Luân văn “ Bước đầu nghiên cứu enzyme xylanolytic và cellulolytic từ một chủng vi khuẩn ưa nhiệt”

MỤC LỤC MỞ ĐẦU Cùng với phát triển nông nghiệp, hàng năm hàng triệu chất lignocellulose bắt nguồn từ hoạt động nông nghiệp, thải môi trường Điều không làm tăng thêm gánh nặng môi trường mà làm lãng phí nguồn sinh khối, cần phải thực nghiêm ngặt tiêu chuẩn việc thải chất thải vào môi trường Các phương pháp xử lý hóa học sinh học thông thường ngày khó đạt mức độ cần thiết để loại bỏ chất ô nhiễm Vì cần phải triển khai biện pháp xử lý cho vừa nhanh hơn, rẻ hơn, hiệu hơn, đáng tin cậy vừa đem lại lợi ích kinh tế Ngày nay, với phát triển khoa học kỹ thuật, công nghệ sinh học ứng dụng rộng rãi xử lý chất thải nông nghiệp Thế hệ nhiên liệu sinh học dựa đường, tinh bột dầu thực vật, nhiên chưa thực có ứng dụng rộng rãi công nghiệp Lignocellulose xem hệ nhiên liệu sinh học thứ hai Đối với môi trường ngành kinh tế, chất thải lignocellulose sử dụng nguồn nguyên liệu để sản xuất chất hóa học, nhiên liệu vật chất tương hợp khác Bên cạnh đó, nguồn nguyên liệu đặc biệt quan tâm giá thành thấp nguồn cung cấp dồi Quá trình biến đổi sinh học chất thải thành nhiên liệu mang đến lợi nhuận kinh tế môi trường [1] Lignocellulose (sinh khối thực vật) bao gồm polysaccharide chủ yếu cellulose, hemicellulose (xylan) lignin, cellulose hemicellulose chiếm tỉ lệ cao Cellulose chiếm phần lớn, khoảng từ 35% đến 50% khối lượng khô thực vật, hai hợp chất, hemicellulose lignin chiếm khoảng 20-30% 5-20% khối lượng khô thể thực vật [23] Với tính sẵn có lignocellulose trở thành nguồn lượng tái tạo dồi [36] Nhiều nghiên cứu chứng minh khả triển vọng sử dụng enzyme vào việc biến đổi sinh học chất thải lignocellulose để tạo đường đơn hữu ích từ phế phụ liệu chứa lignocellulose [3] Nhằm thu enzyme có hoạt tính thủy phân lignocellulose hiệu thành đường đơn đường đôi từ phế phụ liệu nông nghiệp, để từ đưa vào ứng dụng rộng rãi sản xuất sản phẩm có giá trị đời sống người, thực đề tài: “ Bước đầu nghiên cứu enzyme xylanolytic cellulolytic từ chủng vi khuẩn ưa nhiệt” CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cấu trúc lignocellulose 1.1.1 Cấu trúc thành tế bào thực vật Trong tự nhiên, lớp thành tế bào thực vật minh họa mô hình gỗ (Hình 1.1) Ở tế bào, có hợp chất đóng vai trò keo dán gắn kết tế bào lại với nhau, lớp gian bào (middle lamella) Lớp cấu tạo từ chất keo, có chất pectin tác động quang học Bên thành tế bào sơ cấp (primary wall) Hình 1.1: Cấu trúc thành tế bào thực vật [37] Thành tế bào sơ cấp chia thành mặt bên mặt bên Sự xếp vi sợi thành tế bào sơ cấp phân tán tăng dần từ mặt mặt Tiếp đến thành tế bào thứ cấp gồm lớp: lớp (S1), lớp (S2) lớp (S3) Sự phân chia thành tế bào thứ cấp thành ba lớp S chủ yếu định hướng khác vi sợi ba lớp Điển hình vi sợi định hướng xoắn vách tế bào Lớp thành tế bào thứ cấp, vi sợi định hướng cấu trúc xoắn chéo có độ nghiêng tạo thành góc lớn với trục dọc tế bào Lớp lớp dày lớp có góc nhỏ độ nghiêng sợi xoắn ốc vi sợi lớp xếp lớp ngoài, với góc rộng với trục dọc tế bào Ngoài số trường hợp, mặt thành tế bào có lớp sần sùi (W) Chức thành tế bào chống đỡ cho quan đặc biệt vách dày cứng Thành tế bào giữ chức quan trọng hấp thụ, thoát nước hay vận chuyển tiết Lignocellulose thành phần độ tuổi, giai đoạn sinh trưởng, phát triển cấu trúc thực vật thân gỗ điều kiện khác Thành phần thực vật khác cỏ, lúa, lignocellulose trình bày bảng ngô…Trong tự nhiên, có 1.1 [9] thể tìm thấy lignocellulose thực vật hay chất thải nông nghiệp, lâm nghiệp chất thải rắn thành phố Thành phần chủ yếu lignocellulose cellulose, hemicellulose lignin (Hình 1.2) Cellulose hemicellulose đại phân tử cấu tạo từ gốc đường khác nhau, lignin polymer dạng vòng tổng hợp từ tiền phenylpropanoid Thành phần cấu tạo phần trăm polymer khác loài Hơn nữa, thành phần cấu tạo hay khác khác dựa vào Hình 1.2: Thành phần chủ yếu lignocellulose Bảng 1.1: Thành phần lignocellulose rác thải phế phụ liệu nông nghiệp phổ biến [9] Nguồn lignocellulose Cellulose (%) Hemicellulose (%) Lignin (%) Thân gỗ cứng 40-55 24-40 18-25 Thân gỗ mềm 45-50 25-35 25-35 Vỏ lạc 25-30 25-30 30-40 Lõi ngô 45 35 15 Giấy 85-99 0-15 Vỏ trấu 32.1 24 18 Vỏ trấu lúa mì 30 50 15 Rác phân loại 60 20 20 Lá 15-20 80-85 Hạt 80-95 5-20 Giấy báo 40-55 25-40 18-30 Giấy thải từ bột giấy hóa học 60-70 10-20 5-10 Chất rắn nước thải ban đầu 8-15 - 24-29 Chất thải lợn 28 - Phân bón gia súc 1.6-4.7 1.4-3.3 2.7-5.7 Cỏ bờ biển Bermuda 25 35.7 6.4 Cỏ mềm 45 31.4 12.0 Các loại cỏ (trị số trung bình cho loại) 25-40 25-50 10-30 Bã thô 33.4 30 18.9 Lượng lớn lignocellulose thải từ ngành lâm nghiệp, nông nghiệp, công nghiệp giấy gây ô nhiễm môi trường Tuy nhiên, lượng lớn sinh khối thực vật dư thừa coi rác thải biến đổi thành nhiều sản phẩm có giá trị khác nhiên liệu sinh học, hóa chất, nguồn lượng rẻ cho trình lên men, bổ sung chất dinh dưỡng cho người thức ăn cho động vật [15] 1.1.2 Cellulose Cellulose hợp chất hữu có công thức cấu tạo (C 6H10O5)n, thành phần chủ yếu thành tế bào thực vật, gồm nhiều cellobiose liên kết với nhau, 4-O- (β-DGlucopyranosyl)-D-glucopyranose (Hình 1.3) Cellulose hợp chất hữu nhiều sinh quyển, hàng năm thực vật tổng hợp khoảng 10 11 cellulose (trong gỗ, cellulose chiếm khoảng 50% chiếm khoảng 90%) Hình 1.3: Công thức hóa học cellulose Các mạch cellulose liên kết với nhờ liên kết hydro liên kết van Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc tinh thể vô định hình Trong vùng tinh thể, phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, vùng khó bị công enzyme hóa chất Ngược lại, vùng vô định hình, cellulose liên kết không chặt với nên dễ bị công [40] Có hai mô hình cấu trúc cellulose đưa nhằm mô tả vùng tinh thể vô định hình 1.4 [29] Hình 1.4: Mô hình Fringed fibrillar mô hình chuỗi gập Trong mô hình Fringed Fibrillar: phân tử cellulose kéo thẳng định hướng theo chiều sợi Vùng tinh thể có chiều dài 500 Å xếp xen kẽ với vùng vô định hình Trong mô hình chuỗi gập: phân tử cellulose gấp khúc theo chiều sợi Mỗi đơn vị lặp lại có độ trùng hợp khoảng 1000, giới hạn hai điểm a b hình vẽ Các đơn vị xếp thành chuỗi nhờ vào mạch glucose nhỏ, vị trí dễ bị thủy phân Đối với đơn vị lặp lại, hai đầu vùng vô định hình, vào giữa, tính chất kết tinh cao Trong vùng vô định hình, liên kết β - glycoside monomer bị thay đổi góc liên kết, cuối đoạn gấp, phân tử monomer xếp tạo thay đổi 180o cho toàn mạch Vùng vô định hình dễ bị công tác nhân thủy phân vùng tinh thể thay đổi góc liên kết liên kết cộng hóa trị (β - glycoside) làm giảm độ bền liên kết, đồng thời vị trí không tạo liên kết hydro [2] Cellulose có cấu tạo tương tự carbohydrate phức tạp tinh bột glycogen Các polysaccharide cấu tạo từ đơn phân glucose Cellulose glucan không phân nhánh, gốc glucose kết hợp với qua liên kết β- 1 4- glycoside, khác biệt cellulose phân tử carbohydrate phức tạp khác Giống tinh bột, cellulose cấu tạo thành chuỗi dài gồm 500 phân tử glucose Các chuỗi cellulose xếp đối song song tạo thành vi sợi cellulose có đường kính khoảng 3,5 nm Mỗi chuỗi có nhiều nhóm OH tự do, sợi cạnh kết hợp với nhờ liên kết hidro tạo thành nhóm OH chúng Các vi sợi lại liên kết với tạo thành vi sợi lớn hay gọi bó mixen có đường kính 20 nm, sợi mixen có khoảng trống lớn Khi tế bào non, khoảng chứa đầy nước, tế bào già chứa đầy lignin hemicellulose Cellulose có cấu trúc bền khó bị thủy phân Người động vật enzyme phân giải cellulose (cellulase) nên không tiêu hóa cellulose, cellulose giá trị dinh dưỡng Tuy nhiên, số nghiên cứu cho thấy cellulose có vai trò điều hòa hoạt động hệ thống tiêu hóa Vi khuẩn cỏ gia súc, động vật nhai lại động vật nguyên sinh ruột mối sản xuất enzyme phân giải cellulose Nấm đất phân hủy cellulose Vì chúng sử dụng cellulose làm thức ăn 1.1.3 Lignin Lignin phức hợp chất hóa học phổ biến tìm thấy hệ mạch thực vật, chủ yếu tế bào, thành tế bào thực vật Lignin polymer hữu phổ biến trái đất Lignin có cấu trúc không gian chiều, phức tạp, vô định hình, chiếm 17% đến 33% thành phần gỗ Lignin carbohydrate có liên kết chặt chẽ với nhóm để tạo nên màng tế bào giúp thực vật cứng giòn, có chức vận chuyển nước thể thực vật (một phần để làm bền thành tế bào giữ cho không bị đổ, phần điều chỉnh dòng chảy nước), giúp phát triển chống lại công côn trùng mầm bệnh Thực vật già, lượng lignin tích tụ lớn Hơn nữa, lignin đóng vai trò quan trọng chu trình carbon, tích lũy carbon khí mô thực vật thân gỗ lâu năm, thành phần bị phân hủy lâu thực vật sau chết, để đóng góp phần lớn chất mùn giúp tăng khả quang hợp thực vật Lignin polyphenol có cấu trúc mở Trong tự nhiên, lignin chủ yếu đóng vai trò chất liên kết thành tế bào thực vật, liên kết chặt chẽ với mạng cellulose hemicellulose Rất khó để tách lignin hoàn toàn Lignin polymer, cấu thành từ đơn vị phenylpropene, vài đơn vị cấu trúc điển hình là: guaiacyl (G), trans-coniferyl alcohol; syringyl (S), trans-sinapyl alcohol; p-hydroxylphenyl (H), trans-p-courmary alcohol (Hình 1.5) Hình 1.5: Các đơn vị lignin [14] Cấu trúc lignin đa dạng, tùy thuộc vào loại gỗ, tuổi cấu trúc gỗ Ngoài việc phân loại theo lignin gỗ cứng, gỗ mềm cỏ, lignin phân thành hai loại chính: guaicyl lignin guaicyl-syringyl lignin Gỗ mềm chứa chủ yếu guaiacyl, gỗ cứng chứa chủ yếu syringyl Các nghiên cứu guaiacyl lignin hạn chế trương nở xơ sợi loại nguyên liệu khó bị công enzyme syringyl lignin [29] Những nghiên cứu gần lignin hoàn toàn không đồng cấu trúc Lignin dường bao gồm vùng vô định hình vùng có cấu trúc hình 10 Chúng nhận thấy trình tự đoạn gen mã hóa cho ARN ribosome 16S chủng NKP13 có 98% giống với đoạn gen mã hóa cho ARN ribosome 16S vi khuẩn Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum HM585225 công bố ngân hàng gen giới (Hình 3.10) Hình 3.10: Cây phân loại chủng Thermoanaerobacterium 3.3 Nghiên cứu phức hệ enzyme xylanolytic-cellulolytic chủng NKP13 3.3.1 Khả sinh tổng hợp xylase CMCase Để đánh giá khả sinh tổng hợp enzyme xylase CMCase theo thời gian, chủng NKP13 nuôi cấy môi trường BM 60oC, lắc 200 vòng/phút Dịch enzyme thu thời gian khác (từ đến ngày) để xác định hoạt độ enzyme Trong trình sinh trưởng chủng vi khuẩn, enzyme xylanase cellulase ngoại bào tăng giải phóng enzyme từ tế bào vào môi trường nuôi cấy Kết phân tích (Hình 3.11) cho thấy, hoạt độ enzyme CMCase cao hoạt độ enzyme xylanase, điều khả liên kết với tế bào xylanase mạnh CMCase Sau ngày hoạt độ enzyme tăng nhanh Hoạt độ xylanase đạt 30 U/l hoạt độ CMCase đạt 43 U/l Sau hoạt độ enzyme tăng chậm ngày hoạt độ enzyme đạt tối đa (xylanase: 47 U/l; CMCase: 58 U/l) Sau ngày hoạt độ enzyme giảm dần Như vậy, thời gian thích hợp cho chủng NKP13 sinh tổng hợp xylanase CMCase ngày Hình 3.11: Khả sinh tổng hợp xylanase, cellulase, protein đường khử chủng NKP13 nuôi cấy điều kiện kỵ khí với vỏ ngô nguồn chất Trong thời gian, nồng độ protein môi trường nuôi cấy tăng với sinh trưởng vi khuẩn Quá trình sản sinh enzyme xylanase cellulase liên quan tới nồng độ protein môi trường nuôi cấy Lượng đường khử giải phóng môi trường tăng lên tới khoảng 0,3 g/l ngày nuôi cấy thứ theo trình sinh trưởng vi khuẩn Tuy nhiên, sau ngày nuôi cấy, lượng đường giảm nhẹ, đến ngày thứ lượng đường khử lại khoảng 0,15 g/l (Hình 3.11), điều lượng đường chủng vi khuẩn sử dụng để tiếp tục tăng trưởng Môi trường nuôi cấy vi khuẩn với vỏ ngô làm chất sau ngày đem ly tâm thu dịch tủa để xác định khả sinh tổng hợp hệ enzyme xylanolytic cellulolytic Kết cho thấy, chủng NKP13 có khả sinh hệ enzyme xylanolytic cellulolytic Do đó, hệ enzyme không thủy phân vỏ ngô mà thủy phân nhiều chất khác Bảng 3.3: Hoạt tính enzyme dịch enzyme thô chủng vi khuẩn NKP13 sản sinh mọc môi trường chứa vỏ ngô Hệ enzyme xylanolytic Xylanase Arabinofuranosidas e β-xylosidase Acetyl esterase Hoạt độ enzyme/ protein tổng số (U/g protein) 16,25 4,21 1,63 0,018 Hệ enzyme cellulolytic CMCase Avicelase β-glycosidase Cellobiohydrolase Hoạt độ enzyme/ protein tổng số (U/g protein) 20,16 0,19 1,18 0,067 3.3.2 Ảnh hưởng pH lên hoạt độ xylanase CMCase 3.3.2.1 pH phản ứng tối ưu pH môi trường có ảnh hưởng lớn tới hoạt tính xúc tác enzyme, ảnh hưởng tới mức độ ion hóa chất, enzyme ảnh hưởng tới độ bền enzyme Để khảo sát pH tối ưu enzyme xylanase CMCase, phản ứng enzyme với chất CMC (đối với enzyme CMCase) chất xylan lúa mạch (đối với enzyme xylanase) Cơ chất pha đệm có pH khác từ pH đến pH 50 oC sau phút ủ Hình 3.12: Ảnh hưởng độ pH hoạt tính enzyme Hoạt độ xylanase đạt cực đại pH tương đối cao pH (hoạt độ enzyme đạt 90%) Còn hoạt độ CMCase đạt cực đại pH giảm nhẹ pH (93%) pH hoạt độ enzyme đạt 70% (Hình 3.12) 3.3.2.2 Độ bền pH pH ảnh hưởng tới độ bền enzyme, nên việc lựa chọn pH thích hợp để bảo quản enzyme quan trọng Tùy loại protein enzyme mà có độ bền môi trường pH định Ở độ bền enzyme xylanase CMCase khảo sát đệm khác với dải pH từ pH đến pH Hình 3.13: Ảnh hưởng độ pH đến độ bền enzyme Kết cho thấy sau 30 phút ủ, có pH hoạt độ tương đối enzyme xylanase CMCase đạt cực đại Ở pH riêng hoạt độ xylanase giữ 90%, pH lại giảm mạnh loại enzyme, giảm mạnh pH trở lên, hoạt độ enzyme lại khoảng 35% Như vậy, xylanase CMCase chủng NKP13 bền pH sau 30 phút ủ (Hình 3.13) 3.3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt độ enzyme xylanase CMCase độ bền nhiệt enzyme 3.3.3.1 Nhiệt độ phản ứng tối ưu Nhiệt độ phản ứng ảnh hưởng mạnh tới tốc độ xúc tác thủy phân chất enzyme Mỗi enzyme có nhiệt độ phản ứng thích hợp Để nghiên cứu nhiệt độ enzyme tối ưu xylanase CMCase, dịch enzyme tinh chất xylan lúa mạch (đối với xylanase) CMC (đối với CMCase) ủ nhiệt độ khác từ 40oC đến 90oC, pH phút Hình 3.14: Ảnh hưởng nhiệt độ hoạt tính enzyme Hoạt độ enzyme tăng dần khoảng từ 10-100% dải nhiệt độ từ 40-70 oC đạt tối đa 70oC Khi nhiệt độ tiếp tục tăng hoạt độ enzyme giảm dần, đạt 61% 80oC; 20% 90oC enzyme CMCase 23% 80 oC; 10% 90oC enzyme xylanase (Hình 3.14) 3.3.3.2 Độ bền nhiệt Dưới tác động nhiệt độ, enzyme bị biến tính nhiều bị ảnh hưởng tới hoạt tính Một số liên kết hydro tham gia vào giữ vững cấu trúc trung tâm hoạt động enzyme bị đứt gãy nhiệt độ Mức độ ảnh hưởng tùy thuộc vào thời gian nhiệt độ ủ enzyme Dịch enzyme tinh ủ nhiệt độ khác (40 oC đến 90oC) 30 phút ủ Hình 3.15: Ảnh hưởng nhiệt độ độ bền enzyme Kết thu hình 3.15 cho thấy, xylanase trì gần 100% hoạt độ 60oC, sau hoạt độ enzyme giảm dần nhiệt độ tăng Còn hoạt độ CMCase gần 100% hoạt độ 50oC, hoạt độ enzyme giảm dần 73% nhiệt độ tăng lên 60oC Hoạt độ enzyme hoàn toàn bị xử lý 90oC (Hình 3.14) Với kết thu thấy rằng, enzyme xylanase CMCase chủng vi khuẩn NKP13 bền với nhiệt Một số nghiên cứu cho biết vài enzyme cellulase từ vi khuẩn chịu nhiệt khác C Thermocellum [21,28] loài Thermoactinomyces [13] với nhiệt độ tối ưu 70oC Các enzyme chịu nhiệt có đặc tính có lợi cho ứng dụng lĩnh vực chế biến số ứng dụng công nghệ sinh học khác 3.3.4 Khả thủy phân nguyên liệu lignocellulose enzyme Lignocellulose nguồn nguyên liệu thô dồi tái tạo sẵn có Tuy vậy, polymer cần biến đổi thành đường đơn giản thông qua trình thủy phân Quá trình thủy phân làm thay đổi đặc tính lignocelluloses, đưa chúng dạng dễ xử lý chuyển thành sản phẩm có giá trị Phương pháp ứng dụng nhiều thủy phân hóa học thủy phân enzyme Ngày nay, phương pháp thủy phân enzyme ứng dụng rộng rãi, có hiệu kinh tế Chính muốn khảo sát khả thủy phân lignocellulose hệ enzyme xylanolytic-cellulolytic Ba loại lignocellulose dùng nghiên cứu là: vỏ ngô, lõi ngô bã mía Cả ba loại lignocellulose thủy phân môi trường đệm phosphate trung tính 50oC Sản phẩm thủy phân thu vào khoảng thời gian khác nhau: 10 phút; 20 phút; 30 phút; 40 phút; 50 phút; 60 phút xác định thông qua lượng đường khử giải phóng môi trường nuôi cấy Kết thu hình 3.16 cho thấy, NKP13 sản sinh enzyme thủy phân ba loại lignocellulose, khả phân hủy vỏ ngô enzyme cao (lượng đường khử = 52,0 mg/l) sau nuôi cấy, tiếp đến enzyme thủy phân bã mía (45 mg/l) lõi ngô (23 mg/l) Qua đó, kết luận enzyme NPK13 tạo có khả thủy phân cellulose hemicellulose có hợp chất lignocellulose Hình 3.16: Quá trình thủy phân lignocellulose enzyme chủng NKP13 50oC Tiếp theo, chọn sản phẩm thủy phân từ vỏ ngô đem phân tích phương pháp sắc ký mỏng (TLC) để xác định số lượng đường từ enzyme thủy phân G1 G2 X1 X2 xylooligosaccharide Hình 3.17: Kết sắc ký mỏng sản phẩm thủy phân vỏ ngô enzyme chủng vi khuẩn NKP13 Trong đó: Cột 1: Thang chuẩn glucose (G1) cellobiose (G2) Cột 2: Thang chuẩn xylose (X1), xylobiose (X2) xylooligosaccharide Cột 3: Sản phẩm thủy phân vỏ ngô enzyme Kết sắc ký mỏng cho thấy enzyme chủng vi khuẩn NKP13 có khả thủy phân phế thải nông nghiệp thành loại đường đơn giản đường xylose, xylobiose đường xylooligosaccharide (Hình 3.17) Các loại đường sử dụng để sản xuất sản phẩm có giá trị ethanol, thức ăn cho động vật chất dinh dưỡng cho người 3.3.5 Điện di chế phẩm enzyme gel polyacrylamide có SDS Thành phần protein phức hệ enzyme tách chiết từ dịch enzyme thô phân tích điện di native-PAGE, SDS-PAGE zymogram Trong đó, có sử dụng xylan hòa tan CMC làm chất để xác định hoạt độ enzyme phân đoạn chế phẩm Kết điện di native-PAGE kiểm tra enzyme tách chiết (Hình 3.18A, cột 2) cho thấy có băng với khối lượng phân tử cao Hơn nữa, qua trình chạy điện di SDS-PAGE protein có gắn cellulose đưa 10 băng với kích thước từ 44 đến 225 kDa (Hình 3.18B, cột 2), zymogram xác định enzyme xylanase CMCase enzyme thu gồm xylanase (Hình 3.18C, cột 3) CMCase (Hình 3.18C, cột 4) Kết cho thấy enzyme sản sinh chủng vi khuẩn NKP13 phức hệ enzyme 225 150 100 75 50 35 25 50 64 84 72 125 137 185 97 225 64 84 125 137 M kDa 185 97 225 225 185 137 125 50 44 64 72 84 97 A B Hình 3.18: Kết phân tích protein enzyme tách chiết từ dịch thô điện di native-PAGE (A), SDS-PAGE (B) Zymogram enzyme xylanase CMCase (C) Trong đó, Cột 1: enzyme thô; Cột 2: Protein liên kết cellulose; Cột 3: Xylanase; Cột 4: CMCase; Cột M: Marker tiêu chuẩn Chủng vi khuẩn NKP13 sản xuất hệ thống enzyme xylanolytic-cellulolytic ngoại bào gồm enzyme xylanase enzyme CMCase mọc môi trường có vỏ ngô làm chất Các enzyme xếp phức hệ enzyme mà thủy phân chất thải lignocellulose chúng có khả kết dính vào cellulose xylan thông qua vị trí gắn cellulose xylan [5,30] Dạng phức hệ enzyme cellulase xylanase hoạt động tương tác lẫn suốt trình thủy phân hợp chất không tan Hơn nữa, số tài liệu tham khảo đề cập dựa vào nhân tố kết dính cellulose xylan mà số vi sinh vật sản sinh phức hệ enzyme xylanolytic-cellulolyitc thủy phân chất thải lignocellulose cách hiệu C thermocellum, C cellulovorans [6,27] KẾT LUẬN Từ kết thu trình nghiên cứu nêu trên, rút số kết luận sau: Đã phân lập số chủng vi khuẩn, có chủng NKP13 có khả phân giải lignocellulose từ 34 mẫu vi khuẩn thu thập Đoạn gen mã hóa cho ARNr 16S NKP13 nhân lên PCR, nhân dòng, xác định trình tự nucleotide cho thấy tương đồng tới 98% so với trình tự đoạn gen tương ứng từ loài vi khuẩn Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum HM585225 công bố ngân hàng gen giới Chủng vi khuẩn NKP13 sinh trưởng môi trường có chất vỏ ngô điều kiện kỵ khí có khả sinh enzyme xylanolytic CMCase Sản phẩm thủy phân vỏ ngô enzyme đường xylose, xylobiose xylooligosaccharide Đã phát thấy 10 băng protein khác chế phẩm enzyme xylanolytic cellulolytic NKP13 phân tích điện di gel polyacrylamide có SDS, dùng zymogram phát thấy có mặt băng xylanase băng CMCase chế phẩm KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu khả sử dụng phức hệ enzyme phân giải lignocellulose chủng NKP13 công nghiệp xử lý phế phụ liệu nông nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO I.TÀI LIỆU TRONG NƯỚC Vũ Thị Minh Đức (2001) Thực tập Vi sinh vật học Nhà xuất ĐHQGHN Nguyễn Đức Lượng, Công nghệ enzyme, Nhà xuất Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, 2001 Trần Đình Toại, Trần Thị Hồng (2007),”Tương lai ứng dụng Enzyme xử lý phế thải”, Tạp chí Khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội, Khoa học Tự nhiên Công nghệ 23: 75-85 II TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI Baipai P (1997).“Microbial xylanolytic enzyme system: Properties and applications” Adv Appl Microbiol 43: 141-194 Bayer E.A., Morag E., and Lamed R (1994).“The cellulosome: a treasure trove for biotechnology” Trends Biotechnol 12: 379-386 Bayer E.A., Kenig R., Lamed R (1983).”Adherence of Clostridium thermocellum to cellulose” J Bacteriol 156: 818-827 Beily P (1985) “Microbial xylanolytic systems” Trends Biotechnol., 3: 286-290 Beltrame P.L., Carnitti P., Focher B (1984).” Enzymatic hydrolysis of cellulosic materials: a kinetic study” Biotechnol Bioeng 31:160-167 Betts W.B., Dart R.K., Ball A.S., Pedlar S.L (1991).“Biosynthesis and Structure of lignocellulose” In Betts (eds) Biodegradation: Natural and Synthetic Materials Springer-Verlag, Berlin, Germany: 139-155 10 Collins T., Gerday C., Feller G (2005).“Xylanases, xylanase families and extremophilic xylanases” FEMS Microbiol Rev., 29:3-23 11 Coughlan M.P and Hazlewood G.P (1993),“B-1,4-d-xylan degrading enzyme systems: Biochemistry, molecular biology and applications”, Biotechnol Appl Biochem 17: 259-289 12 Elberson M.A., Malekzadeh F., Yazdi M.T., Kameranpour N., Noori-Daloii M.R., Matte M.H., Shahamat M., Colwell R.R., Sowers K.R (2000) “Cellulomonas persica sp nov and Cellulomonas iranensis sp nov., mesophilic cellulose-degrading bacteria isolated from forest soils” J Syst Evol Microbiol :993 13 Hagerdal B.G.R., Ferchak J.D., Pye E.K and Forro J.R (1979) “The cellulolytic enzyme system of Thermoactinomyces in hydrolysis of cellulose: mechanisms of enzymatic and acid catalysis”, Adv Chem Ser 181:331-345 14 Higuchi T (1978) “Lignin structure and morphological distribution in plant cell walls”, in Lignin Biodegradation: Microbiology, Chemistry, and Potential Applications Vol 1, CRC Press Inc., Boca Raton: 1-17 15 Howard R.L., Abotsi E., Jansen van Rensburg and Howard S (2003) “Lignocellulose biotechnology: issues of bioconversion and enzyme production” African Journal of Biotechnology, 2: 602 – 619 16 Kohring S., Weigel J., and Mayer F (1990) “Subunit composition and glycosidic activities of the cellulase complex from Clostridium thermocellum JW20” Appl Environ Microbiol 56: 3798-3804 17 Kubata B.K., Suzuki T., Horitsu H., Kawai K., and Takamizawa K (1994) “Purification and characterization of Aeromonas caviae ME-1 xylanase V, which produces exclusively xylobiose from xylan”, Appl Environ Microbiol 60: 531-535 18 Kyu K.L., Ratanakhanokchai K., Uttapap D and Tanticharoen M (1994) “Induction of xylanase in Bacillus circulans B6” Biores Technol 48: 163-167 19 Laemmli U.K (1970) “Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4” Nature (London) 227:680–685 20 Lee S.F., Forsberg C.W and Rattray J.B (1987) “Purification and characterization of two endoxylanases from Clostridium acetobytylicum ATCC 824”, Appl Environ Microbiol., 53: 644-650 21 Lee B.H., and Blackburn T.H (1975) “Cellulase production by a thermophilic Clostridium species” Appl Microbiol 30:346-353 22 Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L and Randall R J (1951) “Protein measurement with the Folin phenol reagent” J Biol Chem 193:265–275 23 Lynd L.R., Cushman J.H., Nichols R.J., and Wyman C.E (1991) “Fuel ethanol from cellulosic biomass”, Science 251: 1318-1323 24 Lynd L.R., Weimer P.J., Zyl van W.H and Pretorius I.S (2002) “Microbial cellulose utilization: fundamentals and biotechnology” Microbiol Mol Biol Rev 66: 506-577 25 Mackenzie C.R., Bilous D., Scheneider H., Johnson R.J (1987) “Induction of cellulolytic and xylanolytic enzyme systems in Streptomyces spp.” Appl Environ Microbiol 53: 2835-2839 26 Marchesi J R., Sato T., Weightman A J (1998) “Design and evaluation of useful bacterium – specific PCR primers that amplify genes coding for bacterial 16S rRNA” Appl Environ Microbiol 64(2): 795-799 27 Matano Y., Park J.S., Goldstein M.A., Doi R.H (1994) “Cellulosome promotes extracellular assembly of Clostridium cellulovorans cellulosomes”, J Bacteriol 176: 6952-6956 28 Ng T.K., Weimer P.J., and Zeikus J.G (1977) “Cellulolytic and physiological properties of Clostridium thermocellum”, Arch Microbiol 114:1-7 29 Palonen H (2004) “ Role of lignin in the enzymatic hydrolysis of lignocellulose”, VTT Biotechnology: 11-39 30 Pason P., Kyu K.L., and Ratanakhanokchai K (2006) “Paenibacillus curdlanolyticus strain B-6 xylanolytic-cellulolytic enzyme system that degrades insoluble polysaccharides” Appl Environ Microbiol 72: 2483-2490 31 Poutanen K., Sundberg M., Korte H and Puls J (1990) “Deacetylation of xylans by acetyl esterases of Trichoderma reesei” Appl Microbiol Biotechnol 33: 506-510 32 Puls J and Schuseil J (1993) “Chemistry of hemicelluloses: relationship between hemicellulose structure and enzymes required for hydrolysis”, in Hemicellulose and Hemicellulases, Coughlan, M.P., and Hazlewood, G.P (Eds) Protland Press Ltd, London: 1-28 33 Ratanakhanokchai K., Kyu K.L and Tanticharoen M (1999) “Purification and properties of a xylan-binding endoxylanase from alkaliphilic Bacillus sp strain K-1” Appl Environ Microbiol 65:694–697 34 Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T (1989) “Molecular cloning I, II, III: A Laboratory Mannual Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1.21-1.101, 13.11-13.18, 17.3-17.32 35 Sato T., Hu JP., Ohki K., Yamaurra M., Washio J., Matsuyama J., Takahashi N., (2003), “Identification of mutans streptococci by restriction fragment length polymorphism analysis of polymerase chain reaction – amplified 16S ribosomal RNA genes” Oral Microbiol Immunol., 18: 323-326 36 Schwarz W.H (2001) “The cellulosome and cellulose degradation by anaerobic bacteria” Appl Microbiol Biotechnol 56: 634-649 37 Sjostrom E (1993) “Wood chemistry: fundamentals and applications” nd ed., Academic Press, San Diego: 1-70 38 Somogyi M (1952) “ Notes in sugar determination” J Biol Chem 195: 265-275 39 Sunna A and Antranikian G (1997) “Xylanolytic enzymes from fungi and bacteria” Critical Rev Biotechnol., 17: 39-67 40.Wyman C.E (1996) “Handbook on Bioethanol: Product and Utilization”, Taylor&Francis: 119-285 [...]... ml aceton và 30 ml axit phosphoric 80% [33] Đường glucose, cellobiose, xylose và xylooligosaccharide được dùng làm chất chuẩn 34 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 3.1.1 Sàng lọc và phân lập vi khuẩn kị khí xylanolytic- cellulolytic ưa nhiệt Sàng lọc các vi khuẩn ưa nhiệt kỵ khí bằng môi trường làm giàu và nuôi cấy ở nhiệt độ cao 34 mẫu đất được thu thập ngẫu nhiên từ nông trường ở vài tỉnh... trưởng của vi khuẩn được quan sát hàng ngày và các bước sàng lọc được tiến hành vài lần cho đến khi thu được kết quả tốt Sau đó 1 ml mỗi mẫu được dàn đều lên đĩa thạch 2,5% với môi trường tương tự như trên có chứa bã giấy 1% rồi ủ ở 60oC từ 2-3 ngày trong buồng cấy kị khí Các khuẩn lạc được sàng lọc vài lần đến khi được tinh sạch 2.2.2 Nhận dạng chủng vi khuẩn kị khí xylanolytic- cellulolytic ưa nhiệt... giải phóng phân tử D-glucose từ đường cellodextrin hòa tan và một loạt các glucoside khác Hình 1.9: Tác dụng của từng enzyme trong cellulose 18 1.2.2 Enzyme xylanolytic Do tính không đồng nhất của xylan, sự thủy phân của nó đòi hỏi các ảnh hưởng của một hệ thống enzyme phức tạp Enzyme này thường bao gồm hai loại: enzyme không phân nhánh (β-1,4-endoxylanse, β-xylosidase) và enzyme phân nhánh (αarabinofuranosidase,... vi sinh vật cellulolytic và xylanolytic không ở trong môi trường riêng biệt mà chúng tồn tại cùng với các loài khác như nấm và vi khuẩn Các chủng này sẽ đóng vai trò như trung tâm thủy phân polymer để tạo ra đường và các sản phẩm thủy phân khác 1.2.1 Enzyme cellulolytic Enzyme thủy phân cellulose có khả năng thủy phân chất thải chứa cellulose, chuyển hóa các hợp chất kiểu lignocellulose và cellulose... Phương pháp nghiên cứu Sàng lọc và phân lập vi khuẩn kị khí xylanolytic- cellulolytic ưa nhiệt Vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường cơ bản gồm K 2HPO4 0,15g/l, KH2PO4 0,29g/l, urea 0,21g/l, cao nấm men 0,45g/l, muối khoáng 0,02%, resazurin 0,0025%, 24 cystein 0,004% và giấy lọc 1% làm cơ chất Môi trường được xử lý bằng dòng khí nitơ để loại bỏ khí oxi tạo môi trường kị khí, sau đó khử trùng và ủ ở 60... các enzyme khác nhau để thủy phân hiệu quả hơn Mỗi polymer bị thủy phân bởi một số vi sinh vật sản xuất các enzyme hoạt động hỗ trợ nhau Nếu đúng như vậy, điều này có thể giúp chúng ta giải thích được tại sao vi sinh vật cellulolytic tổng hợp đặc trưng nhiều enzyme cellulase khác nhau có tính đặc hiệu gối nhau và tại sao một số enzyme xylanase lại mang vùng liên kết cơ chất gần với cellulose Các vi. .. được chứng minh là sinh ra từ một số loài vi khuẩn và nấm [20,31] 1.3 Ứng dụng của enzyme lignocellulolytic Thế hệ nhiên liệu sinh học đầu tiên dựa trên đường, tinh bột và dầu thực vật, không có được những ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp, vì các nguyên vật liệu này cũng được sử dụng làm thức ăn Lignocellulose được xem là thế hệ nhiên liệu sinh học thứ hai Trong thập kỷ qua, enzyme thủy phân lignocellulose... vùng miền Phetchaburi, Nakorn Pathorn và Nakorn Ratchasrima tại Thái Lan Trong nghiên cứu này, các chủng vi khuẩn kỵ khí được phân lập từ 34 mẫu đất ở các vùng nông nghiệp và các mẫu này được thu thập ở độ sâu ít nhất là 1 mét, sau đó được bảo quản ở -4oC trong điều kiện kỵ khí Trong 34 mẫu đó có 10 mẫu được lấy ở tỉnh Phetchaburi, 10 mẫu ở Nakorn Ratchasrima và 14 mẫu ở Nakorn Pathorn 2.1.2 Hóa chất... xylan, chỉ có một vài enxyme đã được cô lập và mô tả Có hai loại enzyme arabinase, các enzyme α-L-arabinofuranosidase ngoại bào (EC 3.2.1.55) hoạt hóa ngược lại với pnitrophenly-α-L-arabinofuranoside và trên các arabinan phân nhánh, và các enzyme 1,5-alpha-L-arabinase nội bào (EC3.2.1.99), chỉ hoạt hóa các arabinan dạng thẳng α-L-Arabinofuranosidase có khả năng thủy phân cả hai liên kết 1,3- và 1,5-α-Larabinofuranosyl... giữa axit glucuronic và gốc xylose trong phân tử glucuronoxylan Tính đặc hiệu của α-glucuronidase là khác nhau phụ thuộc vào nguồn gốc của enzyme 21 Esterase acetylxylan Enzyme esterase acetylxylan là enzyme có thể cắt đứt giữa các nhóm acetyl với 2 hoặc 3 vị trí của gốc xylose và góp phần đóng vai trò thủy phân xylan trong tự nhiên [8] Trong các nghiên cứu trước đó đã chứng minh được enzyme này được chứng