Sàng lọc và đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư và chống oxy hóa của chủng vi nấm nội sinh trên cây thiết sam núi đá (tsuga chinensis (franch ) pritz ) tại hà giang

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “SÀNG LỌC VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ VÀ CHỐNG OXY HÓA CỦA CHỦNG VI NẤM NỘI SINH TRÊN CÂY THIẾT SAM NÚI ĐÁ (TSUGA CHINENSIS (FRANCH.) PRITZ.) TẠI HÀ GIANG” HÀ NỘI - 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “SÀNG LỌC VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ VÀ CHỐNG OXY HÓA CỦA CHỦNG VI NẤM NỘI SINH TRÊN CÂY THIẾT SAM NÚI ĐÁ (TSUGA CHINENSIS (FRANCH.) PRITZ.) TẠI HÀ GIANG” Sinh viên thực : Dương Thị Vinh Khóa : 63 Ngành : Công nghệ sinh học Người hướng dẫn : TS Vũ Thị Hạnh Nguyên Người hướng dẫn : ThS Nguyễn Thanh Huyền HÀ NỘI – 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực không chép kết nghiên cứu trước Tơi xin cam đoan tài liệu, thơng tin trích dẫn ghi rõ nguồn gốc phần tài liệu tham khảo Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên Dương Thị Vinh i LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin chân thành cảm ơn người hướng dẫn, TS Vũ Thị Hạnh Nguyên, Trung tâm Giống Bảo tồn nguồn gen Vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, cho hội tuyệt vời để thực đề tài nghiên cứu thú vị Cảm ơn giới thiệu cho loại nấm nội sinh, đặc biệt đường chế tổng hợp hoạt chất sinh học, đồng thời dạy cho nhiều kỹ thuật thú vị để sàng lọc loại nấm sản xuất kháng VSV kiểm định, kháng ung thư phân loại Tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt tới PGS TS Phí Quyết Tiến, kiên nhẫn, động lực, nhiệt huyết kiến thức phong phú họ Họ hướng dẫn hỗ trợ tận tình suốt q trình học tập để hồn thành nghiên cứu Luận văn thực nhờ hỗ trợ kinh phí Đề tài: “Nghiên cứu khai thác nấm nội sinh dược liệu địa nhằm thu nhận số hợp chất (paclitaxel số hợp chất khác) có hoạt tính sinh học" cấp Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, mã số TĐCNSH.05/20-22 Em xin chân thành cảm ơn cô giáo ThS Nguyễn Thanh Huyền thuộc Bộ môn Vi sinh vật, Khoa Công nghệ sinh học, Học viện nông nghiệp Viêt Nam Cô giúp đỡ suốt thời gian nghiên cứu viết luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn đến ThS Ngyễn Văn Thế, CN Lê Phương Chi cán (Trung tâm Giống Bảo tồn nguồn gen Vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học) giúp đỡ, hỗ trợ kỹ thuật, chia sẻ tài liệu, kinh nghiệm với suốt q trình thực khóa luận tốt nghiệp Tơi xin cảm ơn người bạn phịng thí nghiệm tơi, bạn Mai Thùy Linh động viên, hỗ trợ đưa thảo luận hữu ích Nhân hội này, tơi xin chân thành cảm ơn tồn thể Thầy/Cô Bộ môn Công nghệ Vi sinh quan tâm, tận tình dạy tơi suốt thời gian qua Đồng thời xin gửi lời cảm ơn đến tồn thể Thầy/Cơ cán Khoa Cơng nghệ Sinh Học dạy dỗ, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian học tập vừa qua Tôi xin cảm ơn Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Lãnh đạo Học viện Thầy/Cô giáo Học viện tạo điều kiện cho thực khóa luận tốt nghiệp Cuối với tất lịng kính trọng biết ơn vơ hạn, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Bố Mẹ người thân nuôi nấng, động viên tạo động lực suốt thời gian qua Tôi xin chân thành cảm ơn! ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii TÓM TẮT viii MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vi nấm nội sinh tiềm khai thác chất có hoạt tính sinh học 1.1.1 Tổng quan vi nấm nội sinh 1.1.2 Tiềm khai thác hoạt tính sinh học từ vi nấm nội sinh 1.1.3 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định vi nấm nội sinh 1.1.4 Hoạt tính chống oxy hóa vi nấm nội sinh 1.1.5 Hoạt tính ức chế tế bào ung thư vi nấm nội sinh 10 1.2 Phân loại định danh nấm sợi 15 1.3 Thiết sam núi đá (Tsuga chinensis (Franch.) Pritz.) tiềm khai thác vi nấm nội sinh 17 1.4 Tình hình nghiên cứu vi nấm nội sinh 19 1.4.1 Tình hình nghiên cứu vi nấm nội sinh giới 19 1.4.2 Tình hình nghiên cứu vi nấm nội sinh Việt Nam 20 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Vật liệu nghiên cứu 23 2.1.1 Chủng giống 23 2.1.2 Hóa chất thiết bị nghiên cứu 23 2.1.3 Môi trường nuôi cấy 24 iii 2.2 Phương pháp nghiên cứu 25 2.2.1 Giữ giống hoạt hóa chủng vi nấm 25 2.2.2 Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 26 2.2.3 Tách chiết hoạt chất sinh học thô từ vi nấm nội sinh 26 2.2.4 Xác định hoạt tính gây độc tế bào ung thư 27 2.2.5 Xác định hoạt tính chống oxy hóa 28 2.2.6 Phân loại vi nấm nội sinh hình thái 29 2.2.7 Phân loại vi nấm dựa vào trình tự gen vùng ITS 31 2.2.8 Xử lý thống kê 31 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào ung thư chung vi nấm nội sinh thiết sam núi đá 32 3.2 Sàng lọc chủng vi nấm có khả kháng vi sinh vật kiểm định thiết sam núi đá 34 3.3 Xác định khả chống oxy hóa chủng vi nấm nội sinh SDF5 37 3.4 Đặc điểm sinh học chủng vi nấm nội sinh tuyển chọn 39 3.4.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc, bào tử cuống sinh bào tử chủng vi nấm nội sinh SDF5 39 3.4.2 Phân loại chủng tuyển chọn dựa trình tự gen ITS 41 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 4.1 Kết luận 44 4.2 Kiến nghị 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ LỤC 56 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số hợp chất hoạt tính sinh học phân lập từ vi nấm nội sinh Bảng 1.2 Các hợp chất chống ung thư từ vi nấm nội sinh có nguồn gốc thực vật 12 Bảng 3.1 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư chủng vi nấm nội sinh thiết sam núi đá (Tsuga chinensis (Franch.) Pritz.) Hà Giang 32 Bảng 3.2 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định chủng vi nấm nội sinh thiết sam núi đá (Tsuga chinensis (Franch.) Pritz.) Hà Giang 36 Bảng 3.3 So sánh đặc điểm hình thái chủng Penicillium crustosum SDF5 với chủng đối chiếu Penicillium crustosum 40 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Sự tương tác thực vật vi nấm nội sinh Hình 1.2 Phản ứng trung hòa DPPH với chất cho hydro (H *) tự Hình 1.3 Thiết sam núi đá (Tsuga chinensis (Franch.) Pritz.) 17 Hình 3.1 Hoạt tính kháng P aeruginosa ATCC 9027 (A) MRSE ATCC 35984 (B) số chủng vi nấm nội sinh 34 Hình 3.2 Tỉ lệ ức chế vi sinh vật kiểm định chủng vi nấm nội sinh 35 Hình 3.3 Hoạt tính loại bỏ gốc tự DPPH chủng SDF5 38 Hình 3.4 Hoạt tính loại bỏ gốc OH chủng vi nấm nội sinh SDF5 38 Hình 3.5 Hình thái khuẩn lạc bào tử chủng SDF5 40 Hình 3.6 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen ITS gel agarose 1,0% 41 Hình 3.7 Cây phát sinh loài dựa theo phương pháp Neighbor-joining độ tương đồng trình tự gen ITS 42 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt BLAST Tiếng Anh Basic Local Alignment Search Tool DNA DPPH ESI FAB HPLC Deoxyribonucleic acid 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl Electrospray ionization Fast atom bombardment High-performance liquid chromatography Infrared spectrum Internal transcript spacer International Union for Conservation of Nature's IR IST IUCN MPA ml NMR NCBI Megapascal Mililter Nuclear magnetic resonance National center for biotechnology information PCR PDA ROS RNA rDNA SP SC TLC µl Polymerase Chain Reaction Potato Dextrose Agar Reactive Oxygen Species Acid ribonucleic Ribosomal DNA Species Scavenging capacity Thin layer chromatography Microliter vii Tiếng Việt Công cụ tìm kiếm trình tự Ion hóa tia điện tử Bắn phá nhanh nguyên tử Sắc ký lỏng cao áp Phổ hấp phụ hồng ngoại Vùng phiên mã nội Liên minh Quốc tế Bảo tồn Thiên nhiên Tài nguyên Thiên nhiên Cộng hưởng từ hạt nhân Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia Hoa Kỳ Phản ứng chuỗi polymerase Môi trường dịch chiết khoai tây Gốc oxy tự Khả bắt gốc tự Sắc ký lớp mỏng TÓM TẮT Vi nấm nội sinh thực vật biết đến nguồn khai thác tiềm hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao có khả chống ung thư, kháng khuẩn, chống oxy hóa, Hiện nay, chưa có nhiều nghiên cứu khai thác vi nấm nội sinh dược liệu Việt Nam Trong nghiên cứu sử dụng chủng gồm 09 chủng vi nấm nội sinh phân lập từ thiết sam núi đá (Tsuga chinensis (Franch.) Pritz.) Hà Giang sưu tập chủng giống lưu trữ Trung tâm Giống Bảo tồn nguồn gen Vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học Trong 09 chủng vi nấm nội sinh, có 01 chủng ký hiệu SDF5 xác định có hoạt tính gây độc tế bào ung thư cao phương pháp thử độ độc tế bào in vitro với giá trị IC50 14,19 ± 1,47 µg/mL 25,24 ± 1,72 µg/mL tế bào ung thư phổi A549 ung thư vú MCF-7 người Đánh giá khả kháng vi sinh vật kiểm định 09 chủng vi nấm nội sinh, sàng lọc 7/9 chủng (chiếm 78%) có khả kháng chủng VSV kiểm định, với đường kính vịng kháng dao động từ - 25 mm thử nghiệm Tiếp đó, tiến hành nghiên cứu đánh giá hoạt tính chống oxy hóa, xác định đặc điểm hình thái phân loại chủng vi nấm nội sinh SDF5 Kết cho thấy chủng SDF5 có hoạt tính chống oxy hóa cao, nồng độ 600 µg/mL khả bắt gốc tự DPPH chủng SDF5 61,13% khả bắt gốc OH chủng SDF5 56,4% Bằng phương pháp phân loại kết hợp hình thái so sánh trình tự vùng ITS, chủng SDF5 định danh Penicillium crustosum SDF5 (mã số GenBank OM721774) viii 2-yl)-5,6-dihydropyran-2-one, and 5-hydroxymethyl-3,4,5,6-tetrahydroisochromen1-one với dẫn xuất biết 5α-(hydroxymethyl)-6β-methyl-1H,3H5,6-dihydropyrano[3,4-c]pyran-1(3H)-one, 5α-(hydroxymethyl)-6α-methyl-5,6dihydropyrano[3,4-c]pyran-1(3H)-one, and 5-hydroxymethyl-5,6-dihydroisochromen-1one Một vài số dẫn xuất thể hoạt động bảo vệ gan bảo vệ dòng tế bào gan người HL-7702 khỏi hydrogen peroxide (Zeng cs, 2014) Hai chủng P chrysogenum P crustosum phân lập từ Teucrium polium đánh giá đặc tính thúc đẩy tăng trưởng thực vật chúng tạo cách khác biệt axit acetic indole, amoniac thể khả hòa tan phosphate (Hassan, 2017) Năm 2017, da Silva-Junior cs phân lập chủng vi nấm nội sinh P crustosum VR4 từ Viguiera robusta có khả chuyển hóa piplartine (cịn gọi piperlongumine, alkaloid chống ung thư đầy hứa hẹn phân lập từ thuộc chi Piper) tạo hai hợp chất có tên 3,4-dihydropiplartine (285) 8,9-dihydropiplartine Năm 2018, Abutaha cs nghiên cứu chủng P crustosum phân lập từ chà Phoenix dactylifera hoạt động chống tăng sinh chống lại dịng tế bào ung thư HepG2 (IC50 82µg/ml) cao MCF7 (IC50 126µg/ml) có ức chế di chuyển dòng tế bào Một nghiên cứu gần Hu cộng (2021) tách chiết từ chủng P crustosum JT-8 phân lập từ Paris polyphylla var yunnanensis dẫn xuất xycloheptan có hàm lượng oxy cao, với mười bốn hợp chất biết hợp chất thể hoạt tính kháng khuẩn chống lại Staphylococcus aureus với MIC 4,0 μg/mL Như vậy, nghiên cứu khẳng định công bố chủng P crustosum nội sinh phân lập từ thiết sam núi đá (Tsuga chinensis (Franch.) Pritz.) Hơn nữa, chủng P crustosum SDF5 thể tiềm gây độc tế bào ung thư cao (ở tế bào ung thư vú ung thư phổi), khả kháng khuẩn mạnh chống lại mầm bệnh khác người, khả chống oxi hóa cao, từ chứng minh tiềm tổng hợp hợp chất sinh học có hoạt tính cao cần nghiên cứu khai thác sâu 43 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận • Từ 09 chủng vi nấm nội sinh thiết sam núi đá (Tsuga chinensis (Franch.) Pritz.) Hà Giang, sàng lọc 4/9 (chiếm 44%) chủng có khả gây độc tế bào ung thư Cụ thể, chủng SDF5 ức chế mạnh với tế bào ung thư phổi A549 ung thư vú MCF-7 với giá trị IC50 14,19 ± 1,47 µg/mL 25,24 ± 1,72 µg/mL • Đánh giá khả kháng VSV kiểm định, sàng lọc 7/9 chủng (chiếm 78%) có khả kháng chủng VSV kiểm định, với đường kính vịng kháng dao động từ - 25 mm thử nghiệm • Đánh giá khả chống oxy hóa: khả loại bỏ gốc tự DPPH gốc OH cho thấy chủng SDF5 có hoạt tính chống oxy hóa cao Tại nồng độ 600 µg/mL hoạt tính chống oxy hóa DPPH SDF5 61,13% hoạt tính chống oxy hóa OH 22,64% • Kết hợp đặc điểm hình thái, bào tử phân tích trình tự gen ITS, chủng SDF5 định Penicillium crustosum SDF5 (mã số GenBank OM721774) 4.2 Kiến nghị • Tiếp tục nghiên cứu tối ưu môi trường điều kiện lên men nhằm nâng cao khả sinh tổng hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào ung thư oxy hóa từ chủng vi nấm • Tiếp tục phân lập, tách chiết xác định cấu trúc hoạt chất ung thư thử nghiệm đánh giá hoạt tính ung thư tế bào lành số tế bào ung thư khác khuôn khổ luận văn chưa thực 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt: Cao Thị Thúy Hằng, Võ Mai Như Hiếu, Phạm Đức Thịnh, Nguyễn Ngọc Linh, Nguyễn Đình Thuất, Trần Thị Thanh Vân (2020), Khảo sát điều kiện lên men chủng vi khuẩn biển Bacillus velezensis AlgSm1 để thu nhận alginate lyase, Báo Khoa học Tự nhiên, 63(3): Đàm Sao Mai, Võ Trung Âu (2014), Nghiên cứu phân lập xác lập môi trường nuôi cấy phân lập vi nấm cộng sinh phân lập từ thông đỏ vùng Lạc Dương tỉnh Lâm Đồng, Tạp chí Sinh học, 36(1se): 84- 89 Lan, M.T.-M (2013), Nghiên cứu khu hệ nấm nội ký sinh thông, Viet Nam Academy of Science and Technology Lê Mai Hương, T.T.H.H., T T N Hằng Lê Minh Hà (2009), Xác định cấu trúc thử hoạt tính sinh học ergosterol peroxid phân lập từ chủng nấm Trichoderma konilangbra nội kí sinh khổ sâm (Cronton tonkinensis Gagnep), Dược học 8: 47-50 Lê Mai Hương, T.T.N.H., T H Thái D Đ Huyến (2005), Phân lập, sàng lọc hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn chủng nấm nội kí sinh thực vật phân lập từ số vườn thuốc phía Bắc Việt Nam, Dược học, 8: 20-23 Lê Thị Phương Anh, N.Đ.N.v.H.V (2004) Sàng lọc vi nấm nội sinh thực vật kháng Candida albicans Y dược học quân 4: 17-24 Nguyễn Ngọc Hiếu (2019) Nghiên cứu phân lập thử nghiệm hoạt tính sinh học hoạt chất từ số loài thực vật nấm nội sinh thực vật Viện hàn lâm khoa học cộng nghệ Việt Nam 142 tr Nguyễn Xuân Huy, Trần Văn Thanh, Lê Thanh Hịa (2017) Định danh lồi nấm ký sinh gây bệnh bệnh nhân nữ nhập viện Hải Dương phương pháp so sánh chuỗi gen phân otisch phả hệ Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 15(3): 423-432 45 Nguyễn Đức Huy, Phạm Quang Nguyên, Nguyễn Thị Thanh Hồng, Hà Giang, Nguyễn Văn Viên, Nguyễn Tất Cảnh (2018), Phân lập đánh giá khả đối kháng Trichoderma asperellum dối với hợp tác nhân gây bệnh có nguồn gốc đất, Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam, 15(12): 1593-1604 10 Phùng Công Thưởng, Nguyễn Văn Bắc, Nguyễn Cao Vũ (2018), Phân loại chủng vi nấm phân lập Viện 69 xác định khả phân giải số chất sinh học chúng, Báo Khoa học Y-Dược, 25(57): 1-10 11 Phan Thị Hoài Trinh (2019), Nghiên cứu hóa học hoạt tính sinh học số hợp chất từ vi nấm biển phân lập miềm Trung Việt Nam, Viện Công nghệ sinh học, 244tr Tài liệu nước ngồi: Arias Padró MD, Caboni E, Salazar Morin KA, Meraz Mercado MA and Olalde-Portugal V (2021), Effect of Bacillus subtilis on antioxidant enzyme activities in tomato grafting, PeerJ, 9: e10984 Abutaha, N., Semlali, A., Baabbad, A., Al-Shami, M., Alanazi, M., & Wadaan, M A (2018), Anti-proliferative and anti-inflammatory activities of entophytic Penicillium crustosum from Phoenix dactylifer, Pak J Pharm Sci, 31(2):421-427 Arora, D S and Chandra, P (2011), In vitro antioxidant potential of some soil fungi: screening of functional compounds and their purification from Penicillium citrinum, Appl Biochem Biotechnol, 165 (2): 639-51 Archana Singh, Dheeraj K Singh, Ravindra N Kharwar, James F White and Surendra K Gond (2021), Fungal Endophytes as Efficient Sources of Plant-Derived Bioactive Compounds and Their Prospective Applications in Natural Product Drug Discovery: Insights, Avenues, and Challenges, Microorganisms, 9(1):197 46 Conforti F, Sosa S, Marrelli M, Menichini F, Statti GA, Uzunov D, Tubaro A, Menichini F, Loggia RD (2008), In vivo antiinflammatory and in vitro antioxidant activities of Mediterranean dietary plants, J Ethnopharmacol, 116(1): 144-151 Chen L., Zhang Q.-Y., Jia M., Ming Q.-L., Yue W., Rahman K., Qin L.-P., Han T (2014), Endophytic Fungi with Antitumor Activities: Their Occurrence and Anticancer Compounds, Crit Rev Microbiol, 42:454–473 Chaturvedi, P.; Gajbhiye, S.; Roy, S.; Dudhale, R.; Chowdhary, A (2014), Determination of Kaempferol in extracts of Fusarium chlamydosporum, an endophytic fungi of Tylophora indica (Asclepeadaceae) and its anti-microbial activity, IOSR Journal of Pharmacy and Biological Sciences, 9(1):51-55 Cragg G.M., Newman D.J (2005) Plants as a Source of Anti-Cancer Agents, J Ethnopharmacol, 100(1-2):72-9 Dhayanithy G, Subban K, Chelliah J (2019), Diversity and biological activities of endophytic fungi associated with Catharanthus roseus, BMC Microbiol, 19 (1): 22 10 Da Silva-Junior EA, Paludo CR, Gouvea DR, Kato MJ, Furtado NAJC, Lopes NP, Vessecchi R, Pupo MT, Gas-phase fragmentation of protonated piplartine and its fungal metabolites using tandem mass spectrometry and computational chemistry, Journal of Mass Spectrometry, 24(4): 747 11 Fatima, N., T.P Kondratyuk, E.-J Park, L.E Marler, M Jadoon, M.A Qazi, H Mehboob Mirza, I Khan, N Atiq, and L.C Chang 2016, Endophytic fungi associated with Taxus fuana (West Himalayan Yew) of Pakistan: potential bio-resources for cancer chemopreventive agents, Pharmaceutical Biology, 54(11): 2547-2554 12 Gao, Y.; Zhao, J.; Zu, Y.; Fu, Y.; Liang, L.; Luo, M.; Wang, W.; Efferth, T (2012), Antioxidant properties, superoxide dismutase and glutathione reductase activities in HepG2 cells with a fungal endophyte producing apigenin 47 from pigeon pea (Cajanus cajan (L.) Millsp , Food Research International, 49(1):147–152 13 Gauchan, D.P., H Vélëz, A Acharya, J.R Östman, K Lundén, M Elfstrand, and M.R García-Gil (2021), Annulohypoxylon sp strain MUS1, an endophytic fungus isolated from Taxus wallichiana Zucc., produces taxol and other bioactive metabolites, Biotech, 11(3):152 14 Ngo CC, Nguyen QH, Nguyen TH, Quach NT, Dudhagara P, Vu THN, Le TTX, Le TTH, Do TTH, Nguyen VD, Nguyen NT and Phi Q-T (2021), Identification of fungal community associated with deterioration of optical observation instruments of museums in northern Vietnam Appl Sci, 11(12): 5351 15 Gautier, M., et al., (2014), MALDI-TOF mass spectrometry: revolutionising clinical laboratory diagnosis of mould infections, Clin Microbiol Infect, 20(12): 1366-71 16 Garyali, S., M Reddy, and A Kumar (2014), Diversity and antimitotic activity of taxol-producing endophytic fungi isolated from Himalayan yew, Ann Microbiol, 13(64):1413–1422 17 Gaurav Kumar, Priyanka Chandra and Madhu Choudhary (2017), Endophytic Fungi: A Potential Source of Bioactive Compounds Chem Sci Rev Lett, 6(24): 2373-2381 18 Gauchan, D.P., H Vélëz, A Acharya, J.R Ưstman, K Lundén, M Elfstrand, and M.R García-Gil (2021), Annulohypoxylon sp strain MUS1, an endophytic fungus isolated from Taxus wallichiana Zucc., produces taxol and other bioactive metabolites, Biotech, 11(3): 1-16 19 Hridoy, M.; Gorapi, M.Z.H.; Noor, S.; Chowdhury, N.S.; Rahman, M.M.; Muscari, I.; Masia, F.; Adorisio, S.; Delfino, D.V.; Mazid, M.A (2022), Putative Anticancer Compounds from Plant-Derived Endophytic Fungi: A Review, Molecules, 27(1): 296 48 20 Hughes, S.J., Conidiophores, conidia, and classification (1953), Canadian journal of Botany, Canad J Bot, 31(5): 577-659 21 Hileman, E O., Liu, J., Albitar, M., Keating, M J., and Huang, P (2004), Intrinsic oxidative stress in cancer cells: a biochemical basis for therapeutic selectivity, Cancer Chemother Pharmacol, 53(3): 209–219 22 Hezari, M., N.G Lewis, and R Croteau (1995) Purification and characterization of taxa-4(5), 11(12)-diene synthase from Pacific yew (Taxus brevifolia) that catalyzes the first committed step of taxol biosynthesis., Archives of Biochemistry Biophysics, 322(2):437-44 23 Hu, J T., Wang, J P., Shu, Y., Cai, X Y., Sun, C T., Ding, H., & Ding, Z T (2021), A new cycloheptane derivative from the fungus Penicillium crustosum JT-8, Natural Product Research, 9(4):1-9 24 Hassouna, N., B Mithot, and J.-P Bachellerie (1984) The complete nucleotide sequence of mouse 28S rRNA gene Implications for the process of size increase of the large subunit rRNA in higher eukaryotes, Nucleic Acids Research, 12(8): 3563-3583 25 Huang, Z.; Yang, J.; She, Z.; Lin, Y (2010), Isoflavones from the mangrove endophytic fungus Fusarium sp (ZZF41), Nat Prod Commun, 5(11):1771-3 26 Hassan SE (2017), Plant growth-promoting activities for bacterial and fungal endophytes isolated from medicinal plant of Teucrium polium L, J Adv Res, 8(6):687–695 27 Jia M, Chen L, Xin H-L, Zheng C-J, Rahman K, Han T, Qin L-P (2016), A friendly relationship between endophytic fungi and medicinal plants: a systematic review, Front Microbiol, 7:906 28 Khan AL, Gilani SA, Waqas M, Al Hosni K, Al-Khiziri S, Kim Y.H, Ali L, Kang S.M, Asaf S, Shahzad R (2017), Endophytes from medicinal plants 49 and their potential for producing indole acetic acid, improving seed germination and mitigating oxidative stress, J Zhejiang Univ Sci, 18(2):125–137 29 Kusari, S., C Hertweck, and M Spiteller (2012), Chemical ecology of endophytic fungi: origins of secondary metabolites, Chemistry biology, 19(7): 792-798 30 Kusari,S., M Lamshöft, M Spiteller (2009), Aspergillus fumigatus Fresenius, an endophytic fungus from Juniperus communis L Horstmann as a novel source of the anticancer pro-drug deoxypodophyllotoxin, J Appl Microbiol, 100(7): 1019-1030 31 Kaul S, Gupta S, Ahmed M, Dhar MK (2012), Endophytic fungi from medicinal plants: a treasure hunt for bioactive metabolites, Phytochem Rev, 11(4): 487–505 32 Kumar S, Stecher G and Tamura K (2016), MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets, Mol Biol Evol, 33(7): 1870-1874 33 Kadaikunnan S, Rejiniemon T, Khaled JM, Alharbi NS and Mothana R (2015), In-vitro antibacterial, antifungal, antioxidant and functional properties of Bacillus amyloliquefaciens, Ann Clin Microbiol Antimicrob, 14: 9-9 34 Kartika Dyah Palupi, Muhammad Ilyas, Andria Agusta (2021), Endophytic fungi inhabiting Physalis angulata L plant: diversity, antioxidant, and antibacterial activities of their ethyl acetate extracts, J Basic Clin Physiol Pharmacol, 32(4): 823-829 35 Ling Chen, Qiao-Yan Zhang, Min Jia, Qian-Liang Ming, Wei Yue, Khalid Rahman, Lu-Ping Qin, Ting Han (2016), Endophytic fungi with antitumor activities: Their occurrence and anticancer compounds, Crit Rev Microbiol, 42(3):454-73 50 36 Liu, X., X Wu, Y Ma, W Zhang, L Hu, X Feng, X Li, and X Tang (2017), Endophytic fungi from mangrove inhibit lung cancer cell growth and angiogenesis in vitro, Oncology Reports, 37(3): 1793-1803 37 Linde Giani Andrea, Luciani Alana, Lopes Ana Daniela, Valle Juliana Silveira do, & Colauto Nelson Barros (2018), Long-term cryopreservation of basidiomycetes, Brazilian journal of microbiology, 49(2): 220-231 38 Louw, J P., & Korsten, L (2015), Pathogenicity and host susceptibility of Penicillium spp on citrus, Plant Disease, 99(1): 21-30 39 Marcellano, J P., et al (2017), Antibacterial activity of endophytic fungi isolated from the Bark of Cinnamomum mercadoi harmacognosy, Journal, 9(3): 405-409 40 Mahajan, P V.; Caleb, O J.; Singh, Z.; Watkins, C B.; Geyer, M (2014), Postharvest treatments of fresh produce Philosophical Transactions of the Royal Society A: Mathematical, Physical and Engineering Sciences, 372(2017): 20130309 41 Manganyi, Madira Coutlyne; Ateba, Collins Njie (2020), Untapped Potentials of Endophytic Fungi: A Review of Novel Bioactive Compounds with Biological Applications, Microorganisms, 8(12): 1934 42 Newman D.J., Cragg G.M (2016), Natural Products as Sources of New Drugs from 1981 to 2014, J Nat Prod, 73(3):629–661 43 Pan F, Su T.J, Cai S-M, Wu W, Wang Z, Tamada K, Takumi T, Hashimoto R, Otani H, Pazour GJ (2017), Fungal endophyte-derived Fritillaria unibracteata var wabuensis: diversity, antioxidant capacities in vitro and relations to phenolic, flavonoid or saponin compounds, Sci Rep, 7(1):1–14 44 Padró, M D A., Caboni, E., Morin, K A S., Mercado, M A M., & Olalde-Portugal, V (2021), Effect of Bacillus subtilis on antioxidant enzyme activities in tomato grafting, PeerJ, 12(9): e10984 51 45 Quach, N.T., Q.H Nguyen, T.H.N Vu, T.T.H Le, T.T.T Ta, T.D Nguyen, T Van Doan, T.T Dang, X.C Nguyen, and H.H Chu (2021), Plantderived bioactive compounds produced by Streptomyces variabilis LCP18 associated with Litsea cubeba (Lour.) Pers as potential target to combat human pathogenic bacteria and human cancer cell lines, Braz J Microbiol, 52(3):12151224 46 Qi B, Liu X, Mo T, Li SS, Wang J, Shi XP, Wang XH, Zhu ZX, Zhao YF, Jin HW, Tu PF, Shi SP (2017), Nitric oxide inhibitory polyketides from Penicillium chrysogenum MT-12, an endophytic fungus isolated from Huperzia serrata, Fitoterapia, 122(1): 35–43 47 Schulz, B.; Christine B.; Siegfried D.; Anne-Katrin R.; Karsten K (2002), Endophytic fungi: a source of novel biologically active secondary metabolites Mycological Research, 106(9): 996–1004 48 Schramm DD, M K, H.R S, R.R H, M C, C.L K (2003), Honey with high levels of antioxidants can provide protection to healthy human subjects, J Agric Food Chem, 51(6): 1732-1735 49 Seifert, K., et al., (2011), The genera of Hyphomycetes, Persoonia, 25(2): 119–129 50 Samson RA, Peterson SW, Frisvad JC and Varga J (2011), New species in Aspergillus section Terrei, Stud Mycol, 69: 39-55 51 Skehan, P., Storeng, R., Scudiero, D., Monks, A., McMahon, J., Vistica, D., & Boyd, M R (1990), New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer-drug screening, JNCI: Journal of the National Cancer Institute, 82(13): 1107-1112 52 Sumarah, M W., Miller, J D., & Blackwell, B A (2005), Isolation and metabolite production by Penicillium roqueforti, P paneum and P crustosum isolated in Canada, Mycopathologia, 159(4): 571-577 52 53 Silva, N F D S., Simões, M R., Knob, A., De Moraes, S S., Henn, C., Da ConceiỗóO Silva, J L., Kadowaki, M K (2016), Improvement in the bleaching of kraft pulp with xylanase from Penicillium crustosum FP 11 isolated from the Atlantic forest, Biocatalysis and Biotransformation, 34(3): 119–127 54 Strobel G A., Stierle A., Stierle D & Hess W M (1993), Taxomyces andreanaea proposed new taxon for a bulbilliferous hyphomycete associated with Pacific yew, Mycotaxon, 45(2): 71–80 28 55 Subhadarsini Sahoo, Kamalraj Subban, and Jayabaskaran Chelliah (2021), Diversity of Marine Macro-Algicolous Endophytic Fungi and Cytotoxic Potential of Biscogniauxia petrensis Metabolites Against Cancer Cell Lines, Front Microbiol, 14(12):650177 56 Surachai Techaoei, Khemjira Jarmkom, Thisakorn Dumrongphuttidecha, and Warachate Khobjai (2021), Evaluation of the stability and antibacterial activity of crude extracts of hydro-endophytic fungi, J Adv Pharm Technol Res, 12(1):61-66 57 Strobel G and Daisy B (2003), Bioprospecting for microbial endophytes and their natural products, Microbiol Mol Biol Rev, 67(4): 491–502 58 Tirsit T (2018), Pharmaceutical effects of bioactive compounds from endophytes, Int J Innov Pharm Sci Res, 1(1):1–13 59 Uzma, F; Mohan, Chakrabhavi D.; Hashem, Abeer; Konappa, Narasimha M.; Rangappa, Shobith; Kamath, Praveen V.; Singh, Bhim P.; Mudili, Venkataramana; Gupta, Vijai K.; Siddaiah, Chandra N.; Chowdappa, Srinivas; Alqarawi, Abdulaziz A.; Abd Allah, Elsayed F (2018), Endophytic Fungi Alternative Sources of Cytotoxic Compounds: A Review, Front Pharmacol, 26(9):309 60 Visagie, C.M.; Houbraken, J.; Frisvad, J.C.; Hong, S.-B.; Klaassen, C.H.W.; Perrone, G.; Seifert, K.A.; Varga, J.; Yaguchi, T.; Samson, R.A 53 (2014), Identification and nomenclature of the genus Penicillium, Studies in Mycology, 75(3): 343–371 61 Vasundhara, M., M Baranwal, and A Kumar (2016), Fusarium tricinctum, an endophytic fungus exhibits cell growth inhibition and antioxidant activity, Indian journal of microbiology, 56(4): 433-438 62 Vasundhara, M., M Baranwal, N Sivaramaiah, and A Kumar (2017), Isolation and characterization of trichalasin-producing endophytic fungus from Taxus baccata, Annals of Microbiology, 67(3): 255-261 63 Visagie, C M., Hirooka, Y., Tanney, J B., Whitfield, E., Mwange, K., Meijer, M., & Samson, R A (2014), Aspergillus, Penicillium and Talaromyces isolated from house dust samples collected around the world, Studies in Mycology, 71(7): 63-139 64 Van de Peer, Y., S Chapelle, and R De Wachter (1996), A quantitative map of nucleotide substitution rates in bacterial rRNA, Nucleic acids research, 24(17): 3381-3391 65 Van de Peer, Y., et al., (1997), Database on the structure of small ribosomal subunit RNA, Nucleic acids research, 25(1): 111-116 66 Wang, X.J.; Min, C.L.; Ge, M.; Zuo, R.H (2014), An endophytic sanguinarine-producing fungus from Macleaya cordata, Fusarium proliferatum BLH51, Curr Microbiol, 68, 336–341 67 Wu, G., Ma, H., Zhu, T., Li, J., Gu, Q., & Li, D (2012), Penilactones A and B, two novel polyketides from Antarctic deep-sea derived fungus Penicillium crustosum PRB-2, Tetrahedron, 68(47): 9745–9749 68 Yash Mishra, Abhijeet Singh, Amla Batra and Madan Mohan Sharma (2014), Understanding the Biodiversity and Biological Applications of Endophytic Fungi: A Review, Microbial Biochem Technol, 59(48): S8-004 54 69 Yan, J.; Qi, N.; Wang, S.; Gadhave, K.; Yang, S (2014), Characterization of secondary metabolites of an endophytic fungus from Curcuma wenyujin, Curr Microbiol, 50(19): 740–744 70 Zeng WL, Li WK, Han H, Tao YY, Yang L, Wang ZT, Chen KX (2014), Microbial biotransformation of gentiopicroside by the endophytic fungus Penicillium crustosum 2T01Y01, Appl Environ Microbiol, 80(1):184– 192 55 PHỤ LỤC Phụ lục Trình tự gen ITS chủng vi nấm nội sinh SDF5 LOCUS SDF5 560 bp DNA linear UNC 13-MAR2022 ORIGIN AGGGCCTCTG GGTCCAACCT CCCACCCGTG TCTATCGTAC CTTGTTGCTT CGGCGGGCCC 61 GCCGTTTCGA CGGCCGCCGG GGAGGCCTTG CGCCCCCGGG CCCGCGCCCG CCGAAGACCC 121 CAACATGAAC GCTGTTCTGA AAGTATGCAG TCTGAGTTGA TTATCGTAAT CAGTTAAAAC 181 TTTCAACAAC GGATCTCTTG GTTCCGGCAT CGATGAAGAA CGCAGCGAAA TGCGATAAGT 241 AATGTGAATT GCAGAATTCA GTGAATCATC GAGTCTTTGA ACGCACATTG CGCCCCCTGG 301 TATTCCGGGG GGGCATGCCT GTCCGAGCGT CATTGCTGCC CTCAAGCACG GCTTGTGTGT 361 TGGGCCCCCG TCCCCCTCTC CCGGGGGACG GGCCCGAAAG GCAGCGGCGG CACCGCGTCC 421 GGTCCTCGAG CGTATGGGGC TTTGTCACCT GCTCTGTAGG CCCGGCCGGC GCCAGCCGAC 481 ACCCAACTTT ATTTTTCTAA GGTTGACCTC GGATCAGGTA GGGATACCCG CTGAACTTAA 541 GCATATCAAT AAGCCGGAGG Phụ lục Hoạt tính gây độc tế bào ung thư chủng vi nấm nội sinh thiết sam núi đá (Tsuga chinensis (Franch.) Pritz.) Hà Giang Nồng độ (µg/mL) 10 0.4 00.8 IC50 Nồng độ (µg/mL) 10 0.4 00.8 IC50 Nồng độ (µg/mL) 10 0.4 00.8 IC50 SDF1 A549 MCF-7 94.58 95.28 62.33 44.21 45.56 26.85 35.07 7.98 6.97±0.75 23.07±1.92 % ức chế SDF3 A549 MCF-7 36.01 23.45 14.9 8.13 9.56 1.94 2.56 -1.01 >100 >100 SDF5 A549 MCF-7 MCF7 A549 97 95.55 52.55 44.64 42.56 15.38 28.72 0.32 14.19±1.47 25.24±1.72 14,97 8,93 1,75 0,50 >100 20,80 14,65 6,93 1,06 >100 SDF9 A549 MCF-7 34.58 12.91 1.82 -1.93 >100 41.01 17 12.02 4.45 >100 SDF6 SDF17 A549 MCF-7 98.12 98.12 24.33 24.33 7.34 7.34 1.02 1.02 45.58±5.11 45.58±5.11 56 SDF4 A549 MCF-7 61.42 52.41 40.15 19.08 32.06 5.79 18.08 -0.8 41.05±2.68 92.41±2.62 SDF8 A549 MCF-7 61.61 45.41 30.42 20.36 36.81±2.82 60.13 35.53 21.78 1.37 50.56±1.82 SDF19 A549 MCF-7 38.96 28.95 16.61 2.16 >100 36.19 11.39 6.65 4.32 >100 Phụ lục Hoạt tính kháng B cereus ATCC 11778 (A); E faecalis ATCC 29212 (B); E coli ATCC 11105 (C); MRSA ATCC 3359 (D) C albicans ATCC 10321 (E) số chủng vi nấm nội sinh 57