CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Sàng lọc và phân lập vi khuẩn kị khí xylanolytic-cellulolytic ưa nhiệt 1. Sàng lọc các vi khuẩn ưa nhiệt kỵ khí bằng môi trường làm giàu và
nuôi cấy ở nhiệt độ cao
34 mẫu đất được thu thập ngẫu nhiên từ nông trường ở vài tỉnh khác nhau tại Thái Lan và được đặt tên theo từng vùng (NKP: Nakorn Pathorn; PB: Phetchaburi;
NRS: Nakorn Ratchasrima). Từ các mẫu thu thập, chúng tôi tiến hành sàng lọc để thu vi khuẩn ưa nhiệt, kỵ khí bằng môi trường làm giàu trung tính ở 60oC. Các hiện tượng như bọt khí hay mùi của môi trường được quan sát qua quá trình phân hủy sinh khối cellulose trong mụi trường. Quỏ trỡnh sinh trưởng tương đối từ cỏc mẫu được theo dừi từng ngày và kết quả (Bảng 3.1) cho thấy ở lần nuôi cấy thứ nhất có 22 mẫu vi khuẩn sinh trưởng được.
Trong số này có các mẫu: PB3, NKP1, NKP2, NKP3, NKP4, NKP5, NKP6, NKP7, NKP11, NKP12, NKP13, NKP14, NRS7 là sinh trưởng mạnh hơn cả .
Khi quan sát được quá trình sinh trưởng của vi khuẩn, chúng tôi tiến hành sàng lọc vài lần bằng cách lấy 1 ml mẫu của lần sàng lọc trước cấy vào môi trường tương tự và nuôi cấy cùng điều kiện. Sau 4 lần sàng lọc, chúng tôi chọn ra được 7 mẫu: NKP2, NKP3, NKP4, NKP6, NKP11, NKP13 và NKP14 có khả năng sinh trưởng tốt hơn cả (Bảng 3.2).Bảng 3.1: Quá trình sinh trưởng của vi khuẩn từ các được mẫu thu thập
ở các vùng khác nhau
Mẫu Sinh trưởng Mẫu Sinh trưởng
PB 1 - NKP 8 +
PB 2 - NKP 9 +
PB 3 ++ NKP 10 +
PB 4 + NKP 11 +++
PB 5 + NKP 12 ++
PB 6 - NKP 13 ++
PB 7 - NKP 14 ++
PB 8 + NRS 1 +
PB 9 - NRS 2 -
PB 10 - NRS 3 -
NKP 1 ++ NRS 4 -
NKP 2 ++ NRS 5 -
NKP 3 +++ NRS 6 +
NKP 4 +++ NRS 7 ++
NKP 5 +++ NRS 8 +
NKP 6 +++ NRS 9 -
NKP 7 ++ NRS 10 -
Ghi chú: +: sinh trưởng; -: không sinh trưởng
Bảng 3.2: Kết quả theo dừi quỏ trỡnh sinh trưởng của cỏc khuẩn lạc ở lần sàng lọc thứ 4
Khuẩn lạc Sinh trưởng Khuẩn lạc Sinh trưởng Khuẩn lạc Sinh trưởng
NKP 2 - 1 + NKP 3 - 3 - NKP 4- 5 -
NKP 2- 2 + NKP 3 - 4 - NKP 14- 1 +
NKP2 - 3 + NKP 3 - 5 - NKP 14- 2 +
NKP 2- 4 + NKP 13 - 1 + NKP 14- 3 +
NKP 2 - 5 - NKP 13 - 2 + NKP 14- 4 +
NKP 11 - 1 + NKP 13 - 3 + NKP 14- 5 -
NKP 11 - 2 + NKP 13 - 4 + NKP 6 - 1 +
NKP 11 - 3 - NKP 13 - 5 - NKP 6 - 2 +
NKP 11 - 4 - NKP 4- 1 + NKP 6 - 3 -
NKP 11 - 5 - NKP 4- 2 + NKP 6 - 4 -
NKP 3 - 1 + NKP 4- 3 + NKP 6 - 5 -
NKP 3 - 2 + NKP 4- 4 + NKP 6 - 6 -
Ghi chú: +: sinh trưởng; -: không sinh trưởng
Từ các mẫu đã sàng lọc, chúng tôi tiến hành phân lập vi khuẩn trên môi trường agarose 2,5% và bã giấy 1% làm cơ chất rồi ủ ở 60oC trong hộp kỵ khí (Hình 3.1).
Hình 3.1: Vi khuẩn mọc trên môi trường agarose 2,5% và bã giấy 1% ở 60oC sau 1 ngày trong hộp kỵ khí
Đặc tính phổ biến ở các nông trại này là có các vi khuẩn kị khí xylanolytic- cellulolytic có khả năng thủy phân các chất lignocellulose. Các nông trại này là các hệ thống làm giàu tự nhiên đối với các loại vi khuẩn như vậy và chúng tôi đã phân lập
được 3 loại vi khuẩn xylanolytic-cellulolytic đặc hiệu hơn cả từ các mẫu thu thập tại nông trại ở Nakorn Pathorn (NKP) đó là NKP2-4, NKP13-3, NKP14-3.
3.1.2. Sàng lọc các chủng vi khuẩn có hoạt tính xylanolytic-cellulolytic Trong các thí nghiệm tiếp theo, để chọn khuẩn lạc nào có hoạt tính xylanolytic- cellulolytic mạnh nhất, chúng tôi tiến hành thí nghiệm xác định khả năng thủy phân cơ chất để thu được chủng vi khuẩn tốt nhất. Trong các chủng vi khuẩn trên, chúng tôi đã phân lập được 3 chủng vi khuẩn là: NKP2-4, NKP13-3, NKP14-3.
Hình 3.2: Khả năng thủy phân giấy lọc sau 2 ngày nuôi cấy dưới điều kiện kỵ khí (A) Đối chứng âm; (B) NKP2-4; (C) NKP13-3; (D) NKP14-3
Chúng tôi tiếp tục lựa chọn chủng vi khuẩn ưa nhiệt ưu việt hơn cả trong 3 chủng vi khuẩn vừa phân lập được bằng cách nghiên cứu khả năng thủy phân giấy lọc và vỏ ngô trong điều kiện môi trường như nhau.
A B C D
Kết quả cho thấy NKP13 là chủng vi khuẩn thủy phân giấy lọc tốt nhất sau 2 ngày nuôi cấy và vỏ ngô sau 7 ngày nuôi cấy (Hình 3.2C và 3.3C). Vì vậy chủng NKP13 có tiềm năng nhất phân giải cellulose và các chất lignocellulose tốt như giấy lọc và vỏ ngô được chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
A B C D
Hình 3.3: Khả năng thủy phân vỏ ngô sau 7 ngày nuôi cấy dưới điều kiện kị khí (A) Đối chứng âm; (B) NKP2-4; (C) NKP13-3; (D) NKP14-3 3.2. Kết quả nhận dạng vi khuẩn kị khí xylanolytic-cellulolytic ưa nhiệt 3.2.1. Xác định hình thái tế bào vi khuẩn
Hình thái tế bào vi khuẩn cũng có vai trò quan trọng bước đầu trong việc nhận dạng các loài vi khuẩn. Kết quả của kỹ thuật nhuộm Gram và chụp ảnh hiển vi điện tử (Hình 3.4) cho thấy NKP13 bắt màu tím tương ứng với vi khuẩn Gram dương, và đây là các vi khuẩn có dạng hình que.
Hình 3.4: Hình thái vi khuẩn NKP13 dưới kính hiển vi (1000x)
Nhiệt độ sinh trưởng của chủng này là 60oC và chúng không thể sinh trưởng ở nhiệt độ thấp 37oC. Điều đó khẳng định sơ bộ rằng chủng NKP13 là chủng vi khuẩn kỵ khí ưa nhiệt có hoạt tính xylanolytic-cellulolytic.
3.2.2. Nhận dạng vi khuẩn bằng đọc trình tự đoạn gen mã hóa cho ARN ribosome 16S
Việc nhận dạng các loài vi khuẩn bằng các phương pháp hóa sinh đòi hỏi nhiều thời gian, công sức và đôi khi cho kết quả chưa thật sự chính xác. Do đó chúng tôi đã tiến hành nhận dạng vi khuẩn dựa trên việc phân tích trình tự đoạn gen mã hóa cho ARN ribosome 16S.
3.2.2.1. Tách chiết ADN hệ gen của chủng vi khuẩn NKP13
Chúng tôi tách chiết ADN tổng số của chủng vi khuẩn được phân lập NKP13 và định lượng ADN thu được bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm (A260). Ngoài ra, chúng tôi cũng đã tiến hành đo giá trị độ hấp thụ A260/A280. Kết quả thu được cho thấy tỷ số A260/A280 của chế phẩm ADN thu được = 1,87, chứng tỏ chế phẩm có độ sạch cần thiết cho các thí nghiệm tiếp theo. Để kiểm tra độ sạch của chế phẩm một lần nữa
chúng tôi sử dụng phương pháp điện di trên gel agarose 1%, kết quả được trình bày ở hình 3.5.
Trên hình điện di, giếng 2 (chủng vi khuẩn NKP13) xuất hiện một băng duy nhất có kích thước lớn hơn băng 10 kb của thang chuẩn ADN 1 kb, chứng tỏ chúng tôi đã tách chiết thành công ADN tổng số của chủng vi khuẩn có độ sạch tương đối đảm bảo cho các nghiên cứu tiếp theo.
M 1
Hình 3.5: Điện di kiểm tra trên gel agarose 1% của ADN tổng số đã tách từ chủng vi khuẩn nghiên cứu
Cột M: Thang chuẩn ADN 1 kb Cột 1: ADN tổng số của NKP13
3.2.2.2. Nhân bản đoạn gen mã hóa cho ARN ribosome 16S của chủng vi khuẩn NKP13 bằng PCR
Để nhân bản đoạn gen mã hóa cho ARNr 16S của chủng vi khuẩn NKP13 bằng PCR chúng tôi sử dụng cặp mồi 8UA và 1492R được thiết kế theo Sato và cộng sự [10], trình tự cặp mồi như sau:
8UA: 5’ – AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG – 3’
1492R: 5’ – TAC GGG TAC CTT GTT ACG ACT T – 3’
Chúng tôi đã sử dụng ADN hệ gen tách chiết từ chủng vi khuẩn NKP13 thu được ở bước trên cho PCR, lượng ADN sử dụng là từ 20 ng – 50 ng/ phản ứng.
Qua quá trình thăm dò các điều kiện phản ứng, chúng tôi đã chọn chế độ nhiệt sử dụng là 94oC trong 4 phút, tiếp theo là 35 chu kỳ phản ứng lặp lại gồm 3 bước: 94oC trong 1 phút, 60oC trong 1 phút và 72oC trong 1,5 phút, sau đó đến thời gian ủ ở 72oC trong 7 phút. Nếu phản ứng PCR dương tính thì sẽ thu được sản phẩm đặc hiệu kích thước khoảng 1,5 kb tương ứng với phần trình tự nucleotide của đoạn gen mã hóa cho ARN ribosome 16S của chủng vi khuẩn NKP13. Kết quả chạy PCR nhân bản đoạn gen mã hóa cho ARN ribosome 16S của chủng vi khuẩn được điện di trên gel agarose 1%
thể hiện ở hình 3.6.
Kết quả điện di cho thấy hai giếng 3 và 4 đều chỉ xuất hiện một băng duy nhất rất rừ nột cú kớch thước khoảng 1,5 kb tương ứng với kớch thước của gen mó húa cho ARN ribosome 16S. Kết quả này chứng tỏ rằng chúng tôi đã nhân bản thành công đoạn gen này ở chủng vi khuẩn kỵ khí NKP13 và sản phẩm PCR đủ độ tin cậy để thực hiện các nghiên cứu sinh học phân tử tiếp theo.
M 1 2 3
Hình 3.6: Điện di kiểm tra trên gel agarose 1% đối với sản phẩm PCR đoạn gen ARN ribosome 16 của chủng vi khuẩn nghiên cứu
Trong đó:
Cột M: Thang chuẩn ADN 1kb Cột 1: Đối chứng âm (-)
Cột 2, 3: mẫu ADN của NKP13
3.2.2.3. Nhân dòng gen mã hóa cho ARN ribosome 16S của chủng vi khuẩn NKP13 vào vector pGEM T
Trên cở sở sản phẩm PCR có chứa các đầu A do hoạt tính của Taq polymerase sẽ nối với các đầu T của vector pGEM T theo nguyên tắc bổ sung (Hình 3.7), phản ứng nối được tiến hành với các thành phần đã được trình bày ở mục 2.2.2.5.
Hình 3.7: Vị trí gắn của sản phẩm PCR với vector pGEM T
Sau khi khuếch đại đoạn gen mã hóa cho ARN ribosome 16S của chủng vi khuẩn NKP13 có kích thước khoảng 1,5 kb bằng kỹ thuật PCR và kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose 1% chúng tôi tiến hành nhân dòng đoạn gen này vào vector pGEM T.
Phản ứng gắn được thực hiện để tạo vector tái tổ hợp mang đoạn ADN cần nhân dòng. Sản phẩm sau phản ứng gắn được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5α và chọn lọc xanh/ trắng trên môi trường thạch LB có bổ sung kháng sinh ampicillin 100 àg/àl, cơ chất X-gal và IPTG làm chất cảm ứng. Về mặt nguyờn tắc, cỏc khuẩn lạc trắng sẽ mang đoạn gen chèn vào còn khuẩn lạc xanh sẽ không mang đoạn gen mà ta quan tâm. Sau khi biến nạp, chúng tôi đã thu được phần lớn các khuẩn lạc trắng và một số ít khuẩn lạc xanh trên môi trường LB.
Để kiểm tra các khuẩn lạc trắng thu được, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR trực tiếp sử dụng các khuẩn lạc làm nguồn cho ADN khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu của pUC19 Fw/Rv (mồi vector). Trong đó cặp mồi pUC19 Fw/Rv là 2 trình tự nằm trên vector pGEM T, có khoảng cách khoảng 0,3 kb. Theo lý thuyết, nếu chúng tôi nhân dòng thành công thì đoạn gen đưa vào sẽ nằm giữa vị trí 2 đoạn mồi pUC19 này, nên khi tiến hành PCR với cặp mồi vector sẽ nhân lên được một đoạn
ADN có kích thước khoảng 0,3 kb cộng thêm đoạn gen mã hóa cho ARN ribosome 16S của chủng vi khuẩn NKP13, kích thước đoạn nhân lên sẽ khoảng 1,8 kb, trong trường hợp nhân dòng không thành công thì sản phẩm PCR sẽ là một đoạn ADN có kích thước khoảng 0,3 kb.
Chế độ nhiệt cho phản ứng PCR như sau:
94ºC – 30 giây 35 chu trình 56ºC – 30 giây 72ºC – 90 giây
Kết quả điện di trên gel agarose 1% sản phẩm PCR sử dụng khuẩn lạc làm nguồn ADN khuôn (Hình 3.8 và 3.9) cho thấy, với cả hai trường hợp, khi sử dụng cặp mồi vector pUC19 Fw/Rv thì các khuẩn lạc trắng xuất hiện 1 băng duy nhất có kích thước khoảng 1,8 kb, khi sử dụng cặp mồi 8UA/1492R của gen thì cho đoạn gen 1,5 kb, còn khuẩn lạc xanh xuất hiện 1 băng ADN duy nhất có kích thước khoảng 0,3 kb.
Như vậy bước đầu chứng tỏ chúng tôi đã thu được các khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp mang gen mã hóa cho ARN ribosome 16S của chủng vi khuẩn NKP13. Vector tái tổ hợp mang đoạn gen ARN ribosome 16S được ký hiệu là pGEM 16S.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Hình 3.8: Điện di kiểm tra trên gel agarose 1% đối với sản phẩm PCR đoạn gen ARN ribosome 16S từ khuẩn lạc thu được sau biến nạp bằng mồi pUC Fw/Rv
Giếng 1: Thang chuẩn ADN 1 kb Giếng 2: Đối chứng âm
Giếng 3: Đối chứng dương
Giếng 4: Khuẩn lạc xanh Giếng 5 – 11: Khuẩn lạc trắng
1 2 3 4 5 6 7 M 9 10 11 12 13 14 15 16
Hình 3.9: Điện di kiểm tra trên gel agarose 1% đối với sản phẩm PCR đoạn gen ARN ribosome 16S từ plasmid tách từ khuẩn lạc thu được sau biến nạp Giếng 1: Khuẩn lạc xanh
Giếng 2 – 7: Plasmid tách từ khuẩn lạc trắng với cặp mồi vector
Giếng 8: Thang chuẩn ADN 1 kb
Giếng 9: Đối chứng âm
Giếng 10 – 16: Plasmid tách từ khuẩn lạc trắng với cặp mồi 8UA/1492R
3.2.2.4. Giải trình tự gen mã hóa cho ARN ribosome 16S của chủng vi khuẩn NKP13
Chúng tôi đã tiến hành đọc trình tự đoạn gen mã hóa cho ARN ribosome 16S của chủng vi khuẩn NKP13 thu được trong plasmid tái tổ hợp pGEM 16S. Plasmid tái tổ hợp có mang đoạn gen mong muốn đã được tách với số lượng lớn và làm sạch theo protocol của Sambrook và Russell [34] để đọc trình tự nucleotide.
Plasmid tinh sạch được trộn với các thành phần cần thiết cho phản ứng PCR chuẩn bị để đọc trỡnh tự. Hỗn hợp phản ứng (20 àl) bao gồm: 8 àl hỗn hợp DTCS, 1 àl mồi pUC19 – là mồi có vị trí bao ngoài vị trí đoạn gen được gài vào trên vector p- GEM T (đối với plasmid tỏi tổ hợp pGEM 16S), 1 àl ADN khuụn (50 ng) và 9 àl nước cất loại ion khử trùng. Hỗn hợp được đưa vào chạy PCR với chu trình nhiệt như sau:
96ºC – 20 giây 35 chu trình 56ºC – 30 giây 60ºC – 3 phút
Kết quả xác định trình tự nucleotide của đoạn gen mã hóa cho ARNr 16S của chủng vi khuẩn NKP13 trong vector pGEM 16S như sau:
Chúng tôi nhận thấy trình tự đoạn gen mã hóa cho ARN ribosome 16S của chủng NKP13 có 98% giống với đoạn gen mã hóa cho ARN ribosome 16S của vi khuẩn Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum HM585225 công bố trên ngân hàng gen thế giới (Hình 3.10).
Hình 3.10: Cây phân loại chủng Thermoanaerobacterium 3.3. Nghiên cứu phức hệ enzyme xylanolytic-cellulolytic của chủng
NKP13
3.3.1. Khả năng sinh tổng hợp xylase và CMCase
Để đánh giá khả năng sinh tổng hợp enzyme xylase và CMCase theo thời gian, chủng NKP13 được nuôi cấy trong môi trường BM ở 60oC, lắc 200 vòng/phút. Dịch enzyme được thu ở các thời gian khác nhau (từ 1 đến 8 ngày) để xác định hoạt độ enzyme. Trong quá trình sinh trưởng của chủng vi khuẩn, enzyme xylanase và cellulase ngoại bào tăng do sự giải phóng enzyme từ tế bào vào môi trường nuôi cấy. Kết quả phân tích (Hình 3.11) cho thấy, hoạt độ enzyme CMCase cao hơn hoạt độ enzyme xylanase, điều này có thể do khả năng liên kết với tế bào của xylanase mạnh hơn là CMCase. Sau 3 ngày hoạt độ cả 2 enzyme tăng nhanh. Hoạt độ xylanase đạt 30 U/l và
hoạt độ CMCase đạt 43 U/l. Sau đó hoạt độ cả 2 enzyme tăng chậm cho đến 7 ngày thì hoạt độ cả 2 enzyme đạt tối đa (xylanase: 47 U/l; CMCase: 58 U/l). Sau 7 ngày hoạt độ cả 2 enzyme giảm dần. Như vậy, thời gian thích hợp nhất cho chủng NKP13 sinh tổng hợp xylanase và CMCase là 7 ngày.
Hình 3.11: Khả năng sinh tổng hợp xylanase, cellulase, protein và đường khử của chủng NKP13 nuôi cấy ở điều kiện kỵ khí với vỏ ngô là nguồn cơ chất
Trong cùng thời gian, nồng độ protein trong môi trường nuôi cấy cũng tăng cùng với sự sinh trưởng của vi khuẩn. Quá trình sản sinh enzyme xylanase và cellulase liên quan tới nồng độ protein trong môi trường nuôi cấy. Lượng đường khử được giải phóng trong môi trường tăng lên tới khoảng 0,3 g/l ở ngày nuôi cấy thứ 3 theo quá trình sinh trưởng của vi khuẩn. Tuy nhiên, sau 3 ngày nuôi cấy, lượng đường giảm nhẹ, đến ngày thứ 8 lượng đường khử còn lại khoảng 0,15 g/l (Hình 3.11), điều này có thể là lượng đường đã được chủng vi khuẩn sử dụng để tiếp tục tăng trưởng.
Môi trường nuôi cấy vi khuẩn với vỏ ngô làm cơ chất sau 7 ngày được đem đi ly tâm thu dịch trên tủa để xác định khả năng sinh tổng hợp hệ enzyme xylanolytic và cellulolytic. Kết quả cho thấy, chủng NKP13 có khả năng sinh hệ enzyme xylanolytic và cellulolytic. Do đó, hệ enzyme này không chỉ thủy phân được vỏ ngô mà còn có thể thủy phân được nhiều cơ chất khác.
Bảng 3.3: Hoạt tính enzyme của dịch enzyme thô do chủng vi khuẩn NKP13 sản sinh ra khi mọc trên môi trường chứa vỏ ngô
Hệ enzyme xylanolytic
Hoạt độ enzyme/
protein tổng số (U/g protein)
Hệ enzyme cellulolytic
Hoạt độ enzyme/
protein tổng số (U/g protein)
Xylanase 16,25 CMCase 20,16
Arabinofuranosidas e
4,21 Avicelase 0,19
β-xylosidase 1,63 β-glycosidase 1,18
Acetyl esterase 0,018 Cellobiohydrolase 0,067
3.3.2. Ảnh hưởng của pH lên hoạt độ xylanase và CMCase 3.3.2.1. pH phản ứng tối ưu
pH môi trường có ảnh hưởng lớn tới hoạt tính xúc tác của enzyme, vì nó ảnh hưởng tới mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và ảnh hưởng tới độ bền của enzyme. Để khảo sát pH tối ưu của enzyme xylanase và CMCase, phản ứng giữa enzyme với cơ chất CMC (đối với enzyme CMCase) và cơ chất xylan lúa mạch (đối với enzyme xylanase). Cơ chất được pha trong các đệm có pH khác nhau từ pH 4 đến pH 9 ở 50oC và sau 5 phút ủ.
Hình 3.12: Ảnh hưởng của độ pH đối với hoạt tính enzyme
Hoạt độ xylanase đạt cực đại ở pH 6 và tương đối cao tại pH 7 (hoạt độ enzyme vẫn đạt được 90%). Còn hoạt độ CMCase đạt cực đại tại pH 5 và giảm nhẹ tại pH 6 (93%) trong khi tại pH 7 hoạt độ của enzyme vẫn đạt được 70% (Hình 3.12).
3.3.2.2. Độ bền pH
pH ảnh hưởng tới độ bền enzyme, nên việc lựa chọn pH thích hợp để bảo quản enzyme là rất quan trọng. Tùy loại protein enzyme mà có độ bền trong một môi trường pH nhất định. Ở đây độ bền của enzyme xylanase và CMCase được khảo sát trong các đệm khác nhau với dải pH từ pH 4 đến pH 9.
Hình 3.13: Ảnh hưởng của độ pH đến độ bền của enzyme
Kết quả cho thấy sau 30 phút ủ, chỉ có ở pH 6 hoạt độ tương đối của cả enzyme xylanase và CMCase đạt cực đại. Ở pH 7 riêng hoạt độ xylanase vẫn giữ được hơn 90%, trong khi ở các pH còn lại giảm khá mạnh đối với cả 2 loại enzyme, giảm mạnh ở pH 8 trở lên, hoạt độ của 2 enzyme chỉ còn lại khoảng 35%. Như vậy, xylanase và CMCase ở chủng NKP13 bền ở pH 6 sau 30 phút ủ (Hình 3.13).