Lựa chọn các điều kiện lên men xốp tối ưu và nghiên cứu đặc tính xylanase từ các chủng vi khuẩn ưa nhiệt

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ NHIÊN LỰA CHỌN CÁC ĐIỀU KIỆN LÊN MEN XỐP TỐI ƯU VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH XYLANASE TỪ VI KHUẨN ƯA NHIỆT LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội - 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ NHIÊN LỰA CHỌN CÁC ĐIỀU KIỆN LÊN MEN XỐP TỐI ƯU VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH XYLANASE TỪ VI KHUẨN ƯA NHIỆT Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS ĐÀO THỊ LƯƠNG Hà Nội - 2012 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo TS Đào Thị Lương tận tình giúp đỡ trình thực hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cám ơn Nghiên cứu sinh Trịnh Thành Trung Nghiên cứu sinh Trần Thị Lệ Quyên nhiệt tình giúp đỡ suốt thời gian học tập nghiên cứu vừa qua Xin chân thành cảm ơn TS Dương Văn Hợp cán Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu để hoàn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo cán Bộ môn Vi sinh vật học thuộc Khoa Sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc Gia Hà Nội Xin cảm ơn Phòng Sau Đại học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc Gia Hà Nội tạo nhiều điều kiện cho hoàn thành luận văn Tôi xin cảm ơn thầy cô, bạn bè đồng nghiệp động viên giúp đỡ suốt thời gian làm luận văn Và lời cảm ơn sâu sắc xin dành cho gia đình người thân yêu ủng hộ, động viên suốt thời gian qua Hà Nội, ngày tháng năm 2012 Tác giả Nguyễn Thị Nhiên MỤC LỤC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Thành phần chất khô thực vật ………………………………… 13 1.2 Các họ thuộc glyoside hy drolase (GHs) có hoạt động xylan (Collin & cộng sự, 2005)…… ………………………………………………… 18 Một số nhóm vi sinh vật dùng lên men xốp (Raimbault, 1998) …………………………………………………………………… 28 3.1 Hoạt tính xylanase 26 chủng vi sinh vật nghiên cứu……………… 55 3.2 Khả chịu nhiệt chủng vi sinh vật………………………… 56 3.3 Ảnh hưởng loại dịch chiết đến hiệu thu hồi enzyme xylanase 73 Kết tủa enzyme xylanase chủng 118 B2H2 dung môi hữu 73 1.3 3.4 MỤC LỤC HÌNH Hình Tên hình 1.1 1.2 Cấu trúc hóa học xylan … ……………………………………… Cấu trúc xylan gỗ ……………………………… ………… 14 16 1.3 Cấu trúc không gian xylanase Bacillus subtilis…… … ………… 19 1.4 Các enzyme cần thiết phân cắt hoàn toàn xylan………… …………… 20 1.5 Sự thủy phân thành tế bào thực vật enzyme ……………… …… 24 3.1 Vị trí phân loại chủng B2H2 với loài có quan hệ họ hàng gần 57 3.2 Hình thái khuẩn lạc tế bào chủng B2H2……… ……… 58 3.3 Vị trí phân loại chủng XK-118 với loài có quan hệ họ hàng gần 59 3.4 Hình thái khuẩn lạc cuống sinh bào tử chủng 118………… …… 60 3.5 Môi trường thích hợp cho sinh trưởng tổng hợp enzyme chủng B2H2 118 …………………………………………………… 61 Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng tổng hợp enzyme chủng B2H2 118……………………………………………………………… 62 pH thích hợp cho sinh trưởng tổng hợp enzyme chủng B2H2 118……………………………………………………………………… 63 3.8 Thời gian thích hợp cho giống khởi động chủng B2H2 118… … 65 3.9 Cơ chất thích hợp cho trình tổng hợp xylanase chủng B2H2 3.6 3.7 Trang 118……………………………………………………………………… 66 Ảnh hưởng độ ẩm đến khả tổng hợp enzyme xylanase chủng B2H2 118 ……………………………………………………… 67 3.11 Thời gian nuôi cấy thích hợp cho khả tổng hợp xylanase chủng B2H2 118 …………………………………………………… 68 3.10 3.12 Tỷ lệ giống cấy thích hợp cho khả sinh xylanase chủng B2H2 118 …………………………………………………………………………………… 3.13 Nguồn nitơ bổ sung thích hợp cho khả tổng hợp xylanase chủng B2H2 chủng 118 69 70 3.14 Mức độ ảnh hưởng cao thịt đến khả tổng hợp xylanase chủng B2H2 ……………………………………………………… 71 3.15 Mức độ ảnh hưởng urea đến khả tổng hợp xylanase chủng 118…………………… ………………………………………………… 72 3.16 Nguồn cacbon bổ sung thích hợp cho khả tổng hợp xylanase chủng B2H2 chủng 18 73 3.17 Lựa chọn hỗn hợp khoáng thích hợp cho khả sinh tổng hợp xylanase chủng B2H2 chủng 118 74 3.18 Sắc ký trao đổi ion DEAE sepharose mẫu enzyme tủa aceton chủng 118 …………………………………………… ……………………… 76 3.19 Sắc ký trao đổi ion sử dụng dịch enzyme phân đoạn có hoạt độ xylanase cao bước rửa cột 77 3.20 Điện di đồ gel hoạt độ mẫu enzyme thô có ME (1) ME (2); mẫu enzyme tủa aceton có ME (3) ME (4) 78 3.21 Điện di gel hoạt tính mẫu enzyme tủa aceton 79 3.22 Hoạt độ xylanase chủng 118 thu hồi tủa muối ammonisunfat từ 30 đến 90% 80 3.23 Điện di gel SDS-PAGE điện di gel hoạt độ mẫu enzyme tủa aceton mẫu enzyme tủa ammonisunfat từ 30 đến 90% 80 3.24 Sắc ký trao đổi ion dịch enzyme tủa ammonisunfat 50% 81 3.25: Kết sắc ký trao đổi ion mẫu enzyme tủa ammonisunfat 80% 82 3.26 Điện di SDS-PAGE mẫu enzyme tủa ammonisunfat 80%, E1 E2 83 3.27 Dải pH thích hợp cho hoạt động xylanase từ 118 83 3.28 Nhiệt độ phản ứng tối ưu enzyme xylanase từ chủng 118 84 3.29 Ảnh hưởng ion kim loại đến hoạt động enzyme xylanase từ 118 85 3.30 Khả chịu nhiệt enzyme xylanase từ chủng 118 600C 86 3.31 Khả bền nhiệt hai loại xylanase tinh từ chủng 118 .… 86 3.32 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ xylanase chủng B2H2 87 3.33 Nhiệt độ thích hợp cho phản ứng enzyme xylanase từ chủng B2H2 88 3.34 Khả chịu nhiệt enyme xylanase từ chủng B2H2 ……………… 88 3.35 Ảnh hưởng ion kim loại đến hoạt độ xylanase 89 MỤC LỤC MỞ ĐẦU 11 Lý lựa chọn đề tài 11 Nhiệm vụ mục đích nghiên cứu 12 Những đóng góp đề tài 12 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 13 1.1 XYLAN 13 1.1.1 Xylan 13 1.1.2 Cấu trúc xylan 14 1.2.3 Tính chất xylan 15 1.2 ENZYME PHÂN GIẢI XYLAN - XYLANASE 16 1.2.1 Nguồn gốc xylanase 16 1.2.2 Phân loại xylanase 17 1.2.3 Cấu trúc 18 1.2.4 Đặc tính xylanase 19 1.2.5 Ảnh hưởng số yếu tố đến hoạt động enzyme xylanase 21 1.2.5.1 Ảnh hưởng số ion kim loại 21 1.2.5.2 Ảnh hưởng nhiệt độ 22 1.2.5.3 Ảnh hưởng pH 22 1.2.5.4 Ảnh hưởng dung môi hữu chất tẩy rửa 23 1.2.6 Ứng dụng xylanase 23 1.2.6.1 Ứng dụng xylanase công nghiệp thực phẩm 23 1.2.6.2 Trong công nghiệp sản xuất giấy bột giấy 24 1.2.6.3 Ứng dụng xylanase sản xuất nguyên liệu sinh học 24 1.2.6.4 Ứng dụng công nghiệp vải sợi 25 1.2.6.5 Ứng dụng nông nghiệp 25 1.2.6.6 Ứng dụng xylanase xử lý môi trường 25 1.2.7 Vi sinh vật sinh xylanase 26 1.3 LÊN MEN XỐP 26 1.3.1 Khái niệm lên men xốp 26 1.3.2 Ưu điểm kỹ thuật lên men xốp 27 1.4 TINH SẠCH ENZYME XYLANASE 30 1.4.1 Tủa enzyme muối ammonisunfat 31 1.4.2 Tủa enzyme dung môi hữu 32 1.4.3 Sắc ký 33 1.4.3.1 Sắc ký lọc gel 33 1.4.3.2 Sắc ký trao đổi ion 34 1.4.3.3 Sắc ký lực 35 1.4.3.4 Sắc ký tương tác kỵ nước 36 1.4.3.5 Các kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao - HPLC 36 1.4.4 Điện di 37 1.4.4.1 Điện di gel agarose 38 1.4.4.2 Điện di gel polyacrylamide 38 CHƯƠNG - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.1 CHỦNG VI SINH VẬT, MÔI TRƯỜNG VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 40 2.1.1 Chủng vi sinh vật 40 2.1.2 Môi trường nghiên cứu 40 2.1.2.1 Môi trường nhân giống (g/l) 40 2.1.2.2 Môi trường nuôi dịch thể 40 2.1.2.3 Môi trường kiểm tra hoạt độ enzyme 41 2.1.2.4 Môi trường nuôi xốp 41 2.1.3 Thiết bị nghiên cứu 41 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41 2.2.1 Phương pháp xác định hoạt tính xylanase 41 2.2.1.1 Phương pháp định tính (khuếch tán thạch) 41 2.2.1.2 Phương pháp định lượng 42 2.2.2 Tuyển chọn chủng 44 2.2.3 Phương pháp xác định khả sinh trưởng 44 2.2.4 Phương pháp phân loại 44 2.2.4.1 Phương pháp phân loại vi khuẩn dựa vào đọc trình tự ADN 44 2.2.4.2 Quan sát hình thái 48 2.2.5 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp cho khả tổng hợp xylanase chủng vi sinh vật nghiên cứu 49 2.2.5.1 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy giống thích hợp cho khả tổng hợp xylanase chủng nghiên cứu 49 2.2.5.2 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy xốp thích hợp cho khả tổng hợp xylanase chủng nghiên cứu 49 2.2.6 Thu hồi enzyme 51 2.2.6.1.Chiết enzyme 51 2.2.6.2 Thu hồi enzyme dung môi hữu 51 2.2.7 Tinh xylanase chủng 118 52 2.2.7.1 Tủa enzyme dung môi hữu 52 2.2.7.2 Tủa enzyme muối ammonisunfat 52 2.2.7.3 Sắc ký trao đổi ion 52 2.2.8 Điện di 53 2.2.8.1 Điện di gel SDS-PAGE 53 2.2.8.2 Điện di gel hoạt tính 53 2.2.9 Nghiên cứu đặc tính enzyme 54 2.2.9.1 pH thích hợp cho hoạt động enzyme 54 2.2.9.2.Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động enzyme 54 2.2.9.3 Khả bền nhiệt enzyme 54 2.2.9.4 Ảnh hưởng ion kim loại đến hoạt độ enzyme 54 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 54 3.1 KẾT QUẢ TUYỂN CHỌN 54 3.1.1 Lựa chọn chủng có hoạt độ xylanase cao 54 3.1.2 Lựa chọn chủng vi sinh vật bền nhiệt có hoạt tính xylanase cao 55 3.2 PHÂN LOẠI 56 3.2.1 Chủng B2H 56 3.2.1.1 Phân tích trình tự ADNr 16S 56 3.2.1.2 Đặc điểm hình thái 57 3.2.2 Chủng 118 58 3.2.1.2 Phân tích trình tự ADNr 16S 58 3.2.1.3 Đặc điểm hình thái 59 3.3 NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY 60 3.3.1 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy giống 60 3.3.1.1 Môi trường thích hợp cho sinh trưởng 60 3.3.1.2 Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng 62 3.3.1.3 pH thích hợp cho sinh trưởng 63 3.3.1.4 Thời gian thích hợp cho giống khởi động 64 3.3.2 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy xốp 65 3.3.2.1 Lựa chọn chất 65 3.3.2.2 Lựa chọn độ ẩm thích hợp 65 3.3.2.4 Lựa chọn tỷ lệ giống cấy thích hợp 68 3.3.2.5 Lựa chọn nguồn nitơ bổ sung 68 3.3.2.6 Lựa chọn nguồn cacbon bổ sung 71 3.3.2.7 Lựa chọn loại khoáng thích hợp 72 3.4 THU HỒI ENZYME 72 3.4.1 Điều kiện thích hợp cho chiết enzyme 72 3.4.2 Thu hồi enzyme dung môi hữu 73 3.5 TINH SẠCH ENZYME 74 3.5.1 Tinh enzyme xylanase chủng 118 theo phương pháp sắc ký trao đổi ion 74 3.5.2 Tinh xylanase chủng 118 phương pháp tủa muối ammonisunfat bão hòa kết hợp với sắc ký trao đổi ion sepharose DEAE 77 3.6.1 Đặc tính enzyme xylanase từ chủng 118 81 3.6.1.1 pH thích hợp 81 3.6.1.2 Nhiệt độ thích hợp 82 3.6.1.3 Ảnh hưởng ion kim loại 83 3.6.1.4 Khả chịu nhiệt enzyme 84 3.6.2 Đặc tính xylanase từ B2H2 86 3.6.2.1 pH thích hợp 86 3.5.2.2 Nhiệt độ 87 3.5.2.3 Bền nhiệt 88 3.5.2.4 Ảnh hưởng ion kim loại 88 KẾT LUẬN 90 KIẾN NGHỊ 91 TÀI LIỆU THAM KHẢO 92 TIẾNG VIỆT 92 TIẾNG ANH 92 PHỤ LỤC 96 BẢNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN HPLC ARN bp : High Performance Liquid Chromatography (sắc ký lỏng hiệu cao) : Acid Deoxyribose Nucleic (acid deoxyribonucleic) : Acid Deoxyribose Nucleic ribosome (acid deoxyribonucleic ribosome) : Acid Ribose Nucleic (acid ribonucleic) : base pair (cặp base) C CMC Da DEAE DNS dNTP EtBr : bon : Carboxymethyl cellulose : Dalton : Diethylaminoethyl : Dinitro-salicylic acid : Deoxyribonucleotide triphosphate : Ethidium Bromide G GH kb kDa mA PCR SDS : gram : Glycoside Hydrolase : Kilo-base : Kilo-Dalton : mini Ampe : Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) : Sodium Dodecyl Sulfate ADN ADNr SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulfate- Polyacrylamide Gel Electrophoresis TAE : Tris - Acetate - Ethylendiamin tetracetic acid TE : Tris - Ethylendiamin tetracetic acid TEMED U v/p VPG XK : Tetramethylethylenediamine : Unit (đơn vị) : Vòng /phút : Vòng phân giải : Xạ khuẩn YG : Yeast Glucose (môi trường YG) 10 MỞ ĐẦU Lý lựa chọn đề tài Trong nhiều năm gần đây, nhu cầu sử dụng enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật ngày tăng, đặc biệt enzyme xylanase Xylanase sử dụng nhiều ngành sản xuất toàn giới [26, 15] Một ứng dụng quan trọng xylanase dùng để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi Sự có mặt xylanase thức ăn chăn nuôi có tác dụng thúc đẩy trình tiêu hóa, cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột động vật [11, 6] Ngoài ra, xylanase ứng dụng nhiều lĩnh vực khác như: phân hủy rác thải; tẩy trắng công nghiệp sản xuất giấy, sản xuất nhiên liệu sinh học,… [33, 30] Xét quy mô công nghiệp, sản xuất enzyme lĩnh vực ngày phát triển công nghệ sinh học nói chung công nghệ thực phẩm nói riêng Nhu cầu sử dụng enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật ngày tăng cao, đặc biệt enzyme xylanase sử dụng nhiều ngành sản xuất toàn giới [14] Trong sinh giới, động vật thực vật khả tự sinh xylanase, vai trò thủy phân xylan phụ thuộc chủ yếu vào nguồn vi sinh vật, đặc biệt quan trọng nhóm vi khuẩn, xạ khuẩn nấm Trước đây, việc nghiên cứu xylanase chủ yếu tiến hành đối tượng nấm sợi Tuy nhiên, gần với phát mẽ khoa học công nghệ, ngày nhiều chủng vi sinh vật có khả sinh xylanase phát nghiên cứu sâu Đồng thời, lĩnh vực liên quan đến enzyme xylanase ứng dụng loại enzyme vi khuẩn xạ khuẩn nhà khoa học ngày quan tâm Lên men xốp đánh giá đường tốt để sản xuất enzyme sản phẩm bền nhiệt khác Lên men xốp ngày sử dụng rộng rãi sản xuất nghiên cứu ứng dụng mang tính thực tiễn kinh tế Lên men xốp dùng công nghiệp chế biến sản xuất thực phẩm chủ yếu lĩnh vực sản xuất loại hương liệu, sản xuất enzyme (a-amylase, fructosyl transferase, lipase, pectinase, xylanase), acid hữu (acid lactic, acid citric) loại kẹo cao su [8] Trước đây, sản xuất enzyme người ta thường sử dụng kỹ thuật lên men dịch thể Tuy nhiên, tiến hành so sánh hiệu loại hình lên men, người ta thấy hàm lượng enzyme vi sinh vật sinh lên men xốp cao 11 nhiều lần so với lên men dịch thể sử dụng chủng vi sinh vật điều kiện lên men [14] Để góp phần bổ sung số liệu cần thiết việc ứng dụng kỹ thuật lên men xốp công nghiệp sản xuất enzyme thực đề tài: “Lựa chọn điều kiện lên men xốp tối ưu nghiên cứu đặc tính xylanase từ chủng vi khuẩn ưa nhiệt” Nhiệm vụ mục đích nghiên cứu - Khảo sát tuyển chọn chủng vi khuẩn xạ khuẩn bền nhiệt có hoạt độ enzyme xylanase cao - Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân loại chủng vi khuẩn xạ khuẩn nghiên cứu - Lựa chọn điều kiện lên men xốp tối ưu cho chủng vi khuẩn xạ khuẩn nghiên cứu - Nghiên cứu đặc tính tinh enzyme chủng nghiên cứu Những đóng góp đề tài Đề tài thực có kế thừa công trình nghiên cứu công bố gần mặt phương pháp nghiên cứu, nhiên kết hoàn toàn độc lập Do đề tài góp phần đóng góp thêm số liệu vào sở liệu trình sản xuất enzyme xylanase kỹ thuật lên men xốp 12 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 XYLAN 1.1.1 Xylan Xylan thành phần hemicellulose thực vật, polysaccharide phổ biến thứ hai tự nhiên sau cellulose tìm thấy thành tế bào thực vật [27] Xylan tham gia vào cấu trúc giúp lignocellulose bền Bảng 1.1: Thành phần chất khô thực vật [2] Nguồn gốc Cellulose (%) Hemicellulose (%) Lignin (%) Thân gỗ cứng 40-55 24-40 18-25 Thân gỗ mềm 45-50 25-35 25-35 Vỏ lạc 25-30 25-30 30-40 Lõi ngô 45 35 15 Giấy 85-99 0-15 Vỏ trấu 32.1 24 18 Vỏ trấu lúa mì 30 50 15 Rác phân loại 60 20 20 Lá 15-20 80-85 Hạt 80-95 5-20 Giấy báo 40-55 25-40 18-30 Giấy thải từ bột giấy hóa học 60-70 10-20 5-10 Chất rắn nước thải ban đầu 8-15 - 24-29 Chất thải lợn 28 - Phân bón gia súc 1.6-4.7 1.4-3.3 2.7-5.7 Cỏ bờ biển Bermuda 25 35.7 6.4 Cỏ mềm 45 31.4 12.0 25-40 25-50 10-30 33.4 30 18.9 Các loại cỏ (trị số trung bình cho loại) Bã thô Thực vật cạn có xylan chuỗi D-xylosyl nối với liên kết β-1,4, tảo biển tổng hợp xylan với cấu trúc hóa học khác monomer D-xylose nối với liên kết β-1,3 Ở vài lớp Chlorophycaea Rhodophycaea diện cellulose, xylan tạo nên vật liệu hình sợi suốt Thông thường, xylan chiếm khoảng 15-30% trọng lượng chất khô hạt kín khoảng 7-15% trọng lượng chất khô hạt trần Đặc biệt rộng, xylan chiếm tới 35% tổng trọng lượng chất khô thực vật [21] 13 1.1.2 Cấu trúc xylan Xylan polysaccharide không đồng nhất, bao gồm gốc D-xylose liên kết với liên kết β-1,4-xylanosidic (β-1,4- D-xylopyranosyl) đường xylopyranose với acetyl, arabinosyl glucuronysyl [22] (a) (b) Hình 1.1 Cấu trúc hóa học xylan [35] (a) Cấu trúc monomere; (b) Cấu trúc tự nhiên Do tính không đồng xylan, thủy phân phải cần đến hệ thống enzyme phức tạp Enzyme thường bao gồm hai loại: enzyme không phân nhánh (β-1,4-endoxylanse, ferulic acid esterases) enzyme phân nhánh (αarabinofuranosidase, α-glucuronidase, esterase xylan acetyl esterase axit phenolic) (Hình 1) Tất enzyme tác động tương hỗ để chuyển hóa xylan thành cấu tử đường Hệ thống đa enzyme thủy phân xylan phổ biến vi khuẩn nấm Các xylan khác loại chứa nhóm thể khác mạch chuỗi chuỗi bên Sự phân giải polysaccharide phức tạp cần có hoạt động hỗ trợ thành phần khác hệ thống enzyme thủy phân xylan Trong đó, endo-β-1,4-xylanase enzyme quan trọng khởi đầu cho trình phân giải xylan thành xylooligosaccharide ngắn 14 Khác với cellulose, xylan có mạch polymere ngắn hơn, bao gồm khoảng 150- 200 gốc xylose [20] Các sợi xylan liên kết với nhờ phân tử acid diferulic bao quanh vi sợi cellulose Cùng với lignin, xylan có tác dụng bảo vệ vi sợi cellulose [31] Cấu trúc hóa học xylan phụ thuộc vào nguồn gốc vị trí tế bào chúng Ví dụ, gỗ rộng, xylan bao gồm 89,3% xylose, 1% arabinose, 1% glucose, 8,3% anhydrouronic acid Thông thường tỷ lệ arabinose: 4-O-methyl-glucuronic acid: xylose xylan gỗ mềm 1,3:2:10 Arabinose, acetylate thường tạo nhánh C thứ đường xylose, glucosyluronic, 4-O-methyl-glucuronic acid tạo nhánh C thứ [16] Xylan thực vật cạn xuất nhiều vị trí vách tế bào mô bị lignin hóa, chúng tìm thấy số loại thực vật khác rêu, dương xỉ (Aspinal, 1959; Joseleau, 1980) Chúng thường tạo thành vách thứ cấp mô có chức cấu trúc, diện vách sơ cấp vách sơ cấp số tế bào tăng trưởng, vách sơ cấp hạt giống số loài thực vật có chức dự trữ (Joseleau Barnoud, 1974; Mc Neil & cộng sự, 1979; Shaw & cộng sự, 1966) Ở vị trí phía vách tế bào, xylan liên kết với thành phần cấu trúc khác, đặc biệt với vi sợi cellulose, với polymere cellulose khác, hầu hết trường hợp với lignin Xylan liên kết với lignin liên kết hydrogen với acid phenon liên kết hóa trị [35] 1.2.3 Tính chất xylan Xylan không mùi, không vị Nhiệt độ hòa tan xylan phụ thuộc vào nguồn gốc Xylan có nguồn gốc từ gỗ cứng có nhiệt độ hòa tan 150 - 200oC; gỗ mềm, nhiệt độ hòa tan 70-130oC Trong gỗ cứng, cấu trúc xylan có chứa nhóm acetyl, gỗ mềm không chứa nhóm acetyl Do đó, xylan gỗ cứng tan nước tốt [16] 15 (a) (b) Hình 1.2 Cấu trúc xylan gỗ (a) gỗ mềm; (b) gỗ cứng 1.2 ENZYME PHÂN GIẢI XYLAN - XYLANASE Xylanase dùng để phức hệ enzyme cần thiết cho trình phân hủy hoàn toàn chất xylan, polysaccharide không đồng Trong tự nhiên, số vi sinh vật sử dụng nguồn lượng tự sinh loại xylanase khác Các loại enzyme chức phân hủy thành tế bào thực vật kết hợp với enzyme thủy phân khác tham gia vào trình tách dòng 1.2.1 Nguồn gốc xylanase Xylanase sinh tổng hợp nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn động vật nguyên sinh Trong loài vi sinh vật có khả sinh tổng hợp xylanase, nấm, vi khuẩn xạ khuẩn nhóm quan trọng nhất, đặc biệt nấm sợi Các nhóm vi sinh vật có khả sinh xylanase phân bố rộng rãi tham gia tích cực vào chu trình tuần hoàn vật chất, trình phân giải chất hữu để hình thành chất mùn [31] 16 Các loại xylanase sinh vi khuẩn nấm sợi ưa kiềm có khả chịu nhiệt tốt chúng ứng dụng rộng rãi cho hiệu cao công nghiệp [22] 1.2.2 Phân loại xylanase Xylanase nghiên cứu rộng khắp toàn cầu suốt hai thập kỷ vừa qua chúng có ưu điểm vượt trội ứng dụng công nghiệp, chẳng hạn công nghiệp thực phẩm, sản xuất thức ăn chăn nuôi, công nghiệp sản xuất bột giấy làm giấy Xylanase thuộc nhóm enzyme thủy phân liên kết glycoside (glycoside hydrolase, GH), thủy phân xylan Glycoside hydrolase nhóm enzyme phân bố rộng rãi, thủy phân liên kết glycoside chuỗi polysaccharide oligosaccharide Do cấu trúc phức tạp carbonhydrate tự nhiên, nên enzyme đặc hiệu chất khác tồn số lượng lớn song song với GH từ nguồn khác phân loại thành họ khác dựa vào trình tự axit amin tương đồng Nguyên tắc từ trình tự axit amin bậc thấy mối liên kết trực tiếp cấu trúc bậc cuộn gấp enzyme thành viên hệ định [7] Trước đây, nhà khoa học cho xylanase khác với hệ enzyme glycoside hydrolase (GHs), gần đây, người ta nghiên cứu xylanase có đặc điểm thuộc hệ enzyme GH5, GH7, GH8, GH10, GH11 GH43 [19] Nhưng đa phần xylanase thuộc nhóm GH10 GH11 [21] Xylanase thuộc hệ GH10 có khối lượng phân tử nhỏ 30 kDa thuộc nhóm acid xylanase Còn xylanase thuộc hệ GH11 có khối lượng phân tử lớn 30 kDa thuộc nhóm alkaline xylanase [37] Dựa vào tương đồng trình tự acid amin kết phân tích cấu trúc không gian, xylanase chủ yếu xếp vào họ 10 11 hệ enzyme thủy phân glycoside (Collin & cộng sự, 2005; Jeya & cộng sự, 2009; Sibtain & cộng sự, 2009) Xylanase hai họ 10 11 thủy phân xylan chế thay hai lần liên quan đến hai acid glutamic (Sinnot, 1990) Hai phân tử acid nằm trung tâm hoạt động enzyme định phần đến hình thành cấu trúc xylanase Một phân tử acid hoạt động chất xúc tác cách thêm proton vào chất, phân tử acid thứ hai có lực mạnh với nhân, có vai trò mở đầu cho phản ứng phân cắt hình thành enzyme α-glycosyl (Collin & cộng sự, 2005) [12] 17 Bảng 1.2 Các họ thuộc glyoside hydrolase (GHs) có hoạt động xylan (Collin & cộng sự, 2005) Số thành viên Họ glycoside hydrolase thủy phân xylan Nếp gấp Cơ chế xúc tác Nhóm acid/base Nucleophilchase (β/α)8 Giữ nguyên Glutamate Glutamate β-Jelly roll Giữ nguyên Glutamate Glutamate (α/α)6 Đảo ngược Glutamate Aspartate 10 127 (β/α)8 Giữ nguyên Glutamate Glutamate 11 173 β-Jelly roll Giữ nguyên Glutamate Glutamate Đảo ngược Glutamate Aspartate 5-Blade β43 propeller Các thành viên họ xylanase 10 có cấu trúc α/β gấp cuộn lần trọng lượng phân tử xấp xỉ 48 kDa, pI thấp, thủy phân liên kết glycoside với giữ hình thể nguyên vẹn, đó, họ xylanase 11 có cấu trúc mạch β gập hình bánh sandwich gần giống với cấu trúc bàn tay phải có khối lượng phân tử nhỏ hơn, vào khoảng 20 kDa, pI cao thủy phân liên kết glycoside với chế xúc tác đổi chỗ hai lần (Hakylinen & cộng sự, 2003; Zhou & cộng sự, 2009) Xylanase thuộc hệ GH10 thuộc nhóm acid xylanase Xylanase thuộc hệ GH11 thuộc nhóm alkaline xylanase [36] 1.2.3 Cấu trúc Cấu trúc bậc ba phân tử xylanase xác định cách sử dụng mô hình Insight II Molecular Theo đó, cấu trúc xylanase bao gồm miền đơn có chứa vùng cấu trúc β miền có chuỗi xoắn α, cấu trúc có xylanase hệ GH11 Cấu trúc chung phân tử xylanase ví “bàn tay phải” với ngón tay phía ngón nằm phía Trung tâm hoạt động ngón tay cái, lòng bàn tay ngón tay 18 Hình 1.3 Cấu trúc không gian xylanase Bacillus subtilis [18] Xylanase báo cáo lần vào năm 1955 Đó enzyme thủy phân xylan, phá vỡ liên kết β-1,4-xylanosidic xylan thành nhiều xylo-oligosaccharide có độ dài khác 1.2.4 Đặc tính xylanase Trong trung tâm hoạt động xylanase, axit amin định hoạt động enzyme axit glutamic [2] Sự thủy phân xylan đòi hỏi hỗ trợ hoạt động thành phần hệ thống enzyme xylanolytic 19 [...]... Lựa chọn các điều kiện lên men xốp tối ưu và nghiên cứu đặc tính xylanase từ các chủng vi khuẩn ưa nhiệt 2 Nhiệm vụ và mục đích nghiên cứu - Khảo sát và tuyển chọn những chủng vi khuẩn và xạ khuẩn bền nhiệt có hoạt độ enzyme xylanase cao - Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn nghiên cứu - Lựa chọn các điều kiện lên men xốp tối ưu cho các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn. .. khoa học công nghệ, ngày càng nhiều chủng vi sinh vật có khả năng sinh xylanase được phát hiện và nghiên cứu sâu Đồng thời, các lĩnh vực liên quan đến enzyme xylanase và ứng dụng của loại enzyme này ở vi khuẩn và xạ khuẩn được các nhà khoa học ngày càng quan tâm hơn Lên men xốp được đánh giá là con đường tốt nhất để sản xuất enzyme và các sản phẩm bền nhiệt khác Lên men xốp ngày càng được sử dụng rộng... thường sử dụng kỹ thuật lên men dịch thể Tuy nhiên, khi tiến hành so sánh hiệu quả của các loại hình lên men, người ta thấy hàm lượng enzyme vi sinh vật có thể sinh ra trong lên men xốp cao hơn 11 nhiều lần so với trong lên men dịch thể khi sử dụng cùng một chủng vi sinh vật trong cùng điều kiện lên men [14] Để góp phần bổ sung các số liệu cần thiết về vi c ứng dụng kỹ thuật lên men xốp trong công nghiệp... khuẩn nghiên cứu - Nghiên cứu đặc tính và tinh sạch enzyme của các chủng nghiên cứu 3 Những đóng góp mới của đề tài Đề tài chúng tôi thực hiện có kế thừa các công trình nghiên cứu đã công bố gần đây về mặt phương pháp nghiên cứu, tuy nhiên kết quả của nó hoàn toàn mới và độc lập Do đó đề tài sẽ góp phần đóng góp thêm số liệu vào cơ sở dữ liệu về quá trình sản xuất enzyme xylanase bằng kỹ thuật lên men xốp. .. khuẩn và xạ khuẩn là các nhóm quan trọng nhất, đặc biệt là nấm sợi Các nhóm vi sinh vật có khả năng sinh xylanase phân bố khá rộng rãi và tham gia tích cực vào các chu trình tuần hoàn vật chất, nhất là các quá trình phân giải chất hữu cơ để hình thành chất mùn [31] 16 Các loại xylanase được sinh ra bởi vi khuẩn và nấm sợi ưa kiềm có khả năng chịu nhiệt tốt hơn và do đó chúng được ứng dụng rộng rãi và. .. số vi sinh vật sử dụng các nguồn năng lượng tự sinh ra các loại xylanase khác nhau Các loại enzyme này ngoài chức năng phân hủy thành tế bào thực vật còn kết hợp với các enzyme thủy phân khác tham gia vào quá trình tách dòng 1.2.1 Nguồn gốc xylanase Xylanase được sinh tổng hợp bởi nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn và động vật nguyên sinh Trong các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp xylanase, nấm, vi khuẩn. .. enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật ngày càng tăng cao, đặc biệt là enzyme xylanase được sử dụng trong nhiều ngành sản xuất trên toàn thế giới [14] Trong sinh giới, động vật và thực vật không có khả năng tự sinh xylanase, do đó vai trò thủy phân xylan phụ thuộc chủ yếu vào nguồn vi sinh vật, đặc biệt quan trọng là các nhóm vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm Trước đây, vi c nghiên cứu xylanase chủ yếu được tiến... tiếp giữa cấu trúc bậc này và sự cuộn gấp của các enzyme đối với các thành vi n trong một hệ nhất định [7] Trước đây, các nhà khoa học cho rằng xylanase khác với hệ enzyme glycoside hydrolase (GHs), nhưng gần đây, người ta nghiên cứu được rằng xylanase có các đặc điểm thuộc hệ enzyme GH5, GH7, GH8, GH10, GH11 và GH43 [19] Nhưng đa phần xylanase thuộc nhóm GH10 và GH11 [21] Xylanase thuộc hệ GH10 có... dụng rộng rãi trong sản xuất cũng như trong nghiên cứu vì những ứng dụng mang tính thực tiễn và kinh tế của nó Lên men xốp được dùng trong công nghiệp chế biến và sản xuất thực phẩm chủ yếu là lĩnh vực sản xuất các loại hương liệu, sản xuất enzyme (a-amylase, fructosyl transferase, lipase, pectinase, xylanase) , các acid hữu cơ (acid lactic, acid citric) và các loại kẹo cao su [8] Trước đây, trong sản... kDa và thuộc nhóm acid xylanase Còn xylanase thuộc hệ GH11 có khối lượng phân tử lớn nhất là 30 kDa và thuộc nhóm alkaline xylanase [37] Dựa vào sự tương đồng trình tự acid amin và các kết quả phân tích về cấu trúc không gian, xylanase chủ yếu được xếp vào họ 10 và 11 của hệ enzyme thủy phân glycoside (Collin & cộng sự, 2005; Jeya & cộng sự, 2009; Sibtain & cộng sự, 2009) Xylanase cả hai họ 10 và 11