 118 3.6.1.1 pH thích hợp Xylanase thô không hoạt động khi pH môi trường dưới 4 và có hoạt động ở pH trong dải từ 4 đến 9 cao nhất ở pH6 và pH7 Đối với 2 enzyme xylanase tinh sạch (E 1 và E2), E1 có dải pH rộng hơn E2 và hoạt độ xylanase ạt cực đại ở pH 6, và giảm nhẹ... dải nhiệt độ từ 25 đến 55oC, và sinh trưởng mạnh nhất ở nhiệt độ nuôi là 40 oC Do đó, nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng của các chủng nghiên cứu là 40oC 3.3.1.3 pH thích hợp cho sự sinh trưởng Xylanase do cả 2 chủng nghiên cứu sinh ra đều không hoạt động khi pH môi trường dưới 4 và có hoạt độ ở pH trong dải từ 4 đến trên 9 Cả hai chủng B2H2 và 118 đều đạt hoạt độ cao nhất ở giá trị pH7 và giảm... chất xốp Đối với chủng vi khuẩn B2H2, hoạt độ xylanasethu được đạt cao nhất trên cơ chất malt (2154 U/g), tiếp theo là trên cơ chất gạo (587 U/g) Đối với chủng xạ khuẩn 118, hoạt độ xylanase thu được cao nhất trên cơ chất gạo (2386 U/g ), và thấp nhất trên cám gạo (184 U/g) 3.3.2.2 Lựa chọn độ ẩm thích hợp Cả hai chủng vi khuẩn và xạ khuẩn đều tổng hợp enzyme xylanase tốt nhất ở độ ẩm 50% Tuy nhiên ở chủng. .. hoạt độ xylanasecủa chủng B2H2 khá cao và đồng đều (hoạt độ từ 21 - 25), nhưng chủng 118 lại có sự chênh lệch lớn (VPG xylan từ 15 - 25mm) Từ đó, chúng tôi đã chọn được môi trường thích hợp nhất cho sự sinh trưởng của 2 chủng là: môi trường V5 cho chủng B2H2 và môi trường X2 cho chủng 118 Kết quả này được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp sau 3.3.1.2 Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng Các chủng đều .   Lựa chọn các điều kiện lên men xốp tối ưu và nghiên cứu đặc tính xylanase từ các chủng vi khuẩn ưa nhiệt . 2. Nhiệm vụ và mục đích nghiên cứu -. động 2.2.5.2. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy xốp thích hợp cho khả năng tổng hợp xylanase ở các chủng nghiên cứu a. Lựa chọn cơ chất b. Lựa chọn thời gian