Sàng lọc hoạt tính ức chế hình thành mầm tinh thể calcium oxalate liên quan đến bệnh sỏi thận của một số mẫu dứa dại (pandanus tectorius parkinson ex du roi)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP SÀNG LỌC HOẠT TÍNH ỨC CHẾ HÌNH THÀNH MẦM TINH THỂ CALCIUM OXALATE LIÊN QUAN ĐẾN BỆNH SỎI THẬN CỦA MỘT SỐ MẪU DỨA DẠI (PANDANUS TECTORIUS PARKINSON EX DU ROI) Sinh viên thực hiện: Nguyễn Trung Thành Khoa: Công nghệ Sinh học MSV: 620414 Lớp: K62CNHSA GVHD: PGS.TS Nguyễn Văn Giang PGS.TS Nguyễn Tiến Đạt Hà Nội 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn PGS TS Nguyễn Văn Giang PGS.TS Nguyễn Tiến Đạt Số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực chưa sử dụng công bố Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực khóa luận cảm ơn tồn trích dẫn khóa luận có trích dẫn rõ ràng Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Sinh viên Nguyễn Trung Thành i LỜI CẢM ƠN Trong suốt q trình thực tập hồn thành khóa luận tốt nghiệp, tơi nhận giúp đỡ nhiệt tình nhiều tập thể cá nhân Đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Văn Giang, môn Công nghệ vi sinh, Học viện Nông nghiệp Việt Nam PGS.TS Nguyễn Tiến Đạt, Trung Tâm Nghiên Cứu Và Chuyển Giao Công Nghệ - Viện Hàn Lâm Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam tận tâm hướng dẫn, khuyến khích, giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành khóa luận tốt nghiệp Trong thời gian thực tập vừa qua nhận giúp đỡ hướng dẫn tận tình tập thể anh chị cán trung tâm Tôi xin chân thành cảm ơn trợ giúp q báu Tơi xin bày tỏ lời cảm ơn đến Ban chủ nhiệm khoa quý thầy, cô khoa Công nghệ sinh học trực tiếp giảng dạy, trang bị kiến thức bổ ích suốt thời gian em học tập trường Qua đây, xin bày tỏ lịng cảm ơn sâu sắc, chân thành tới gia đình, bạn bè động viên giúp đỡ suốt thời gian thực khóa luận tốt nghiệp Mặc dù có nhiều cố gắng nỗ lực thân Tuy nhiên, thiếu sót, hạn chế báo cáo tránh khỏi Tôi mong nhận ý kiến đóng góp quý thầy, giáo để khóa luận hồn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Sinh viên Nguyễn Trung Thành ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC ĐỒ THỊ, BIỂU ĐỒ, HÌNH ẢNH vii PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích: 1.2.2 Yêu cầu: PHẦN 2: TỔNG QUAN 2.1 Cơ chế tác động tinh thể calcium oxalate (CaOx) 2.2 Một số phương pháp đánh giá hoạt tính chống sỏi thận 2.2.1 Phương pháp thử nghiệm mơ hình in vitro 2.2.2 Phương pháp thử nghiệm mô hình in vivo 2.3 Một số sản phẩm có khả chống sỏi thận sử dụng thị trường 2.4 Tổng quan đặc điểm thực vật, phân bố cơng dụng lồi Pandanus tectorius Parkinson ex Du Roi 2.4.1 Đặc điểm 2.4.2 Phân bố công dụng 2.4.3 Thành phần hóa học số nghiên cứu hoạt tính sinh học loài Pandanus tectorius Parkinson ex Du Roi PHẦN 3: NGUYÊN LIỆU, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 3.1 Đối tượng nghiên cứu 13 iii 3.2 Nguyên liệu, vật liệu thiết bị 13 3.2.1 Thiết bị, dụng cụ dùng để thu thập xử lý mẫu 13 3.2.2 Thiết bị, dụng cụ dùng để thử hoạt tính sinh học 14 3.2.3 Mẫu đối chứng 14 3.3 Phương pháp nghiên cứu 15 3.3.1 Phương pháp thu xử lý mẫu 15 3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng thời gian, nồng độ CaOx đến trình hình thành tinh thể calcium oxalate 16 3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng dung dịch đệm lên mẫu cần phân tích 19 3.3.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế tạo mầm tinh thể calcium oxalate 19 3.3.5 Xử lý số liệu 20 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 4.1 Đánh giá ảnh hưởng thời gian, nồng độ CaOx đến trình hình thành tinh thể calcium oxalate 21 4.1.1 Đánh giá ảnh hưởng nồng độ nồng độ CaOx đến trình hình thành tinh thể calcium oxalate 21 4.1.2 Đánh giá ảnh hưởng thời gian đến trình hình thành tinh thể calcium oxalate 22 4.2 Đánh giá ảnh hưởng dung dịch đệm lên mẫu 24 4.3 Đánh giá hoạt tính ức chế tạo mầm tinh thể calcium oxalate mẫu thân P tectorius 25 4.3.1 Kết phân tích thống kê 25 4.3.2 Kết kiểm định t-test 27 4.3.3 Kết phân tích qua hình ảnh 29 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31 5.1 Kết luận 31 5.2 Kiến nghị 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 32  iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Giải thích nghĩa CaOx Calcium Oxalate DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl v DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Tỉ lệ phối trộn CaCl2 Na2C2O4 18 Bảng Tỉ lệ phối trộn đệm Tris HCl với mẫu phân tích 19 Bảng 3: Tỉ lệ trộn CaCl2 4mM Na2C2O4 8mM với mẫu phân tích 20 Bảng Kết đo mật độ tinh thể CaOx tạo thành với nồng độ CaOx khác 21 Bảng Kết đo OD mẫu 24 Bảng Bảng phần trăm ức chế mẫu đối chứng Cystone mẫu thân, loài P tectorius 25 Bảng 4 Kết kiểm định t-test mẫu thân, loài P tectorius nồng độ 28 vi DANH MỤC ĐỒ THỊ, BIỂU ĐỒ, HÌNH ẢNH Biểu đồ Mối tương quan thời gian ủ mật độ tinh thể CaOx tạo thành 23 Biểu đồ Biểu đồ Boxplot biểu diễn so sánh mẫu thân loài P tectorius nồng độ (a) 20 µg/mL, (b) 50 µg/mL, (c) 100 µg/mL 27 Hình Các ảnh tinh thể CaOx theo quan sát kính hiển vi trường hợp khơng có Daucus carota Hình 2 Ảnh hưởng Daucus carota Cystone đến khả tạo mầm tinh thể calcium oxalate (Bawari, Negi Sah et al 2018) Hình Cây Pandanus tectorius Parkinson ex Du Roi Hình Mẫu dứa dại thu thập xã Cao Viên (Pandanus tectorius) 13 Hình Thiết bị quay cao chiết sau chiết 15 Hình Mẫu Cystone làm đối chứng 16 Hình Khả tạo mầm tinh thể CaOx khơng có mẫu thí nghiệm 30 Hình Khả tạo mầm tinh thể CaOx khỉ có cao chiết Cystone nồng độ 20-50-100 µg/mL a1, a2, a3 30 Hình Khả tạo mầm tinh thể CaOx có cao chiết P tectorius nồng độ 20-50-100 µg/mL b1, b2, b3 30 Hình 4 Khả tạo mầm tinh thể CaOx có cao chiết thân P tectorius nồng độ 20-50-100 µg/mL c1, c2, c3 30 vii TÓM TẮT Với mục đích nghiên cứu đề tài “sàng lọc hoạt tính ức chế hình thành mầm tinh thể calcium oxalate liên quan đến bệnh sỏi thận số mẫu dứa dại (Pandanus tectorius Parkinson ex Du Roi)” thực để đánh giá hiệu ức chế khả tạo mầm tinh thể calcium oxalate Mẫu thân dứa dại chiết phương pháp ngâm với methanol bể rung siêu âm 3040oC để tạo cao chiết Kết cho thấy nồng độ thích hợp CaCl2 Na2C2O4 để mầm tinh thể tạo tối ưu CaCl2 4mM Na2C2O4 8mM Thời gian ủ tối ưu cho phản ứng tạo mầm tinh thể 30 phút phản ứng mẫu với dung dịch đệm Tris-HCl (0,05M NaCl 0,15M với pH 6,5) tạo dung dịch suốt không ảnh hưởng đến kết thí nghiệm Cao chiết từ thân lồi Pandanus tectorius có khả ức chế tạo mầm tinh thể calcium oxalate in vitro thể hiệu ức chế tốt so với mẫu đối chứng Cystone nồng độ 20,50,100 μg/mL Đặc biệt hiệu ức chế thể rõ rệt phần thân loài với hiệu ức chế đạt 61,73% ± 3,18 nồng độ 100 μg/mL so với phần đạt 46,86 ± 4,15 Cystone đạt 24,72% nồng độ viii PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Sỏi thận rối loạn hệ tiết niệu gây nên nhiều tổn thương nghiêm trọng cho vùng thận bệnh hành hạ nhiều người giới nhiều thập kỷ Bệnh thường gặp nam giới phụ nữ trẻ em Sỏi thận tinh thể dạng rắn, cứng hình thành thận Chủ yếu sỏi calcium oxalate sỏi calcium phos-phate Sỏi có kích thước nhỏ, thể người thải ngồi mà không gây ảnh hưởng đến sức khỏe người bệnh Ngược lại, sỏi có kích thước lớn làm tắt nghẽn đường tiết niệu gây đau cho bệnh nhân Nếu tinh thể đủ nhỏ, chúng di chuyển qua đường tiết niệu thoát khỏi thể theo nước tiểu mà không nhận biết Những viên sỏi lớn di chuyển thận, niệu quản, bàng quang gây cọ xát dẫn tới tổn thương chí làm tắc đường dẫn nước tiểu để lại hậu khôn lường Trên giới có nhiều nghiên cứu in vitro, in vivo thử nghiệm lâm sàng cho thấy phương pháp điều trị dược liệu tự nhiên từ loại thuốc, thảo mộc Một số lượng lớn loài thực vật sử dụng Ấn Độ từ thời cổ đại, chúng cơng nhận có tác dụng chữa bệnh sỏi tiết niệu (Patel, Patel et al 2012) Hiện nay, thị trường có số tân dược có khả điều trị sỏi thận tân dược có nguồn gốc tự nhiên giúp tăng cường chức thận giúp thận tiết sỏi thận chưa đạt hiệu tối ưu Ngoài ra, biện pháp y khoa có hiệu việc điều trị sỏi calcium oxalate có nguy tái phát 50% gây nhiều tác dụng phụ tổn thương mạch máu thận quan xung quanh, tăng nguy cao huyết áp (McAteer and Evan 2008) Hiện Việt Nam có nghiên cứu nhắm tới khả ức chế hình thành tinh thể calcium oxalate Do vậy, mục đích đề tài sàng lọc hoạt tính ức chế hình thành tinh thể calcium oxalate cho số loài thực vật, thảo dược Thực hiện: Bước 1: Các dung dịch CaCl2 4mM, NaC2O4 mM pha hỗn hợp đệm Tris HCl (0,05 M NaCl 0,15 M, pH = 6.5) Bước 2: Chuẩn bị mẫu đối chứng Cystone, mẫu thí nghiệm cao chiết thân P tectorius nồng độ 20-50-100 µg/mL Bước 3: Tra vào giếng 40µl CaCl2 4mM 40 µl dung dịch mẫu thí nghiệm mẫu đối chứng sau bổ sung 160 µl NaC2O4 mM Mỗi phản ứng lặp lại giếng Bảng 3: Tỉ lệ trộn CaCl2 4mM Na2C2O4 8mM với mẫu phân tích Nồng độ Thể tích Thể tích Thể tích Tổng thể CaCl2 4mM Cao mẫu Na2C2O4.8mM tích (µl) (µl) (µl) (µ1) Blank 40 40 (H2O) 160 240 20 40 40 160 240 50 40 40 160 240 100 40 40 160 240 mẫu thí nghiệm đối chứng Bước 4: Đem ủ 37ºC 30 phút Bước 5: Mật độ quang hỗn hợp đo bước sóng 620 nm Bước 6: Phần trăm ức chế mẫu thử mẫu đối chứng tính theo công thức: %Inhibition =[1-(ODmẫu thực/ODkhông chứa mẫu)]*100 (Bawari, Negi Sah et al 2018) 3.3.5 Xử lý số liệu - Số liệu tập hợp xử lý excel - %Inhibition = [1-(ODmẫu thực/ODkhông chứa mẫu)] * 100 - Kiểm định t-test R 20 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Đánh giá ảnh hưởng thời gian, nồng độ CaOx đến trình hình thành tinh thể calcium oxalate 4.1.1 Đánh giá ảnh hưởng nồng độ nồng độ CaOx đến trình hình thành tinh thể calcium oxalate Bảng Kết đo mật độ tinh thể CaOx tạo thành với nồng độ CaOx khác Mật độ quang trung bình (n=5) Blank Có chứa CaOx CaCl2 2mM CaCl2 3mM CaCl2 4mM Na2C2O4 4mM Na2C2O4 6mM Na2C2O4 8mM 0,042 ± 1x10^4 0,042 ± 1x10^4 0,042 ± 1x10^4 0,075 ± 3x10^3 0,119 ± 6x10^3 0,191 ± 9x10^3 Lựa chọn nồng độ tạo mầm tinh thể thích hợp yếu tố cần thiết việc đánh giá hoạt tính mẫu thí nghiệm Mật độ mầm tinh thể tạo phải mức định Nếu mật độ tạo q ảnh hưởng đến việc tính tốn tỉ lệ phần trăm ức chế mẫu, khó quan sát giảm mật độ qua kết soi kính hiển vi Nếu mật độ tạo nhiều xảy tượng bão hịa, phản ứng khơng cịn giai đoạn tạo mầm mà chuyển sang giai đoạn tăng trưởng Vì ta phải lựa chọn nồng độ CaCl2 Na2C2O4 cho phù hợp để phản ứng tạo mầm tinh thể calcium oxalate tối ưu Từ bảng 4.1 ta thấy số OD giếng có chứa hỗn hợp CaCl2 2mM Na2C2O4 mM 0,075 gần số đo giếng blank (giếng trắng) Điều đồng nghĩa với việc khả tạo mầm tinh thể calcium oxalate CaCl2 2mM Na2C2O4 4mM thấp khơng thể thực cho thí nghiệm Với CaCl2 3mM Na2C2O4 6mM mật độ tạo mầm tinh thể 21 CaOx tăng lên 0,119 thấp để áp dụng cho cơng thức tính tốn phần trăm ức chế cách xác Khi tăng nồng độ CaCl2 Na2C2O4 lên CaCl2 4mM Na2C2O4 8mM mật độ tạo tinh thể đạt 0,191 phù hợp để thực thí nghiệm Mật độ quang gấp lần so với mật độ quang giếng trắng nên ta dễ dàng áp dụng vào cơng thức tính phần trăm ức chế để có kết phù hợp Hơn độ quang mật độ mầm tinh thể tạo vừa đủ, khơng q nhiều khơng q nên ta dễ dàng quan sát suy giảm mật độ thêm mẫu thí nghiệm mẫu đối chứng vào Mật độ tạo tinh thể tương tự A Mittal cộng ông thực hiện(Mittal, Tandon et al 2016) Kết luận ta lựa chọn CaCl2 4mM Na2C2O4 8mM hai nồng độ thích hợp dùng để thực cho phản ứng tạo mầm tinh thể calcium oxalate 4.1.2 Đánh giá ảnh hưởng thời gian đến trình hình thành tinh thể calcium oxalate Trong trình hình thành mầm tinh thể calcium oxalate yếu tố thời gian yếu tố quan trọng làm ảnh hưởng đến khả tạo mầm Phải khoảng thời gian định hỗn hợp muối CaCl2 Na2C2O4 phản ứng với Trong khoảng thời gian đó, phân tử chất tan phân tán dung môi bắt đầu tập hợp thành cụm, hình thành mầu tinh thể nhỏ phản ứng xảy hoàn toàn, mức độ tạo mầm tinh thể tối ưu Chính ta cần phải xác định khoảng thời gian phản ứng xảy hoàn toàn, mức độ tạo mầm tinh thể ổn định để tăng xác trình đánh giá khả ức chế 22 0.2500 0.2250 0.2000 0.1750 CaCl2 2mM Na2C2O4 4mM 0.1500 0.1250 CaCl2 3mM Na2C2O4 6mM 0.1000 0.0750 CaCl2 4mM Na2C2O4 8mM 0.0500 0.0250 0.0000 10 20 30 40 50 60 70 Biểu đồ Mối tương quan thời gian ủ mật độ tinh thể CaOx tạo thành Qua biểu đồ 4.1, ta thấy thời gian ủ tối ưu để phản ứng tạo mầm tinh thể CaOx xảy hoàn toàn sau 30 phút 37ºC Trong khoảng từ đến 30 phút đầu khoảng thời gian phản ứng chất tan tương tác với nhau, hình thành muối có Ca2C2O4 mầm tinh thể, mà mức độ tạo tinh thể khoảng thời gian chưa ổn định Điều thể qua số OD tăng dần lên từ 0,063 đến 0,075 30 phút nồng độ CaCl2 2mM Na2C2O4 4mM Tương tự nồng độ CaCl2 3mM Na2C2O4 6mM, 30 phút đầu số OD tăng từ 0.1 0.119 từ 0,177 lên 0,192 tương ứng với nồng độ CaCl2 4mM Na2C2O4 8mM Từ sau 30 phút ta thấy qua điểm nối, phản ứng xảy hoàn toàn Mật độ tạo tinh thể ổn định mức định Với phản ứng CaCl2 2mM Na2C2O4 4mM, mật độ tạo mầm trì mức 0,076 Tương tự phản ứng CaCl2 3mM với Na2C2O4 6mM ổn định mức 0,119 0,192 phản ứng CaCl2 4mM với Na2C2O4 8mM Ta kết luận thời gian ủ tối ưu để phản ứng kết tinh tạo mầm xảy hoàn toàn 30 phút Thời gian ủ áp dụng thí nghiệm Mittal.A cộng (Mittal, Tandon et al 2016) 23 4.2 Đánh giá ảnh hưởng dung dịch đệm lên mẫu Phản ứng dung dịch đệm mẫu thí nghiệm yếu tố gây ảnh hưởng đến khả đánh giá hoạt tính mẫu thí nghiệm Trong mẫu cao chiết thí nghiệm có nhiều hợp chất có tính chất hóa học khác mà ta chưa xác định được, ta cho hỗn hợp đệm phản ứng với mẫu thí nghiệm có số trường hợp gây ảnh hưởng xảy dung dịch tạo kết tủa dung dịch tạo màu, có vẩn đục giếng Nguyên nhân phân tử chất tan dung dịch đệm có khả phản ứng với hợp chất có mẫu thí nghiệm Điều làm cho kết phép bị sai lệch Đánh giá bị nhầm lẫn kết ảnh hưởng dung dịch đệm với kết tạo mầm tinh thể calcium oxalate Điều ta cần hỗn hợp đệm mẫu thí nghiệm phải tan hồn toàn với tạo dung dịch suốt (kết đo OD hỗn hợp phải với kết đo OD giếng không cho hỗn hợp phản ứng) Khi ta cho hỗn hợp CaCl2 Na2C2O4 để tạo mầm tinh thể kết biểu kết khả tạo mầm tinh thể hai muối CaCl2 Na2C2O4 không bị lẫn với kết ảnh hưởng dung dịch đệm gây Kết đo OD ảnh hưởng đệm lên mẫu thử nghiệm: Bảng Kết đo OD mẫu Cao chiết Lần Lần Lần Trung bình Blank 0,043 0,042 0,042 0,042 ± 1x10^3 Cao Cystone 0,044 0,045 0,045 0,045 ± 1x10^3 Cao tổng thân P tectorius 0,046 0,046 0,046 0,046 ± 1x10^4 Cao tổng P tectorius 0,046 0,047 0,044 0,047 ± 2x10^3 Qua bảng 4.2, bốn mẫu phân tích có kết đo OD tương tự với mẫu blank chứng tỏ mẫu tan hoàn toàn đệm Tris HCl (0,05M NaCl 0,15M, pH = 6,5) tạo dung dịch suốt, không tạo màu, kết tủa hay vẩn đục q trình phản ứng Ta kết luận dung dịch đệm không ảnh hưởng đến mẫu thí nghiệm, đủ điều kiện để đánh giá khả ức chế 24 mẫu xác 4.3 Đánh giá hoạt tính ức chế tạo mầm tinh thể calcium oxalate mẫu thân P tectorius 4.3.1 Kết phân tích thống kê Kết đo số OD trung bình thể mật độ tạo mầm tinh thể calcium oxalate mẫu thí nghiệm Để đánh giá hoạt tính ức chế mẫu ta so sánh kết OD mẫu so với kết OD khơng có mẫu Mẫu thí nghiệm có hoạt tính mạnh số OD giảm so với số OD khơng có mẫu, đồng nghĩa với mẫu thí nghiệm thể hoạt tính ức chế tốt Để đánh giá xác khả ức chế mẫu thí nghiệm ta áp dụng công thức: %Inhibition = [1-(ODmẫu thực/ODkhông chứa mẫu)] * 100 Kết bảng, biểu đồ thể phần trăm ức chế mẫu đối chứng Cystone mẫu thân, loài P tectorius cần đánh giá hoạt tính Từ ta đánh giá mức độ biểu hoạt tính mẫu thân, loài P tectorius so với mẫu đối chứng Cystone chứng minh trước hiệu ức chế tạo mầm tinh thể calcium oxalate Bảng Bảng phần trăm ức chế mẫu đối chứng Cystone mẫu thân, loài P tectorius Nồng độ (µg/mL) Các mẫu Cystone Lá Lá Lá Lá Lá Lá Thân Thân Thân Thân Thân Thân 20 18,03 25,16 22,45 27,72 26,87 25,51 24,77 27,65 26,20 35,18 34,33 30,54 31,28 25 50 % Inhibition 19,7 30,92 31,34 38,81 37,74 35,75 35,20 42,00 41,16 52,67 54,80 46,00 44,69 100 24,72 42,86 41,36 51,81 50,75 47,49 46,93 59,04 59,67 66,31 65,25 60,34 59,78 Từ bảng 4.3, ta thấy khả ức chế tạo mầm tinh thể CaOx cao chiết thân P tectorius thể tốt, tốt nhiều so với mẫu đối chứng Cystone Khả ức chế mẫu đối chứng Cystone cho hiệu mức 24,72% nồng độ 100 µg/mL tương tự kết Arjuna A Mittal cộng khảo sát (Mittal, Tandon et al 2016) Mật độ tạo mầm tỉnh thể CaOx cao chiết loài P tectorius giảm đáng kể so với mẫu đối chứng Cystone Phần trăm ức chế Cystone đạt 20% nồng độ Cystone 20 µg/mL 50 µg/mL, phần trăm ức chế cao chiết thân loài P tectorius thể tốt hẳn, ta thấy rõ nồng độ 20 µg/mL biểu khoảng 26,20% - 35,18% 41,16% - 54,8% nồng độ 50 µg/mL Đáng ý nồng độ 100 µg/mL cao chiết thân P tectorius hiệu ức chế thể mức cao đạt 66,31% mẫu thân với mẫu thân đạt 60,34%, số cao nhiều so với 24,72% mẫu đối chứng Cystone nồng độ Đối với phần cao chiết từ loài P tectorius khả ức chế tạo mầm thể tốt so với mẫu đối chứng Cystone nhiều Ở nồng độ 20 µg/mL cao chiết lồi P tectorius cho hiệu ức chế tương đương với mẫu Cystone nồng độ 100 µg/mL, hiệu đạt khoảng 22,45% 27,72% Càng tăng nồng độ dịch chiết cho vào hiệu ức chế thể tốt Hiệu ức chế tăng lên 30% nồng độ 50 µg/mL 40% nồng độ 100 µg/mL Tuy nhiên ta thấy hiệu ức chế phần thể yếu so với phần thân Có thể khẳng định hoạt tính ức chế tạo mầm tinh thể calicum oxalate loài P tectorius tốt rõ rệt so với đối chứng Cystone Đặc biệt hoạt tính thể rõ phần thân lồi, cịn phần hoạt tính biển yếu chút Các kết cao chiết thân, lồi P.tectorius thể hoạt tính tốt so với số nghiên cứu công bố gần tác giả Nguyễn Phạm Tuấn cộng (Tuấn, et al 2020), họ đánh giá hoạt tính cao chiết từ Rau Sam cho hiệu ức chế 19,54% nồng độ 26 250 µg/mL Tương tự với nghiên cứu khác cao chiết chuối (Musa sp.) đạt hiệu ức chế 55,39% nồng độ 2mg/mL (Abu Zarin, Tan et al 2020) Hay nghiên cứu khác chứng minh hiệu ức chế từ cao chiết cà rốt (Daucus carota L Roots) đạt 40% nồng độ 800 µg/mL (Bawari, Negi Sah et al 2018) 4.3.2 Kết kiểm định t-test (a) (b) (c) Biểu đồ Biểu đồ Boxplot biểu diễn so sánh mẫu thân loài P tectorius nồng độ (a) 20 µg/mL, (b) 50 µg/mL, (c) 100 µg/mL Qua biểu đồ 4.2 boxplot thể phân bố phân tán số liệu mẫu thí nghiệm trên, thấy điều nồng độ mẫu thử cao boxplot mẫu thân mẫu cách xa chứng tỏ tăng nồng độ lên 27 khác biệt hoạt tính ức chế tạo mầm tinh thể calcium oxalate thể rõ rệt Tuy nhiên, ta nên sử dụng thêm phương pháp t-test để đánh giá chi tiết khác biệt mang ý nghĩa thống kê nhóm mẫu Để minh chứng rõ ràng hoạt tính ức chế tạo mầm tinh thể calcium oxalate cao chiết loài P tectorius, ta sử dụng phương pháp kiểm định t-test để kiểm định khác biệt phần trăm giá trị trung bình hoạt tính ức chế phần thân so với phần lồi P tectorius Mục đích phương pháp kiểm định đưa kết luận có giá trị mang ý nghĩa thống kê hiệu hoạt tính mẫu thí nghiệm Bảng 4 Kết kiểm định t-test mẫu thân, loài P tectorius nồng độ Mẫu Số mẫu Phân trăm ức chế (%) (TB ± độ lệch t-test p 2,89 0,02 4,50 0,002 chuẩn) Lá (C= 20 μg/mL) 25,41 ± 1.83 Thân (C= 20 μg/mL) 30,86 ± 3.55 Lá (C= 50 μg/mL) 34,96 ± 3,24 Thân (C= 50 μg/mL) 46,89 ± 5,63 Lá (C= 100 μg/mL) 46,86 ± 4,15 Thân (C= 100 μg/mL) 61,73 ± 3,18 6,96 5.44 x 105 Ta thấy phần trăm ức chế trung bình cao chiết phần thân phần nồng độ 20 ug/mL 30,84% 25,41% Như vậy, phần trăm ức chế thể phần thân cao khoảng 5,43% so với phần Tương tự nồng độ 50 ug/mL phần trăm ức chế trung bình phần thân đạt 46,89% cao khoảng 11,93% so với phần đạt hiệu mức 34,96% Khi tiếp tục tăng nồng độ mẫu cho vào lên 100 ug/mL khoảng cách phần trăm ức chế trung bình phần thân tăng lên, ta thấy phần trăm ức chế phần thân cao khoảng 14,87% so với phần Chứng tỏ phần thân 28 loài P tectorius có chứa nhiều hợp chất mang hoạt tính ức chế tạo mầm tinh thể calcium oxalate phần Đặc biệt, tất mẫu qua kiểm định ttest cho giá trị p < 0,05, chứng tỏ khác biệt hoạt tính ức chế mẫu có ý nghĩa thống kê Giá trị t-test phản ánh tỷ lệ khác biệt số liệu thực tế với giá trị kì vọng nhóm mẫu thử độ lệch chuẩn phép thử Giá trị t-test lớn chứng tỏ phương pháp ổn định đáng tin cậy Qua bảng 4.4 ta thấy đánh giá phần trăm ức chế mẫu nồng độ cao giá trị t-test tăng lên, chứng tỏ nồng độ mẫu thí nghiệm cao độ ổn định phép thử tốt khác biệt nhóm mẫu thử nghiệm bộc lộ rõ hơn, đồng nghĩa với việc kết có ý nghĩa thơng kê 4.3.3 Kết phân tích qua hình ảnh Để thấy rõ khả ức chế mẫu thí nghiệm ta quan sát hình ảnh thể khả tạo mầm tinh thể calcium oxalate soi kinh hiển vi Ta thấy hình 4.1, chưa bổ sung mẫu thí nghiệm vào phản ứng mật độ mầm tinh thể tạo nhiều dày đặc Nhưng có thêm mẫu thí nghiệm đối chứng vào khả tạo mầm tinh thể bắt đầu giảm Qua quan sát so sánh hình 4.1, hình 4.2, hình 4.3, hình 4.4, hiệu ức chế tạo mầm có thêm mẫu cao chiết thân loài P tectorius thể tốt rõ rệt so với bổ sung mẫu đối chứng Cystone Càng nồng độ cao mật độ tinh thể xuất thưa dần Đặc biệt nồng độ 100 µg/mL mẫu thân P tectorius (hình b3 c3), ta thấy rõ ràng mầm tinh thể calcium oxalate xuất với mật độ đáng kể so với mẫu đối chứng Cystone (hình a3), khơng cịn xuất mầm tinh thể lớn sắc nét Đánh giá minh chứng rõ ràng hiệu ức chế tạo mầm tinh thể CaOx cao chiết thân lồi P tectorius 29 Hình Khả tạo mầm tinh thể CaOx khơng có mẫu thí nghiệm a1 a2 a3 Hình Khả tạo mầm tinh thể CaOx khỉ có cao chiết Cystone nồng độ 20-50-100 µg/mL a1, a2, a3 b1 b2 b3 Hình Khả tạo mầm tinh thể CaOx có cao chiết P tectorius nồng độ 20-50-100 µg/mL b1, b2, b3 c1 c2 c3 Hình 4 Khả tạo mầm tinh thể CaOx có cao chiết thân P tectorius nồng độ 20-50-100 µg/mL c1, c2, c3 30 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận - Lựa chọn CaCl2 4mM Na2C2O4 8mM nồng độ phù hợp để tạo phản ứng tạo mầm tinh thể calcium oxalate - Lựa chọn thời gian ủ tối ưu cho phản ứng tạo mầm tinh thể calcium oxalate 30 phút - Khẳng định dung dịch đệm Tris-HCl (0,05M NaCl 0,15M với pH 6,5) không ảnh hưởng đến mẫu thí nghiệm đối chứng - Các kết thí nghiệm tạo mầm cho thấy hai cao chiết từ thân lồi Pandanus tectorius có khả ức chế tạo mầm tinh thể calcium oxalate in vitro tốt Đặc biệt hiệu ức chế thể rõ rệt phần thân loài - Hiệu ức chế in vitro cao chiết từ hai phận thân loài tốt nhiều so với cao chiết từ chế phẩm Cystone cơng nhận lưu hành rộng rãi ngồi thị trường hiệu ngăn ngừa sỏi thận 5.2 Kiến nghị - Cần thực tiếp thí nghiệm ức chế kết tập bào mòm tinh thể calcium oxalate thấy khả rõ rệt việc ngăn ngừa trình hình thành tinh thể calcium oxalate in vitro - Nghiên cứu phân tách thành phần hóa học có Pandanus tectorius để xác định hợp chất có khả ức chế tinh thể calcium oxalate 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Tran Vinh Hung, Hướng dẫn chuẩn đoán điều trị năm 2021:Tập 2-Ngoại tiết niệu 2017: p 64-78 Tuấn, N.P., et al., Ảnh hưởng dịch chiết rau sam (Portulaca oleracea L.) lên hình thành tinh thể calcium oxalate gây bệnh sỏi thận điều kiện in vitro Hội nghị công nghệ sinh học Việt Nam, 2020: p 821-827 Tuan, N.P., et al., Ảnh hưởng dịch triết BlumÉa Balsamifera lên ức chế hình thành tinh thể Calcium Oxalate gây bệnh sỏi thận điều kiện in vitro Dalat University Journal of Science, 2021 11(1): p 3-13 Bích, Đ.H., et al., Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam Tập NXB Khoa học Kỹ thuật, 2006 p 700-710 Cường, N.M., et al., Chiết tách số chất thuộc nhóm phenolic từ dứa dại Pandanus odoratissimus L f Tạp chí Hóa học, 2015 53(4): p 432-435 Trị, M.Đ., et al., Thành phần hóa học từ dứa dại Pandanus tectorius Sol., in Hội thảo NC&PT sản phẩm tự nhiên lần 2012 Nguyen, T.P., et al., A new dihydrofurocoumarin from the fruits of Pandanus tectorius Parkinson ex Du Roi Natural Product Research, 2016 30(21): p 2389-2395 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG ANH Patel, P.K., et al., Antiurolithiatic activity of saponin rich fraction from the fruits of Solanum xanthocarpum Schrad & Wendl (Solanaceae) against ethylene glycol induced urolithiasis in rats J Ethnopharmacol, 2012 144(1): p 160-170 McAteer, J.A and A.P Evan, The acute and long-term adverse effects of shock wave lithotripsy Semin Nephrol, 2008 28(2): p 200-213 Bawari, S., A Negi Sah, and D Tewari, Antiurolithiatic Activity of Daucus carota: An In vitro Study Pharmacognosy Journal, 2018 10(5): p 880-884 Kasote, D.M., et al., Herbal remedies for urinary stones used in India and China: A review Journal of Ethnopharmacology, 2017 203: p 55-68 Saha, S and R.J Verma, Inhibition of calcium oxalate crystallisation in vitro by an extract of Bergenia ciliata Arab J Urol, 2013 11(2): p 187-192 Mosquera, D.M.G., et al., Antiurolithiatic activity of Boldoa purpurascens aqueous extract: An in vitro and in vivo study Journal of Ethnopharmacology, 2020 253: p 112691 Suman, S and S.V.S Kumar, Antiurolithiatic Activity of Ethanolic Extract of Piper cubeba Dried Fruits: An in-vitro and in-vivo Study Pharmacognosy Journal, 2020 12(6): p 1289-1296 Mittal, A., et al., In vitro inhibition of calcium oxalate crystallization and crystal adherence to renal tubular epithelial cells by Terminalia arjuna Urolithiasis, 2016 44(2): p 117-125 Siddiqui, W.A., et al., Evaluation of anti-urolithiatic and diuretic activities of watermelon (Citrullus lanatus) using in vivo and in vitro experiments Biomed Pharmacother, 2018 97: p 1212-1221 32 10 Zhou, J., et al., Total flavonoids of Desmodium styracifolium attenuates the formation of hydroxy-L-proline-induced calcium oxalate urolithiasis in rats Urolithiasis, 2018 46(3): p 231-241 11 Zhang, X., et al., Phenolic compounds and flavonoids from the fruits of Pandanus tectorius Soland Journal of Medicinal Plants Research, 2012 6(13): p 2622-2626 12 Andriani, Y., et al., Phytochemical analysis, antioxidant, antibacterial and cytotoxicity properties of keys and cores part of Pandanus tectorius fruits Arabian Journal of Chemistry, 2019 12(8): p 3555-3564 13 Musa, N.S., et al., Antioxidant and cytotoxicity properties of ethyl acetate fractions of Pandanus tectorius fruit against HeLa cell lines ALOTROP Jurnal Pendidikan dan Ilmu Kimia, 2017 1(2): p 106-112 14 Erickson, S.B., T.J Vrtiska, and J.C Lieske, Effect of Cystone(R) on urinary composition and stone formation over a one year period Phytomedicine, 2011 18(10): p 863-867 15 Abu Zarin, M., et al., Investigation of potential anti-urolithiatic activity from different types of Musa pseudo-stem extracts in inhibition of calcium oxalate crystallization BMC Complement Med Ther, 2020 20(1): p 317 33 Học viện Nông nghiệp Việt Nam Cộng hịa xã hội chủ nghĩa Việt Nam Khoa Cơng nghệ sinh học Độc lập – Tự Do – Hạnh Phúc BẢNG NHẬN XÉT SINH VIÊN LÀM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Nguyễn Trung Thành Lớp: K62CNSHA Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Tên đề tài Khóa luận tốt nghiệp: “Sàng lọc hoạt tính ức chế hình thành mầm tinh thể Calcium Oxalate liên quan đến bệnh sỏi thận số mẫu dứa dại ( Pandanus tectorius Parkinson Ex Du Roi)” Thời gian thực hiện: Từ tháng năm 2021 đến tháng năm 2021 Địa điểm thực hiện: Phịng Ứng dụng hóa sinh - Trung Tâm Nghiên Cứu Và Chuyển Giao Công Nghệ - Viện Hàn Lâm Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam Ý KIẾN NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Tinh thần, thái độ học tập thực Khóa luận tốt nghiệp: Học viên Nguyễn Trung Thành chăm chỉ, có tinh thần học hỏi cao Là người thân thiện, hịa đồng, có khả làm việc nhóm Năng lực sáng tạo nghiên cứu viết Khóa luận tốt nghiệp: Hồn thành tốt cơng việc hướng dẫn, có tính sáng tạo hoạt động nghiên cứu khoa học Mức độ hồn thành Khóa luận tốt nghiệp giao:  Hoàn thành tốt:  Hoàn thành:   Chưa hoàn thành:  Kết luận: Sinh viên đủ điều kiện nộp Khóa luận tốt nghiệp:  Sinh viên khơng đủ điều kiện nộp Khóa luận tốt nghiệp:  Hà Nội, ngày 08 tháng 09 năm 2021 Giáo viên hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Tiến Đạt