Sàng lọc và đánh giá đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn có khả năng kích thích sinh trưởng phân lập từ vùng rễ cây dứa (khóa luận tốt nghiệp)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA: CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: SÀNG LỌC VÀ ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG VI KHUẨN CĨ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG PHÂN LẬP TỪ VÙNG RỄ CÂY DỨA Sinh viên thực : Lê Sĩ Anh Tú Lớp : K62CNSHC Ngành : Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn : ThS Nguyễn Thanh Huyền HÀ NỘI – 2021 LỜI CẢM ƠN Sau thời gian thực tập khóa luận Bộ mơn Cơng nghệ vi sinh- Khoa Công nghệ sinh học-Học viện Nông nghiệp Việt Nam Em xin chân thành cảm ơn quan tâm giúp đỡ thầy/cô giáo, cán phịng thí nghiệm Bộ mơn khoa Công nghệ sinh học truyền đạt cho em kiến thức vô quan trọng quý báu suốt thời gian học tập rèn luyện Học viện Nơng nghiệp Việt Nam Với lịng biết ơn sâu sắc em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: Th.S Nguyễn Thanh Huyền-Bộ môn Công Nghệ vi sinh-Khoa Công nghệ sinh họcHọc viện Nông nghiệp Việt Nam, giảng viên trực tiếp hướng dẫn, tận tình bảo tạo điều kiện tốt cho em suốt trình học tập nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn thầy cô khoa Công nghệ sinh học thầy cô Học viện Nơng nghiệp Việt Nam tận tình dạy bảo em suốt năm qua Cuối cùng, em xin cảm ơn tới người thân gia đình ln chăm lo, động viên, tồn thể bạn bè cộng tác giúp đỡ em khoảng thời gian thực đề tài tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Sinh viên Lê Sĩ Anh Tú i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan tồn kết khóa luận trực tiếp thực hướng dẫn ThS Nguyễn Thanh Huyền, khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Tất số liệu, hình ảnh, kết trình bày khóa luận hoàn toàn trung thực, chưa cơng bố cơng trình khác Những tài liệu, thông tin đăng tải tác phẩm, tạp chí website tham khảo khóa luận liệt kê danh mục tài liệu tham khảo khóa luận Tơi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan trước Hội đồng Học viện Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Sinh viên Lê Sĩ Anh Tú ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii TÓM TẮT ix PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nội dung nghiên cứu 1.2.1 Mục đích đề tài 1.2.2 Nội dung nghiên cứu 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan vi khuẩn vùng rễ 2.1.1 Nguồn gốc vi khuẩn vùng rễ 2.1.2 Cách thức hoạt động vi khuẩn vùng rễ 2.1.3 Vai trò vi khuẩn vùng rễ 2.1.3.1 Khả sinh tổng hợp IAA 2.1.3.2 Khả phân giải phosphate khó tan 11 2.1.4 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn vùng rễ có khả kích thích sinh trưởng thực vật giới nước 13 2.1.4.1 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn vùng rễ có khả kích thích sinh trưởng thực vật giới 13 2.2 Tổng quan Dứa 15 iii 2.2.1 Đặc điểm thực vật học 15 2.2.2 Giá trị dinh dưỡng giá trị thương mại 16 Phần III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm phương pháp nghiên cứu 20 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20 3.1.2 Dụng cụ thiết bị nghiên cứu 20 3.1.3 Hóa chất 20 3.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 21 3.2.1 Địa điểm lấy mẫu nghiên cứu 21 3.2.2.Thời gian nghiên cứu 21 3.3 Nội dung nghiên cứu 21 3.4 Phương pháp nghiên cứu 21 3.4.1 Phương pháp lấy mẫu 21 3.4.2 Phương pháp phân lập 21 3.4.3 Phương pháp làm giữ giống 22 3.4.4 Phương pháp xác định khả sinh Indole axetic acid (IAA) chủng vi khuẩn tuyển chọn (Theo TCVN-2015) 22 3.4.5 Khảo sát khả sinh siderophore thực theo phuương pháp Brian cộng (2011) 25 3.4.6 Phương pháp khảo sát khả phân giải phosphate khó tan 25 3.4.7 Khảo sát hoạt tính enzyme ngoại bào phương pháp khuếch tán đĩa thạch 25 3.4.8 Khảo sát số đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn tuyển chọn 26 3.4.9 Khảo sát ảnh hưởng số yếu tố: thời gian nuôi cấy, pH, nhiệt độ, nguồn Cacbon đến khả sản sinh IAA số chủng tuyển chọn 29 Phần IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 iv 4.1 Kết phân lập tuyển chọn vi khuẩn vùng rễ có khả kích thích sinh trưởng 30 4.1.1 Kết phân lập 30 4.1.2 Xác định khả tổng hợp IAA chủng vi khuẩn vùng rễ 31 4.1.3 Sàng lọc vi khuẩn vùng rễ có khả phân giải phosphate khó tan 34 4.1.4.Khảo sát khả sinh siderophore chủng vi khuẩn vùng rễ 35 4.2 Khảo sát hoạt tính enzyme ngoại bào chủng vi khuẩn vùng rễ phương pháp khuếch tán đĩa thạch 35 4.2.1 Hoạt tính protease 35 4.2.2 Hoạt tính amylase 36 4.2.3 Hoạt tính cellulase 37 4.3 Xác định đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn tuyển chọn 38 4.4 Khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh IAA chủng vi khuẩn tuyển chọn 39 4.5 Khảo sát ảnh hưởng pH đến khả sinh IAA chủng vi khuẩn tuyển chọn 40 4.6 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh IAA chủng vi khuẩn tuyển chọn 41 4.7 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến khả sinh IAA chủng tuyển chọn 42 Phần V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 5.1.Kết luận 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ LỤC 50 v DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Hướng dẫn pha dung dịch chuẩn 1àm việc IAA 24 Bảng 4.1 Kết tổng hợp đặc điểm hình thái sinh hóa chủng vi khuẩn tuyển chọn 39 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Hình ảnh dứa 16 Hình 3.1 Cách pha lỗng mẫu đất để phân lập 22 Hình 4.1 Kết phân lập vi khuẩn vùng rễ Dứa 30 Hình Hình thái khuẩn lạc số chủng vi khuẩn vùng rễ phân lập từ Dứa 31 Hình 4.3 Kết đồ thị đường chuẩn IAA 31 Hình 4.4 Hàm lượng IAA (µg/ml) tổng hợp chủng vi khuẩn vùng rễ Dứa 33 Hình 4.5 Khảo sát khả phân giải phosphate khó tan chủng vi khuẩn vùng rễ 34 Hình 4.6 Khảo sát khả sinh siderophore chủng vi khuẩn phân lập 35 Hình 4.7 Khảo sát khả sinh protease chủng vi khuẩn vùng rễ 36 Hình 4.8 Khảo sát hoạt tính amylase chủng vi khuẩn vùng rễ 37 Hình 4.9 Khảo sát hoạt tính cellulase chủng vi khuẩn vùng rễ 37 Hình 4.10 Hình thái tế bào chủng vi khuẩn tuyển chọn 38 Hình 4.11 Ảnh hưởng thời gian đến khả sinh IAA chủng vi khuẩn tuyển chọn 40 Hình 4.12 Ảnh hưởng pH đến khả sinh IAA chủng vi khuẩn 41 Hình 4.13 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh IAA chủng vi khuẩn 42 Hình 4.14 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến khả sinh IAA chủng vi khuẩn tuyển chọn 43 vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Giải nghĩa µg Microgram Ml Milliliter µl Microliter Mg Milligram ĐC Đối chứng LB Luria and Bertani NXB Nhà xuất PGPR Plant Growth Promoting Rhizobacteria sp Species UV Ultra Violet IAA β-indol-acetic acid cs Cộng CAS Chorome Azurol S CMC Carboxymethyl cellulose viii TĨM TẮT Vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng thực vật (Plant Growth Promoting Rhizobacteria-PGPR) vi khuẩn đất, sinh sống xung quanh bề mặt rễ, trực tiếp gián tiếp tham gia việc kích thích sinh trưởng phát triển thực vật thơng qua sản xuất tiết chất hóa học khác xung quanh vùng rễ Từ mẫu đất vùng rễ Dứa thu thập địa điểm: xã Hỏa Tiễn tỉnh Hậu Giang xóm Kẹm, xã Minh Đức, huyện Việt Yên, tỉnh Bắc Giang phân lập 14 chủng vi khuẩn vùng rễ có 13 chủng có khả sinh IAA, chủng có khả phân giải phosphate khó tan chủng có khả sinh siderophore Qua sàng lọc, chọn chủng vi khuẩn (B1, B5, N4.1) mang đặc tính bật, có khả kích thích sinh trưởng tốt Cả chủng vi khuẩn có khả sinh IAA với hàm lượng cao, chủng B5 có khả sinh IAA cao chủng phân lập từ vùng rễ dứa (46,03 µg/ml); Chủng B1 vừa có khả sinh IAA với hàm lượng cao (39,4 µg/ml) vừa có khả phân giải photphat khó tan; Chủng N4.1 vừa có khả sinh IAA (28,8 µg/ml) vừa có khả sinh siderophore ix PHỤ LỤC Xác định khả sinh IAA chủng vi khuẩn vùng rễ Khảo sát khả sinh siderophore 50 Khảo sát khả hòa tan photphat 4.MR 51 5.Citrate 6.Ure 7.Catalase 52 Khả di động 53 Hoạt tính protease 54 10 Hoạt tính cellulase 55 11 Hoạt tính amylase 56 12 Ảnh hưởng thời gian đến khả sinh IAA Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày 57 13 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh IAA 58 14 Ảnh hưởng PH đến khả sinh IAA 59 15 Ảnh hưởng nguồn Cacbon đến khả sinh IAA 60 16 Hình thái khuẩn lạc nhuộm gram Tên Hình thái khuẩn lạc Hình thái tế bào chủng N1.1 N2.1 N3.1 61 N4.1 N5.1 N6.1 N7.1 62 B1 B2 B4 B5 63 B6 B7 64