Bước đầu nghiên cứu enzyme xylanolytic và cellulolytic từ một chủng vi khuẩn ưa nhiệt

MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cấu trúc lignocellulose 1.1.1 Cấu trúc thành tế bào thực vật 1.1.2 Cellulose 1.1.3 Lignin 11 1.1.4 Hemicellulose 15 1.2 Enzyme thủy phân lignocellulose 17 1.2.1 Enzyme cellulolytic 18 1.2.2 Enzyme xylanolytic 20 1.3 Ứng dụng enzyme lignocellulolytic 22 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 24 2.1 Nguyên liệu 24 2.1.1 Mẫu đất 24 2.1.2 Hóa chất 24 2.1.3 Thiết bị 24 2.2 Phương pháp nghiên cứu 24 2.2.1 Sàng lọc phân lập vi khuẩn kị khí xylanolytic-cellulolytic ưa nhiệt 24 2.2.2 Nhận dạng chủng vi khuẩn kị khí xylanolytic-cellulolytic ưa nhiệt 25 2.2.2.1 Kiểm tra hình thái tế bào vi khuẩn 25 2.2.2.2 Tách chiết ADN tổng số 25 2.2.2.3 Định lượng ADN cách đo độ hấp thụ tử ngoại bước sóng 260 nm 280 nm 26 2.2.2.4 PCR nhân đoạn gen mã hóa cho ARN ribosome 16S 27 2.2.2.5 Gắn sản phẩm PCR vào vector p-GEM T 27 2.2.2.6 Tách ADN plasmid từ vi khuẩn E.coli DH5α 28 2.2.2.7 Đọc trình tự đoạn gen mã hóa cho ARN ribosome 16S 29 2.2.3 Thu nhận chế phẩm enzyme 30 2.2.4 Xác định hoạt độ enzyme 31 2.2.4.1 Xác định hoạt độ enzyme 31 2.2.4.2 Ảnh hưởng pH hoạt độ độ bền enzyme 33 2.2.4.3 Ảnh hưởng nhiệt độ hoạt độ độ bền enzyme 33 2.2.5 Xác định protein 33 2.2.6 Thủy phân chất lignocellulose 33 2.2.7 Tách phức hệ multienzyme từ dịch lỏng môi trường nuôi cấy 33 2.2.8 Điện di gel kỹ thuật zymogram 34 2.2.9 Sắc ký mỏng (TLC) 34 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Sàng lọc phân lập vi khuẩn kị khí xylanolytic-cellulolytic ưa nhiệt 35 3.1.1 Sàng lọc vi khuẩn ưa nhiệt kỵ khí môi trường làm giàu nuôi cấy nhiệt độ cao 35 3.1.2 Sàng lọc chủng vi khuẩn có hoạt tính xylanolytic-cellulolytic 39 3.2 Kết nhận dạng vi khuẩn kị khí xylanolytic-cellulolytic ưa nhiệt 40 3.2.1 Xác định hình thái tế bào vi khuẩn 40 3.2.2 Nhận dạng vi khuẩn đọc trình tự đoạn gen mã hóa cho ARN ribosome 16S 41 3.2.2.1 Tách chiết ADN hệ gen chủng vi khuẩn NKP13 41 3.2.2.2 Nhân đoạn gen mã hóa cho ARN ribosome 16S chủng vi khuẩn NKP13 PCR 42 3.2.2.3 Nhân dòng gen mã hóa cho ARN ribosome 16S chủng vi khuẩn NKP13 vào vector p-GEM T 44 3.2.2.4 Giải trình tự gen mã hóa cho ARN ribosome 16S chủng vi khuẩn NKP13… 47 3.3 Nghiên cứu phức hệ enzyme xylanolytic-cellulolytic chủng NKP13 49 3.3.1 Khả sinh tổng hợp xylase CMCase 49 3.3.2 Ảnh hưởng pH lên hoạt độ xylanase CMCase 51 3.3.2.1 pH phản ứng tối ưu 51 3.3.2.2 Độ bền pH 52 3.3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt độ enzyme xylanase CMCase độ bền nhiệt enzyme 53 3.3.3.1 Nhiệt độ phản ứng tối ưu 53 3.3.3.2 Độ bền nhiệt 53 3.3.4 Khả thủy phân nguyên liệu lignocellulose enzyme 54 3.3.5 Điện di chế phẩm enzyme gel polyacrylamide có SDS 56 KẾT LUẬN 58 KIẾN NGHỊ 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 MỞ ĐẦU Cùng với phát triển nông nghiệp, hàng năm hàng triệu chất lignocellulose bắt nguồn từ hoạt động nông nghiệp, thải môi trường Điều không làm tăng thêm gánh nặng môi trường mà làm lãng phí nguồn sinh khối, cần phải thực nghiêm ngặt tiêu chuẩn việc thải chất thải vào môi trường Các phương pháp xử lý hóa học sinh học thông thường ngày khó đạt mức độ cần thiết để loại bỏ chất ô nhiễm Vì cần phải triển khai biện pháp xử lý cho vừa nhanh hơn, rẻ hơn, hiệu hơn, đáng tin cậy vừa đem lại lợi ích kinh tế Ngày nay, với phát triển khoa học kỹ thuật, công nghệ sinh học ứng dụng rộng rãi xử lý chất thải nông nghiệp Thế hệ nhiên liệu sinh học dựa đường, tinh bột dầu thực vật, nhiên chưa thực có ứng dụng rộng rãi công nghiệp Lignocellulose xem hệ nhiên liệu sinh học thứ hai Đối với môi trường ngành kinh tế, chất thải lignocellulose sử dụng nguồn nguyên liệu để sản xuất chất hóa học, nhiên liệu vật chất tương hợp khác Bên cạnh đó, nguồn nguyên liệu đặc biệt quan tâm giá thành thấp nguồn cung cấp dồi Quá trình biến đổi sinh học chất thải thành nhiên liệu mang đến lợi nhuận kinh tế môi trường [1] Lignocellulose (sinh khối thực vật) bao gồm polysaccharide chủ yếu cellulose, hemicellulose (xylan) lignin, cellulose hemicellulose chiếm tỉ lệ cao Cellulose chiếm phần lớn, khoảng từ 35% đến 50% khối lượng khô thực vật, hai hợp chất, hemicellulose lignin chiếm khoảng 20-30% 5-20% khối lượng khô thể thực vật [23] Với tính sẵn có lignocellulose trở thành nguồn lượng tái tạo dồi [36] Nhiều nghiên cứu chứng minh khả triển vọng sử dụng enzyme vào việc biến đổi sinh học chất thải lignocellulose để tạo đường đơn hữu ích từ phế phụ liệu chứa lignocellulose [3] Nhằm thu enzyme có hoạt tính thủy phân lignocellulose hiệu thành đường đơn đường đôi từ phế phụ liệu nông nghiệp, để từ đưa vào ứng dụng rộng rãi sản xuất sản phẩm có giá trị đời sống người, thực đề tài: “ Bước đầu nghiên cứu enzyme xylanolytic cellulolytic từ chủng vi khuẩn ưa nhiệt” CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cấu trúc lignocellulose 1.1.1 Cấu trúc thành tế bào thực vật Trong tự nhiên, lớp thành tế bào thực vật minh họa mô hình gỗ (Hình 1.1) Ở tế bào, có hợp chất đóng vai trò keo dán gắn kết tế bào lại với nhau, lớp gian bào (middle lamella) Lớp cấu tạo từ chất keo, có chất pectin tác động quang học Bên thành tế bào sơ cấp (primary wall) Hình 1.1: Cấu trúc thành tế bào thực vật [37] Thành tế bào sơ cấp chia thành mặt bên mặt bên Sự xếp vi sợi thành tế bào sơ cấp phân tán tăng dần từ mặt mặt Tiếp đến thành tế bào thứ cấp gồm lớp: lớp (S1), lớp (S2) lớp (S3) Sự phân chia thành tế bào thứ cấp thành ba lớp S chủ yếu định hướng khác vi sợi ba lớp Điển hình vi sợi định hướng xoắn vách tế bào Lớp thành tế bào thứ cấp, vi sợi định hướng cấu trúc xoắn chéo có độ nghiêng tạo thành góc lớn với trục dọc tế bào Lớp lớp dày lớp có góc nhỏ độ nghiêng sợi xoắn ốc vi sợi lớp xếp lớp ngoài, với góc rộng với trục dọc tế bào Ngoài số trường hợp, mặt thành tế bào có lớp sần sùi (W) Chức thành tế bào chống đỡ cho quan đặc biệt vách dày cứng Thành tế bào giữ chức quan trọng hấp thụ, thoát nước hay vận chuyển tiết Lignocellulose thành phần triển điều kiện khác Thành cấu trúc thực vật thân gỗ phần lignocellulose trình bày thực vật khác cỏ, lúa, bảng 1.1 [9] ngô…Trong tự nhiên, tìm thấy lignocellulose thực vật hay chất thải nông nghiệp, lâm nghiệp chất thải rắn thành phố Thành phần chủ yếu lignocellulose cellulose, hemicellulose lignin (Hình 1.2) Cellulose hemicellulose đại phân tử cấu tạo từ gốc đường khác nhau, lignin polymer dạng vòng tổng hợp từ tiền phenylpropanoid Thành phần cấu tạo phần trăm polymer khác loài Hơn nữa, thành phần cấu tạo hay khác khác dựa vào Hình 1.2: Thành phần chủ yếu độ tuổi, giai đoạn sinh trưởng, phát lignocellulose Bảng 1.1: Thành phần lignocellulose rác thải phế phụ liệu nông nghiệp phổ biến [9] Nguồn lignocellulose Cellulose (%) Hemicellulose (%) Lignin (%) Thân gỗ cứng 40-55 24-40 18-25 Thân gỗ mềm 45-50 25-35 25-35 Vỏ lạc 25-30 25-30 30-40 Lõi ngô 45 35 15 Giấy 85-99 0-15 Vỏ trấu 32.1 24 18 Vỏ trấu lúa mì 30 50 15 Rác phân loại 60 20 20 Lá 15-20 80-85 Hạt 80-95 5-20 Giấy báo 40-55 25-40 18-30 Giấy thải từ bột giấy hóa học 60-70 10-20 5-10 Chất rắn nước thải ban đầu 8-15 - 24-29 Chất thải lợn 28 - Phân bón gia súc 1.6-4.7 1.4-3.3 2.7-5.7 Cỏ bờ biển Bermuda 25 35.7 6.4 Cỏ mềm 45 31.4 12.0 Các loại cỏ (trị số trung bình cho loại) 25-40 25-50 10-30 Bã thô 33.4 30 18.9 Lượng lớn lignocellulose thải từ ngành lâm nghiệp, nông nghiệp, công nghiệp giấy gây ô nhiễm môi trường Tuy nhiên, lượng lớn sinh khối thực vật dư thừa coi rác thải biến đổi thành nhiều sản phẩm có giá trị khác nhiên liệu sinh học, hóa chất, nguồn lượng rẻ cho trình lên men, bổ sung chất dinh dưỡng cho người thức ăn cho động vật [15] 1.1.2 Cellulose Cellulose hợp chất hữu có công thức cấu tạo (C6H10O5)n, thành phần chủ yếu thành tế bào thực vật, gồm nhiều cellobiose liên kết với nhau, 4-O- (β-DGlucopyranosyl)-D-glucopyranose (Hình 1.3) Cellulose hợp chất hữu nhiều sinh quyển, hàng năm thực vật tổng hợp khoảng 1011 cellulose (trong gỗ, cellulose chiếm khoảng 50% chiếm khoảng 90%) Hình 1.3: Công thức hóa học cellulose Các mạch cellulose liên kết với nhờ liên kết hydro liên kết van Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc tinh thể vô định hình Trong vùng tinh thể, phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, vùng khó bị công enzyme hóa chất Ngược lại, vùng vô định hình, cellulose liên kết không chặt với nên dễ bị công [40] Có hai mô hình cấu trúc cellulose đưa nhằm mô tả vùng tinh thể vô định hình 1.4 [29] Hình 1.4: Mô hình Fringed fibrillar mô hình chuỗi gập Trong mô hình Fringed Fibrillar: phân tử cellulose kéo thẳng định hướng theo chiều sợi Vùng tinh thể có chiều dài 500 Å xếp xen kẽ với vùng vô định hình Trong mô hình chuỗi gập: phân tử cellulose gấp khúc theo chiều sợi Mỗi đơn vị lặp lại có độ trùng hợp khoảng 1000, giới hạn hai điểm a b hình vẽ Các đơn vị xếp thành chuỗi nhờ vào mạch glucose nhỏ, vị trí dễ bị thủy phân Đối với đơn vị lặp lại, hai đầu vùng vô định hình, vào giữa, tính chất kết tinh cao Trong vùng vô định hình, liên kết β - glycoside monomer bị thay đổi góc liên kết, cuối đoạn gấp, phân tử monomer xếp tạo thay đổi 180o cho toàn mạch Vùng vô định hình dễ bị công tác nhân thủy phân vùng tinh thể thay đổi góc liên kết liên kết cộng hóa trị (β - glycoside) làm giảm độ bền liên kết, đồng thời vị trí không tạo liên kết hydro [2] Cellulose có cấu tạo tương tự carbohydrate phức tạp tinh bột glycogen Các polysaccharide cấu tạo từ đơn phân glucose Cellulose glucan không phân nhánh, gốc glucose kết hợp với qua liên kết β- 10 1 4- glycoside, khác biệt cellulose phân tử carbohydrate phức tạp khác Giống tinh bột, cellulose cấu tạo thành chuỗi dài gồm 500 phân tử glucose Các chuỗi cellulose xếp đối song song tạo thành vi sợi cellulose có đường kính khoảng 3,5 nm Mỗi chuỗi có nhiều nhóm OH tự do, sợi cạnh kết hợp với nhờ liên kết hidro tạo thành nhóm OH chúng Các vi sợi lại liên kết với tạo thành vi sợi lớn hay gọi bó mixen có đường kính 20 nm, sợi mixen có khoảng trống lớn Khi tế bào non, khoảng chứa đầy nước, tế bào già chứa đầy lignin hemicellulose Cellulose có cấu trúc bền khó bị thủy phân Người động vật enzyme phân giải cellulose (cellulase) nên không tiêu hóa cellulose, cellulose giá trị dinh dưỡng Tuy nhiên, số nghiên cứu cho thấy cellulose có vai trò điều hòa hoạt động hệ thống tiêu hóa Vi khuẩn cỏ gia súc, động vật nhai lại động vật nguyên sinh ruột mối sản xuất enzyme phân giải cellulose Nấm đất phân hủy cellulose Vì chúng sử dụng cellulose làm thức ăn 1.1.3 Lignin Lignin phức hợp chất hóa học phổ biến tìm thấy hệ mạch thực vật, chủ yếu tế bào, thành tế bào thực vật Lignin polymer hữu phổ biến trái đất Lignin có cấu trúc không gian chiều, phức tạp, vô định hình, chiếm 17% đến 33% thành phần gỗ Lignin carbohydrate có liên kết chặt chẽ với nhóm để tạo nên màng tế bào giúp thực vật cứng giòn, có chức vận chuyển nước thể thực vật (một phần để làm bền thành tế bào giữ cho không bị đổ, phần điều chỉnh dòng chảy nước), giúp phát triển chống lại công côn trùng mầm bệnh Thực vật già, lượng lignin tích tụ lớn Hơn nữa, lignin đóng vai 11 trò quan trọng chu trình carbon, tích lũy carbon khí mô thực vật thân gỗ lâu năm, thành phần bị phân hủy lâu thực vật sau chết, để đóng góp phần lớn chất mùn giúp tăng khả quang hợp thực vật Lignin polyphenol có cấu trúc mở Trong tự nhiên, lignin chủ yếu đóng vai trò chất liên kết thành tế bào thực vật, liên kết chặt chẽ với mạng cellulose hemicellulose Rất khó để tách lignin hoàn toàn Lignin polymer, cấu thành từ đơn vị phenylpropene, vài đơn vị cấu trúc điển hình là: guaiacyl (G), trans-coniferyl alcohol; syringyl (S), trans-sinapyl alcohol; p-hydroxylphenyl (H), trans-p-courmary alcohol (Hình 1.5) Hình 1.5: Các đơn vị lignin [14] Cấu trúc lignin đa dạng, tùy thuộc vào loại gỗ, tuổi cấu trúc gỗ Ngoài việc phân loại theo lignin gỗ cứng, gỗ mềm cỏ, lignin phân thành hai loại chính: guaicyl lignin guaicyl-syringyl lignin Gỗ mềm chứa chủ yếu guaiacyl, gỗ cứng chứa chủ yếu syringyl Các nghiên cứu guaiacyl lignin hạn chế trương nở xơ sợi loại nguyên liệu khó bị công enzyme syringyl lignin [29] Những nghiên cứu gần lignin hoàn toàn không đồng cấu trúc Lignin dường bao gồm vùng vô định hình vùng có cấu trúc hình thuôn hình cầu Lignin tế bào thực vật bậc cao vùng vô định hình 12 Các vòng phenyl lignin gỗ mềm xếp trật tự mặt phẳng thành tế bào Ngoài ra, cấu trúc hóa học cấu trúc không gian lignin bị ảnh hưởng mạng polysaccharide Việc mô hình hóa động học phân tử cho thấy nhóm hydroxyl nhóm methoxyl oligomer tiền lignin tương tác với vi sợi cellulose cho dù chất lignin kỵ nước Hình 1.6: Cấu trúc lignin gỗ mềm với nhóm chức 13 Các nhóm chức ảnh hưởng đến hoạt tính lignin bao gồm nhóm phenolic hydroxyl tự do, methoxyl, benzylic hydroxyl, ether benzylic với rượu mạch thẳng nhóm carbonyl (Hình 1.6) Guaicyl lignin chứa nhiều nhóm phenolic hydroxyl syringyl Lignin tạo liên kết hóa học với hemicellulose với cellulose (nhưng không nhiều) Độ bền hóa học liên kết phụ thuộc vào chất liên kết, cấu trúc hóa học lignin gốc đường tham gia liên kết [2] Carbon alpha (Cα) cấu trúc phenyl propane nơi có khả tạo liên kết cao với khối hemicellulose Ngược lại, đường nằm mạch nhánh arabinose, galactose, acid 4-O-methylglucuronic nhóm thường liên kết với lignin Các liên kết ether, ester (liên kết với xylan qua acid 4-O-methyl-D-glucuronic), hay glycoside (phản ứng nhóm khử hemicellulose nhóm OH phenolic lignin) Cấu trúc hóa học lignin dễ bị thay đổi điều kiện nhiệt độ cao pH thấp điều kiện trình tiền xử lý nước Ở nhiệt độ phản ứng cao 200oC, lignin bị kết khối thành phần riêng biệt tách khỏi cellulose Những nghiên cứu trước cho thấy gỗ cứng, nhóm ether β-O-4 aryl bị phá hủy trình nổ Đồng thời, gỗ mềm, trình nổ làm bất hoạt nhóm hoạt động lignin vị trí α nhóm hydroxyl hay ether, nhóm bị oxy hóa thành carbonyl tạo cation benzylic, cation tiếp tục tạo liên kết C-C [29] Trong dinh dưỡng động vật, lignin đáng quan tâm không bị tiêu hóa enzyme thể vật chủ Lignin liên kết với nhiều polysaccharide protein màng tế bào ngăn trở trình tiêu hóa hợp chất gỗ Gỗ, cỏ khô rơm giàu lignin nên tỷ lệ tiêu hóa thấp trừ xử lý hóa học làm cho liên kết lignin với carbohydrate khác bị bẻ gãy 14 1.1.4 Hemicellulose Hemicellulose loại polymer phức tạp phân nhánh, độ trùng hợp khoảng 70 đến 200 đơn phân Hemicellulose chứa đường carbon gồm glucose, mannose galactose đường gồm xylose arabinose Thành phần hemicellulose β – D xylopyranose, liên kết với liên kết β -(14) Cấu tạo hemicellulose phức tạp đa dạng tùy vào nguyên liệu, nhiên có vài điểm chung gồm: - Mạch hemicellulose cấu tạo từ liên kết β -(14) - Xylose thành phần quan trọng - Nhóm phổ biến nhóm acetyl O – liên kết với vị trí - Mạch nhánh cấu tạo từ nhóm đơn giản, thông thường disaccharide trisaccharide Sự liên kết hemicellulose với polysaccharide khác với lignin nhờ mạch nhánh Cũng hemicellulose có mạch nhánh nên tồn dạng vô định hình dễ bị thủy phân Hemicellulose polysaccharide màng tế bào tan dung dịch kiềm có liên kết chặt chẽ với cellulose, ba sinh khối tự nhiên Cùng với cellulose lignin, hemicellulose tạo nên thành tế bào vững thực vật Về cấu trúc, hemicellulose có thành phần D-glucose, D-galactose, D-mannose, Dxylose L-arabinose liên kết với thành phần khác nằm liên kết glycoside Hemicellulose chứa axit 4-O-methylglucuronic, axit D-galacturonic axit glucuronic Trong đó, đường D-xylose, L-arabinose, D-glucose D-galactose phổ biến thực vật thân cỏ ngũ cốc Tuy nhiên, khác với hemicellulose thân gỗ, hemicellulose thực vật thân cỏ lại có lượng lớn dạng liên kết phân nhánh phụ thuộc vào loài loại mô loài phụ thuộc vào độ tuổi mô Tùy theo thành phần hemicellulose có chứa monosaccharide mà có tên tương ứng manan, galactan, glucan xylan Các 15 polysaccharide manan, galactan, glucan hay xylan chất phổ biến thực vật, chủ yếu thành phần màng tế bào quan khác gỗ, rơm rạ, v.v… Trong loại hemicellulose, xylan polymer thành tế bào thực vật gốc D-xylopyranose kết hợp với qua liên kết β-1,4-Dxylopyranose, nguồn lượng dồi thứ hai trái đất Đa số phân tử xylan chứa nhiều nhóm trục chuỗi bên [7] Các gốc thay chủ yếu khung xylan gốc acetyl, arabinosyl glucuronosyl Các nhóm có đặc tính liên kết tương tác cộng hóa trị không hóa trị với lignin, cellulose polymer khác [32] Cấu tạo, số lượng vị trí xylan loài thực vật khác khác Xylan tồn dạng O-acetyl-4-O-methylglucuronoxylan gỗ cứng (Hình 1.7), hay arabino-4-O-methylglucuronoxylan gỗ mềm (Hình 1.8) [39], hay thành phần cấu tạo xylan axit D-glucuronic, có ete 4-O-methyl arabinose loài ngũ cốc Hình 1.7: O-acetyl-4-O-methylglucuronoxylan gỗ cứng 16 Hình 1.8: Arabino-4-O-methylglucuronoxylan gỗ mềm 1.2 Enzyme thủy phân lignocellulose Hầu hết quy trình xử lý rác thải sử dụng hai phương pháp hóa lý sinh học kết hợp Phương pháp xử lý enzyme trung gian hai phương pháp truyền thống, bao gồm quy trình hóa học sở hoạt động chất xúc tác có chất sinh học Enzyme hoạt động chất ô nhiễm đặc biệt khó xử lý để loại chúng cách kết tủa chuyển chúng thành dạng khác Ngoài chúng làm thay đổi đặc tính chất thải đưa chúng dạng dễ xử lý chuyển thành sản phẩm có giá trị Phương pháp xử lý enzyme so với phương pháp xử lý thông thường có ưu điểm vượt trội như: áp dụng hợp chất sinh học khó xử lý; tác dụng vùng nồng độ chất ô nhiễm cao thấp; số enzyme riêng biệt có tác dụng phạm vi pH, nhiệt độ, độ mặn…; không gây biến động bất thường; không ảnh hưởng đến cân sinh thái 17 Dựa phương pháp enzyme học trình phân hủy cellulose, hemicellulose lignin ngày có vài phương pháp sinh học thực chu trình xử lý lignocellulose Trong tương lai gần, quy trình sử dụng enzyme thủy phân lignocellulose dựa vào vi sinh vật mang lại cho nhiều lợi ích lớn thân thiện với môi trường Mối quan hệ cellulose hemicellulose thành tế bào thực vật bậc cao chặt chẽ tưởng trước Đó phân tử liên kết cellulose-hemicellulose vùng cellulose tinh thể đòi hỏi phải có enzyme khác để thủy phân hiệu Mỗi polymer bị thủy phân số vi sinh vật sản xuất enzyme hoạt động hỗ trợ Nếu vậy, điều giúp giải thích vi sinh vật cellulolytic tổng hợp đặc trưng nhiều enzyme cellulase khác có tính đặc hiệu gối số enzyme xylanase lại mang vùng liên kết chất gần với cellulose Các vi sinh vật cellulolytic xylanolytic không môi trường riêng biệt mà chúng tồn với loài khác nấm vi khuẩn Các chủng đóng vai trò trung tâm thủy phân polymer để tạo đường sản phẩm thủy phân khác 1.2.1 Enzyme cellulolytic Enzyme thủy phân cellulose có khả thủy phân chất thải chứa cellulose, chuyển hóa hợp chất kiểu lignocellulose cellulose rác thải tạo nên nguồn lượng thông qua sản phẩm, ethanol, khí sinh học hay sản phẩm giàu lượng khác Thí dụ từ chất thải nhà máy giấy sản phẩm từ bột giấy giấy thu nguồn lượng ethanol [12] Liên kết chủ yếu cấu trúc cellulose β-(14) glucoside Nói chung, để phá hủy hoàn toàn cấu trúc polysaccharide cần có enzyme cellulase với tác động đặc trưng riêng biệt Dựa theo nghiên cứu hệ enzyme cellulase nấm Trichoderma reesei [36], hệ enzyme thủy phân gồm loại hoạt tính enzyme (Hình 1.9): 18 Endoglycanase 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase (EC 3.2.1.4) Enzyme nội bào endoglycanase 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase enzyme thủy phân nội bào liên kết 1,4-β-D-glucosidic phân tử cellulose tác dụng ngẫu nhiên chuỗi polymer hình thành đầu chuỗi khử tự chuỗi oligosaccharide ngắn Các endoglucanase thủy phân cellulose tinh thể hiệu phá vỡ liên kết khu vực vô định hình tương đối dễ tiếp cận Exoglucanase Enzyme ngoại bào exoglucanase gồm 1,4-beta-D-glucan glucanohydrolase (EC 3.2.1.74), giải phóng D-glucose từ β-glucan cellodextrin 1,4-beta-D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) mà giải phóng D-cellobiose Tỷ lệ thủy phân enzyme cellobiohydrolase ngoại bào bị hạn chế sẵn có đầu chuỗi cellulose β-glucosidase hay β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) β-glucosidase hay β-D-glucoside glucohydrolase giải phóng phân tử D-glucose từ đường cellodextrin hòa tan loạt glucoside khác Hình 1.9: Tác dụng enzyme cellulose 19 1.2.2 Enzyme xylanolytic Do tính không đồng xylan, thủy phân đòi hỏi ảnh hưởng hệ thống enzyme phức tạp Enzyme thường bao gồm hai loại: enzyme không phân nhánh (β-1,4-endoxylanse, β-xylosidase) enzyme phân nhánh (αarabinofuranosidase, α-glucuronidase, esterase xylan acetyl esterase axit phenolic) (Hình 1.10) Tất enzyme tác động tương hỗ để chuyển đổi xylan thành cấu tử đường Hệ thống enzyme xylanolytic đa chức phổ biến vi khuẩn nấm Các xylan khác loại chứa nhóm thể khác mạch chuỗi chuỗi bên Như vậy, phân giải polysaccharide phức tạp gồm hoạt động hỗ trợ thành phần khác hệ thống enzyme xylanolytic [7] Hình 1.10: (A) Enzyme xylanolytic liên quan đến trình phân giải xylan Ac: nhóm acetyl; α-Araf: α-arabinofuranose; α-4-O-Me-GlcA: α-4-O-methylglucuronic acid (B) Thủy phân xylooligosaccharide enzyme β-xylosidase [10] 20 [...]... giải phóng phân tử D-glucose từ đường cellodextrin hòa tan và một loạt các glucoside khác Hình 1.9: Tác dụng của từng enzyme trong cellulose 19 1.2.2 Enzyme xylanolytic Do tính không đồng nhất của xylan, sự thủy phân của nó đòi hỏi các ảnh hưởng của một hệ thống enzyme phức tạp Enzyme này thường bao gồm hai loại: enzyme không phân nhánh (β-1,4-endoxylanse, β-xylosidase) và enzyme phân nhánh (αarabinofuranosidase,... vi sinh vật cellulolytic và xylanolytic không ở trong môi trường riêng biệt mà chúng tồn tại cùng với các loài khác như nấm và vi khuẩn Các chủng này sẽ đóng vai trò như trung tâm thủy phân polymer để tạo ra đường và các sản phẩm thủy phân khác 1.2.1 Enzyme cellulolytic Enzyme thủy phân cellulose có khả năng thủy phân chất thải chứa cellulose, chuyển hóa các hợp chất kiểu lignocellulose và cellulose... các enzyme khác nhau để thủy phân hiệu quả hơn Mỗi polymer bị thủy phân bởi một số vi sinh vật sản xuất các enzyme hoạt động hỗ trợ nhau Nếu đúng như vậy, điều này có thể giúp chúng ta giải thích được tại sao vi sinh vật cellulolytic tổng hợp đặc trưng nhiều enzyme cellulase khác nhau có tính đặc hiệu gối nhau và tại sao một số enzyme xylanase lại mang vùng liên kết cơ chất gần với cellulose Các vi. .. 17 Dựa trên phương pháp enzyme học về quá trình phân hủy cellulose, hemicellulose và lignin ngày nay đã có một vài phương pháp sinh học thực hiện chu trình xử lý lignocellulose Trong tương lai gần, các quy trình sử dụng enzyme thủy phân lignocellulose hoặc dựa vào vi sinh vật có thể mang lại cho chúng ta nhiều lợi ích lớn và thân thiện với môi trường Mối quan hệ giữa cellulose và hemicellulose trong... Hemicellulose chứa cả đường 6 carbon gồm glucose, mannose và galactose và đường 5 gồm xylose và arabinose Thành phần cơ bản của hemicellulose là β – D xylopyranose, liên kết với nhau bằng liên kết β -(14) Cấu tạo của hemicellulose khá phức tạp và đa dạng tùy vào nguyên liệu, tuy nhiên có một vài điểm chung gồm: - Mạch chính của hemicellulose được cấu tạo từ liên kết β -(14) - Xylose là thành phần quan trọng... thực vật thân cỏ và ngũ cốc Tuy nhiên, khác với hemicellulose thân gỗ, hemicellulose ở thực vật thân cỏ lại có lượng lớn các dạng liên kết và phân nhánh phụ thuộc vào các loài và từng loại mô trong cùng một loài cũng như phụ thuộc vào độ tuổi của mô đó Tùy theo trong thành phần của hemicellulose có chứa monosaccharide nào mà nó sẽ có những tên tương ứng như manan, galactan, glucan và xylan Các 15 polysaccharide... dụ như từ các chất thải nhà máy giấy như các sản phẩm từ bột giấy và giấy có thể thu nguồn năng lượng như ethanol [12] Liên kết chủ yếu trong cấu trúc của cellulose là β-(14) glucoside Nói chung, để phá hủy hoàn toàn cấu trúc của polysaccharide này cần có các enzyme cellulase với những tác động đặc trưng riêng biệt Dựa theo nghiên cứu về hệ enzyme cellulase của nấm Trichoderma reesei [36], hệ enzyme. .. giá trị dinh dưỡng Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho thấy cellulose có thể có vai trò điều hòa hoạt động của hệ thống tiêu hóa Vi khuẩn trong dạ cỏ của gia súc, các động vật nhai lại và động vật nguyên sinh trong ruột của mối sản xuất enzyme phân giải cellulose Nấm đất cũng có thể phân hủy cellulose Vì vậy chúng có thể sử dụng cellulose làm thức ăn 1.1.3 Lignin Lignin là một phức hợp chất hóa học phổ... (αarabinofuranosidase, α-glucuronidase, esterase xylan acetyl và esterase axit phenolic) (Hình 1.10) Tất cả các enzyme này tác động tương hỗ để chuyển đổi xylan thành cấu tử đường của nó Hệ thống enzyme xylanolytic đa chức năng như vậy khá phổ biến ở những vi khuẩn và nấm Các xylan khác loại chứa nhóm thể khác nhau trong mạch chuỗi chính và chuỗi bên Như vậy, sự phân giải polysaccharide phức tạp như... lignin đa dạng, tùy thuộc vào loại gỗ, tuổi của cây hoặc cấu trúc của nó trong gỗ Ngoài vi c được phân loại theo lignin của gỗ cứng, gỗ mềm và cỏ, lignin có thể được phân thành hai loại chính: guaicyl lignin và guaicyl-syringyl lignin Gỗ mềm chứa chủ yếu là guaiacyl, gỗ cứng chứa chủ yếu syringyl Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng guaiacyl lignin hạn chế sự trương nở của xơ sợi và vì vậy loại nguyên liệu