Sàng lọc và nghiên cứu chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng nấm colletotrichum musae và alternaria alternata gây bệnh trên chuối

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -*** - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: SÀNG LỌC VÀ NGHIÊN CỨU CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG NẤM COLLETOTRICHUM MUSAE VÀ ALTERNARIA ALTERNATA GÂY BỆNH TRÊN CHUỐI Hà Nội - 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -*** - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: SÀNG LỌC VÀ NGHIÊN CỨU CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG NẤM COLLETOTRICHUM MUSAE VÀ ALTERNARIA ALTERNATA GÂY BỆNH TRÊN CHUỐI Sinh viên thực : NGUYỄN THU HÀ Mã sinh viên : 637376 Lớp : K63CNSHD Giáo viên hƣớng dẫn : ThS NGUYỄN THANH HUYỀN Bộ môn : Công nghệ vi sinh Hà Nội - 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học độc lập riêng Các số liệu sử dụng khố luận tơi thu đƣợc từ thí nghiệm nên có nguồn gốc rõ ràng Các kết chƣa đƣợc công bố nghiên cứu khác Các tài liệu đƣợc trích dẫn khố luận đƣợc nêu danh mục tài liệu tham khảo giúp đỡ đƣợc cảm ơn Hà Nội, ngày 09 tháng 09 năm 2022 Sinh viên Nguyễn Thu Hà i LỜI CẢM ƠN Với tình cảm chân thành lịng biết ơn sâu sắc, cho phép gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám đốc, phòng, ban Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Khoa Công nghệ Sinh học, Bộ môn Công nghệ Vi sinh, thầy, cô tận tình giảng dạy tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình học tập, nghiên cứu hồn thành khố luận Đặc biệt tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ngƣời hƣớng dẫn tơi: ThS Nguyễn Thanh Huyền, ngƣời tận tình hƣớng dẫn, bảo giúp đỡ, động viên suốt q trình nghiên cứu hồn thành khố luận Tôi xin chân thành cảm ơn tới PGS.TS Nguyễn Xuân Cảnh, PGS.TS Nguyễn Văn Giang, ThS Trần Thị Đào, ThS Trần Thị Hồng Hạnh, CN Dƣơng Văn Hoàn CN Nguyễn Thị Thu giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình nghiên cứu Cuối cùng, với tất lịng kính trọng biết ơn vô hạn, xin gửi lời cảm ơn đến bố, mẹ, ơng, bà, ngƣời thân tồn thể bạn bè giúp đỡ, động viên tạo động lực cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 09 tháng 09 năm 2022 Sinh viên Nguyễn Thu Hà ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii TÓM TẮT viii PHẦN I MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Đối tƣợng nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa đề tài PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan chuối (Musa ssp.) 2.2 Tổng quan nấm Colletotrichum musae gây bệnh thán thƣ chuối 2.2.1 Giới thiệu nấm Colletotrichum musae 2.2.2 Triệu chứng bệnh thán thƣ chuối 2.2.3 Cơ chế gây bệnh Colletotrichum musae 2.2.4 Mức độ thiệt hại bệnh thán thƣ chuối 2.3 Tổng quan nấm Alternaria alternata gây bệnh đốm nâu chuối 2.3.1 Giới thiệu nấm Alternaria alternata 2.3.2 Triệu chứng bệnh đốm nâu chuối 11 2.3.3 Cơ chế gây bệnh Alternaria alternata 11 2.3.4 Mức độ thiệt hại bệnh đốm nâu chuối 12 2.4 Biện pháp phòng trừ bệnh hại trồng nấm Colletotrichum musae Alternaria alternata gây 13 iii 2.5 Tổng quan xạ khuẩn 15 2.5.1 Giới thiệu xạ khuẩn 15 2.5.2 Môi trƣờng sống xạ khuẩn 17 2.5.3 Ứng dụng xạ khuẩn nông nghiệp, y học đời sống 19 2.6 Tổng quan tình hình nghiên cứu nƣớc giới xạ khuẩn đối kháng nấm bệnh hại trồng 20 2.6.1 Tình hình nghiên cứu nƣớc 20 2.6.2 Tình hình nghiên cứu giới 21 Phần III VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1 Vật liệu nghiên cứu 23 3.1.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 23 3.1.2 Đối tƣợng nghiên cứu 23 3.1.3 Hoá chất, dụng cụ thiết bị 23 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 25 3.2.1 Sàng lọc tuyển chọn chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm 25 3.2.2 Ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi cấy đến sinh trƣởng xạ khuẩn 25 3.2.3 Phƣơng pháp xác định đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn 26 3.2.4 Ảnh hƣởng số điều kiện nuôi cấy tới sinh trƣởng chủng xạ khuẩn 26 3.2.5 Phƣơng pháp xác định đặc điểm hoá sinh chủng xạ khuẩn 27 3.2.6 Đánh giá khả ức chế bào tử nấm nảy mầm chủng xạ khuẩn (Phuakjaiphaeo & cs., 2016) 28 3.2.7 Định danh chủng xạ khuẩn đƣợc tuyển chọn 28 Phần IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 4.1 Sàng lọc chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm 32 4.2 Ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi cấy đến sinh trƣởng chủng xạ khuẩn tuyển chọn 34 4.3 Đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn tuyển chọn 35 4.3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc 35 iv 4.3.2 Đặc điểm hình thái hệ sợi, cuống sinh bào tử bào tử 36 4.4 Ảnh hƣởng số điều kiện nuôi cấy tới sinh trƣởng chủng xạ khuẩn 38 4.4.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ tới sinh trƣởng chủng xạ khuẩn 38 4.4.2 Ảnh hƣởng pH tới sinh trƣởng chủng xạ khuẩn 40 4.4.3 Ảnh hƣởng nồng độ muối tới sinh trƣởng chủng xạ khuẩn 43 4.4.4 Khả đồng hoá nguồn cacbon chủng xạ khuẩn 45 4.4.5 Khả sử dụng nguồn nitơ chủng xạ khuẩn 47 4.5 Đặc điểm hoá sinh chủng xạ khuẩn tuyển chọn 49 4.5.1 Khả hình thành sắc tố melanin chủng xạ khuẩn 49 4.5.2 Khả sinh enzyme ngoại bào chủng xạ khuẩn 50 4.6 Khả ức chế bào tử nấm nảy mầm chủng xạ khuẩn tuyển chọn 51 4.7 Định danh chủng xạ khuẩn đƣợc tuyển chọn 54 4.7.1 Tách chiết xác định nồng độ DNA tổng số 54 4.7.2 Khuếch đại trình tự DNA phản ứng PCR 55 4.7.3 Định danh chủng xạ khuẩn tuyển chọn phƣơng pháp giải trình tự đoạn gen 16S rRNA 56 Phần V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 5.1 Kết luận 60 5.2 Kiến nghị 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 PHỤ LỤC 69 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Chú thích cs Cộng µl Microliter µm Micrometer nm Nanomet ml Millilit cm Centimeter mg Milligram CMC Carboxymethyl cellulose ISP International Streptomyces Project PDA Potato dextrose agar SCA Starch casein agar RNA Ribonucleic acid DNA Deoxyribonucleic acid KTKS Khuẩn ty khí sinh KTCC Khuẩn ty chất A alternata Alternaria alternata C musae Colletotrichum musae S katrae Streptomyces katrae C gloeosporioides Colletotrichum gloeosporioides B cinerea Botrytis cinerea P capsici Phytophthora capsici S amritsarensis Streptomyces amritsarensis vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR 30 Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR (20µl) 30 Bảng 4.1 Kết sàng lọc đối kháng sáu chủng xạ khuẩn thí nghiệm với hai chủng nấm C musae A alternata 32 Bảng 4.2 Ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi cấy đến sinh trƣởng 35 chủng xạ khuẩn 35 Bảng 4.3 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn 36 Bảng 4.4 Ảnh hƣởng nhiệt độ tới sinh trƣởng chủng xạ khuẩn 38 Bảng 4.5 Ảnh hƣởng pH tới sinh trƣởng chủng xạ khuẩn 40 Bảng 4.6 Ảnh hƣởng nồng độ muối tới sinh trƣởng 43 chủng xạ khuẩn 43 Bảng 4.7 Khả đồng hoá nguồn cacbon khác 45 hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn 45 Bảng 4.8 Khả sử dụng nguồn nitơ khác 47 hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn 47 Bảng 4.9 Đƣờng kính vịng phân giải (mm) hai chủng xạ khuẩn 50 vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Bệnh thán thƣ chuối nấm C musae gây Hình 2.2 Đặc điểm hình thái A alternata 10 Hình 4.1 Kết đối kháng sáu chủng xạ khuẩn với nấm A alternata (A-nấm A alternata, B-XK-111 đối kháng nấm, C-XK-116 đối kháng nấm, D-XK-45 đối kháng nấm, E-XK-48 đối kháng nấm, F-XK-112 đối kháng nấm) 33 Hình 4.2 Kết đối kháng sáu chủng xạ khuẩn với nấm C.musae 33 Hình 4.3 Sự sinh trƣởng chủng XK-111 môi trƣờng 35 Hình 4.4 Sự sinh trƣởng chủng XK-116 môi trƣờng 35 Hình 4.5 Hình thái hệ sợi chuỗi sinh bào tử (A), phát tán bào tử (B) chủng xạ khuẩn XK-111 37 Hình 4.6 Hình thái hệ sợi chuỗi sinh bào tử (A), phát tán bào tử (B) chủng xạ khuẩn XK-116 37 Hình 4.7 Sự sinh trƣởng chủng XK-111 điều kiện nhiệt độ khác 39 Hình 4.8 Sự sinh trƣởng chủng XK-116 điều kiện nhiệt độ khác 39 Hình 4.9 Sự sinh trƣởng chủng XK-111 điều kiện pH khác 41 Hình 4.10 Sự sinh trƣởng chủng XK-116 điều kiện pH khác 42 Hình 4.11 Sự sinh trƣởng chủng XK-111 điều kiện muối khác 44 Hình 4.12 Sự sinh trƣởng chủng XK-116 điều kiện muối khác 44 Hình 4.13 Khả đồng hố nguồn cacbon chủng XK-111 46 Hình 4.14 Khả đồng hoá nguồn cacbon chủng XK-116 46 Hình 4.15 Khả sử dụng nguồn nitơ chủng XK-111 48 Hình 4.16 Khả sử dụng nguồn nitơ chủng XK-116 48 Hình 4.17 Chủng XK-111 (A) chủng XK-116 (B) môi trƣờng ISP6 sau ngày nuôi cấy 49 Hình 4.18 Khả sinh enzyme ngoại bào chủng XK-116 XK-111 50 Hình 4.19 Ảnh hƣởng dịch ni cấy XK-111 XK-116 đến nảy mầm bào tử nấm C musae sau .51 viii Hình 4.24 Kết điện di sản phẩm DNA tổng số hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn gel agarose 1% 4.7.2 Khuếch đại trình tự DNA phản ứng PCR Khuếch đại trình tự gen 16S rRNA đƣợc thực phản ứng chuỗi polymerase (PCR) sử dụng mồi 27F 1492R với nhiệt độ bắt mồi 54°C Kết sau PCR đƣợc kiểm cách điện di gel agarose 1.5% cho thấy vùng trình tự gen 16S rRNA hai chủng xạ khuẩn đƣợc nhân lên rõ nét với kích thƣớc khoảng 1500bp (hình 4.25) 55 Hình 4.25 Kết điện di sản phẩm PCR hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn gel agarose 1.5% (Mũi tên đỏ: 1500 bp) 4.7.3 Định danh chủng xạ khuẩn tuyển chọn phƣơng pháp giải trình tự đoạn gen 16S rRNA Sản phẩm sau khuếch đại đƣợc gửi tinh giải trình tự gen 16S rRNA Kết thu đƣợc đoạn trình tự có kích thƣớc 1080bp (XK-111) 1092bp (XK-116) Hai đoạn trình tự gen 16S rRNA hai chủng xạ khuẩn đƣợc truy vấn với tất trình tự nucleotide có sẵn ngân hàng sở liệu GenBank NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) cách sử dụng công cụ Blast để xác định trình tự tƣơng đồng Xạ khuẩn XK-111 đƣợc xác định mối quan hệ di truyền với 17 loài (chứa trình tự tƣơng đồng) đƣợc cơng bố GenBank Dữ liệu cho thấy giống trình tự (98.43%) với chủng Streptomyces sp Streptomyces toxytricini (EU570696.1) Xạ khuẩn XK-116 đƣợc xác định mối quan hệ di truyền với 16 lồi (chứa trình tự tƣơng đồng) 56 đƣợc công bố GenBank Dữ liệu cho thấy giống trình tự (99.35%) với chủng Streptomyces sp Streptomyces globosus (MT239511.1) Dự đoán sâu đƣợc thực cách xây dựng phát sinh loài Cây phát sinh lồi đƣợc xây dựng dựa trình tự 16S rRNA phƣơng pháp “Maximum Parsimony” với giá trị boostrap 1000 phần mềm MEGA X Đây phƣơng pháp xây dựng phát sinh loài dựa phân tích ký tự, khơng đƣa chiều dài nhánh mà đƣa trật tự nhánh giá trị boostrap tƣơng ứng Kết phân tích đƣợc thể dƣới hình sau (Hình 4.26 4.27) Hình 4.26 Cây phát sinh chủng loại dựa trình tự gen 16S rRNA chủng xạ khuẩn XK-111 57 Hình 4.27 Cây phát sinh chủng loại dựa trình tự gen 16S rRNA chủng xạ khuẩn XK-116 Cây phát sinh chủng loại hình thành nhánh thể mối quan hệ loài với nhau, nút thể giá trị bootstrap tƣơng ứng Chủng XK111 hình thành nhánh với chủng Streptomyces toxytricini (EU570696.1) với giá trị bootstrap tƣơng ứng 86 Chủng XK-116 hình thành nhánh với chủng Streptomyces globosus (MT239511.1) với giá trị bootstrap tƣơng ứng 89 Giá trị bootstrap lớn 70% số lần lặp lại đƣợc coi có giá trị thống kê cao 95% (Pamela S Soltis & cs., 2003) Do đó, giá trị boostrap 86 89 nằm khoảng tin cậy Dựa vào đặc điểm hình thái, sinh hóa phân tích dựa giải trình tự gen 16S rRNA, tơi nhận thấy hai chủng xạ khuẩn XK-111, XK-116 thuộc chi Streptomyces sp có nhiều đặc điểm tƣơng đồng lần lƣợt với chủng Streptomyces toxytricini (EU570696.1) Streptomyces globosus (MT239511.1) Xét độ tin cậy mức độ tƣơng đồng chủng XK-111 với Streptomyces toxytricini chủng XK-116 với Streptomyces globosus đƣợc coi cao Do tơi kết luận hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn đối kháng mạnh với nấm C musae A alternata gây bệnh thán thƣ đốm nâu 58 chuối xác định chủng Streptomyces toxytricini 111 Streptomyces globosus 116 Theo nhiều nghiên cứu năm gần Streptomyces globosus Streptomyces toxytricini đƣợc coi nguồn vật liệu sinh học cung cấp chất chuyển hóa kháng khuẩn kháng nấm độc đáo Nghiên cứu Abeer Elhadidy (2019) cho thấy Streptomyces toxytricini có khả ức chế bốn loại nấm gây bệnh mạnh (Fusarium solani, Alternaria sp., Acremonium sp F oxysporum) phân lập từ hạt quinoa thối rữa đƣợc thu hái Ai Cập (tỉnh Fayoum) Ngoài ra, Streptomyces toxytricini tạo axit axetic indole (IAA) thể khả hòa tan photphat tối ƣu Sự gia tăng hàm lƣợng phenolic nhƣ hoạt động enzyme peroxidase chitinase trồng đƣợc xử lý Streptomyces toxytricini chứng minh khả đề kháng tồn thân kiểm sốt sinh học giống quinoa chống lại loại nấm gây bệnh Trong tƣơng lai không xa, hai chủng xạ khuẩn triển vọng Streptomyces globosus Streptomyces toxytricini thay hồn tồn loại thuốc hóa học độc hại việc phịng trừ bệnh hại trồng 59 Phần V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận  Đã sàng lọc đƣợc 05 chủng xạ khuẩn có khả đối kháng với chủng nấm C musae gây bệnh thán thƣ chủng nấm A alternata gây bệnh đốm nâu chuối số 20 chủng xạ khuẩn thí nghiệm  Đã tuyển chọn đƣợc 02 chủng xạ khuẩn đối kháng tiềm với hiệu lực ức chế nấm bệnh mạnh (đều 50%)  Khảo sát khả sinh trƣởng môi trƣờng phát triển mạnh Gause I cho thấy XK-111 XK-116 có khả sinh trƣởng tốt nhiệt độ 30ºC, dải pH rộng (7-10), đồng thời, chúng có khả chịu muối tƣơng đối cao (lên đến 3-5%)  Khảo sát khả sinh trƣởng môi trƣờng ISP9 cho thấy XK-111 XK-116 có khả sử dụng nhiều nguồn đƣờng nitrogen khác Ngoài ra, hai chủng xạ khuẩn cịn cho thấy hoạt tính số loại enzyme mạnh dịch ni cấy ức chế bào tử nấm bệnh nảy mầm  Dựa vào đặc điểm hình thái, hóa sinh so sánh vùng trình tự gen 16S rRNA hai chủng xạ khuẩn hai chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sp đặt tên chủng Streptomyces toxytricini 111 Streptomyces globosus 116 5.2 Kiến nghị Tiếp tục đánh giá hiệu đối kháng chủng xạ khuẩn chủng nấm nghiên cứu điều kiện in vitro in vivo 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Hoàng Thị Hồng & cs (2013) "Khảo sát khả kháng nấm Fusarium sp chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc từ rừng ngập mặn Cần Giờ." Lê Thị Hiền & cs (2014) "Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn (Streptomyces spp.) đối kháng nấm bệnh cây." Tạp chí Khoa học Phát triển: tập 12, số 15: 656-664 Lƣu Trần Đông & cs (2019) "Sàng lọc chủng kháng nấm gây bệnh thực vật mô tả chi tiết chủng Streptomyces hydrogenans VTCC 41117 có hoạt tính cao." Nguyền Hồng Q & cs (2016) "Đánh giá khả phịng trị xạ khuẩn bệnh thán thƣ xoài nấm Colletotrichum sp gây ra." Nguyễn Thị Vân & cs (2019) "Khảo sát khả đối kháng với bốn loại nấm gây bệnh thực vật xạ khuẩn đƣợc phân lập từ vƣờn quốc gia Cúc Phƣơng Ba Bể." Nguyễn Văn Bá & cs (2005) "Giáo trình mơn nấm học." Nguyễn Văn Giang & cs (2018) "Khảo sát số đặc tính sinh học chủng xạ khuẩn biển có khả kháng vi khuẩn gây bệnh" Bản B Tạp chí Khoa học Công nghệ Việt Nam 60(10) Nguyễn Xuân Cảnh & cs (2016) "Nghiên cứu chủng xạ khuẩn có khả đối kháng với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh tơm" Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam Phan Thị Hồng Thảo & cs (2016) "Xạ khuẩn nội sinh Streptomyces parvulus HNR3X4 bƣởi Diễn Hà Nội tiềm sinh tổng hợp chất kháng khuẩn." VNU Journal of Science: Earth and Environmental Sciences 32(1S) 61 10 Phan Thị Thu Hiền (2021) "Nghiên cứu nấm Alternaria spp gây bệnh đốm nâu chanh dây (Passiflora edulis)." Trƣờng đại học Nơng lâm thành phố Hồ Chí Minh Tài liệu tiếng Anh 11 Abeer Elhadidy (2019) Effect of biocontrol agents on damping-off and rootrot diseases of quinoa (chenopodium quinoa willd) seedling Department of Plant Protection, Division of Ecology and Arid Lands Agriculture 12 Amani M and Avagyan G (2014) "Effect of polyethylene bunch cover on fungal diseases control of banana (Musa acuminata L.) in Iran." International Journal of Farming and Allied Sciences 3(10): 1054-1057 13 Bonnarme Pascal and Jeffries Thomas W Jeffries (1990) "Mn (II) regulation of lignin peroxidases and manganese-dependent peroxidases from lignindegrading white rot fungi." Applied and environmental microbiology 56(1): 210-217 14 Brat P, Bugaud C, Guillermet C and Salmon F (2020) "Review of banana green life throughout the food chain: From auto-catalytic induction to the optimisation of shipping and storage conditions." Scientia Horticulturae 262: 109054 15 Breznak J A (2004) "Invertebrates-insects, in microbial diversity and bioprospecting Amer Soc Microbio." 191–203 16 Britschgi, T B., & Giovannoni, S J (1991) “Phylogenetic analysis of a natural marine bacterioplankton population by rRNA gene cloning and sequencing” Applied and Environmental Microbiology, 57, 1707–1713 17 Canwei Shu, Chen Q, Pi L, Zhang D, Panhwar Q A and Zhou E (2017) "Identification and antifungal activity analysis of two biocontrol antagonists to Colletotrichum musae." Journal of Phytopathology 165(78): 554-561 62 18 Cerqueira E C, Castro Neto M T d, Peixoto C P, Soares Filho W d S, Ledo C A d S and Oliveira J G d (2004) "Resposta de porta-enxertos de citros ao déficit hídrico." Revista Brasileira de Fruticultura 26: 515-519 19 Cordeiro Z, Fancelli M, Ritzinger C, Ferreira D and Haddad F (2017) "Manual de identificaỗóo de doenỗas, nematoides e pragas na cultura da bananeira." 20 Cox ML and Irwin JAG (1988) "Conidium and appressorium variation in Australian isolates of the Colletotrichum gloeosporioides group and closely related species." Australian Systematic Botany 1(2): 139-149 21 Currie Cameron R, Poulsen M, Mendenhall J, Boomsma Jacobus J and Billen J (2006) "Coevolved Crypts and Exocrine Glands Support Mutualistic Bacteria in Fungus-Growing Ants." 22 da Costa A C, de Miranda R F, Costa F A and Ulhoa C J (2021) "Potential of Trichoderma piluliferum as a biocontrol agent of Colletotrichum musae in banana fruits." Biocatalysis and Agricultural Biotechnology 34: 102028 23 Damasceno C L, Duarte E A A, dos Santos L B P R, de Oliveira T A S, de Jesus F N, de Oliveira L M, Soares A C F (2019) "Postharvest biocontrol of anthracnose in bananas by endophytic and soil rhizosphere bacteria associated with sisal (Agave sisalana) in Brazil." Biological Control 24 Dhanasekaran D, Thajuddin N and Panneerselvam A (2012) “Applications of actinobacterial fungicides in agriculture and medicine” Fungicides for Plant and Animal Diseases, IntechOpen 25 EFSA (2011) "Scientific opinion on the risks for animal and public health related to the presence of Alternaria toxins in feed and food." EFSA journal 9(10): 2407 63 26 Farhad Masoomi-Aladizgeh, Leila Jabbari, Reza Khayam Nekouei and Ali Aalami (2016) “A Simple and Rapid System for DNA and RNA Isolation from Diverse Plants Using Handmade Kit” Doi:10.1038/protex.2016.015 27 Felsenstein J (1985) "Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap." evolution 39(4): 783-791 28 Goos R D and Tschirsch M (1962) "Effect of Environmental Factors on Spore Germination, Spore Survival, and Growth of Gloeosporium Musarum." 29 Jagannathan S V, Manemann E M, Rowe S E, Callender M C and Soto W (2021) "Marine Actinomycetes, New Sources of Biotechnological Products." Mar Drugs 19(7) 30 Javed Z, Tripathi G D, Mishra M and Dashora K (2020) "Actinomycetes – The microbial machinery for the organic-cycling, plant growth, and sustainable soil health." 31 Kurnianto M A, Kusumaningrum H D and Lioe H N (2020) "Characterization of Streptomyces isolates associated with estuarine fish Chanos chanos and profiling of their antibacterial metabolites-crudeextract." International Journal of Microbiology 2020 32 Lam and Kin S (2006) "Discovery of novel metabolites from marine actinomycetes." Current opinion in microbiology 9(3): 245-251 33 Lamenew Fenta, Habtamu Mekonnen and Tsegaye Gashaw (2019) "Biocontrol potential of trichoderma and yeast against post harvest fruit fungal diseases: A review." World News of Natural Sciences 27 34 Larsen, H (1986) “Halophilic and halotolerant microorganism: an overview historical perspective” FEMS Microbiol Biotechnol., 24 pp 2235-2241 35 Leu L-S and Chang C-W (1988) "Conidium germination and appressorium formation of Colletotrichum musae." 36 Mikami and Yuzuru (2007) "Biological work on medically important Nocardia species." Actinomycetologica 21(1): 46-51 64 37 Milsha George, Cherian K A and Beena S (2020) "A new leaf spot disease of banana cultivar Nendran caused by Alternaria alternata." Indian Phytopathology 73(4): 797-798 38 Mohammad Shahid, Singh B N, Verma S, Choudhary P, Das S, Chakdar H, Saxena A K (2021) "Bioactive antifungal metabolites produced by Streptomyces amritsarensis V31 help to control diverse phytopathogenic fungi." 39 Muhammed M, Anagnostou T, Desalermos A, Kourkoumpetis T K, Carneiro H A, Glavis-Bloom J, Mylonakis E (2013) "Fusarium infection: report of 26 cases and review of 97 cases from the literature." Medicine 92(6): 305 40 Mulya E and Waturangi D E (2021) "Screening and quantification of antiquorum sensing and antibiofilm activity of Actinomycetes isolates against food spoilage biofilm-forming bacteria." BMC microbiology 21(1): 1-8 41 Nakade and DB (2012) "Biodiversity of Actinomycetes in Hypersaline soils of Kolhapur district and their screening as potential antibiotic producer, India." Research Journal of Recent Sciences ISSN 2277: 2502 42 Nomura (2019) "The Belle II physics book." 43 Pamela S Soltis and Douglas E Soltis (2003) Applying the Bootstrap in Phylogeny Reconstruction Institute of Mathematical Statistics Statistical Science Vol 18, No 2, Silver Anniversary of the Bootstrap pp 256-267 (12 pages) 44 Parkunan, S Li, EG Fonsah and P Ji (2013) "First report of Alternaria leaf spot of banana caused by Alternaria alternata in the United States." Plant Disease 97(8): 1116-1116 45 Phuakjaiphaeo, C.I Chang, Ruangwong O and Kunasakdakul K (2016) "Isolation and identification of an antifungal compound from endophytic Streptomyce ssp CEN26 active against Alternaria brassicicola." Department of Entomology and Plant Pathology, Faculty of Agriculture 65 46 Quadri, Raziuddin S, Agsar and Dayanand (2012) "Antimicrobial attributes of rare actinobacteria detected from limestone quarries." Int J Pharm Bio Sci 3(3): 137-147 47 Rajivgandhi G N, Ramachandran G, Li J-L, Yin L, Manoharan N, Kannan M R, Khaled J M (2020) "Molecular identification and structural detection of anti-cancer compound from marine Streptomyces akiyoshiensis GRG (KY457710) against MCF-7 breast cancer cells." Journal of King Saud University-Science 32(8): 3463-3469 48 Roshan K, Koushik B, Vikas S, Pankaj K and T A (2014) "Actinomycetes: Potential Bioresource for Human Welfare: A." 49 Setu Bazie, Amare Ayalew and Woldetsadik K (2014) "Antifungal Activity of Some Plant Extracts against (Colletotrichum Musae) the Cause of Postharvest Banana Anthracnose." 50 Silva R N, Monteiro V N, Steindorff A S, Gomes E V, Noronha E F and Ulhoa C J (2019) "Trichoderma/pathogen/plant interaction in pre-harvest food security." Fungal biology 123(8): 565-583 51 Slavov S, Mayama S and Atanassov A (2004) "Toxin production of Alternaria alternata tobacco pathotype." Biotechnology & Biotechnological Equipment 18(3): 90-95 52 Somma S, Pose G, Pardo A, Mulè G, Pinto V F, Moretti A and Logrieco A F (2011) "AFLP variability, toxin production, and pathogenicity of Alternaria species from Argentinean tomato fruits and puree." International journal of food microbiology 145(2-3): 414-419 53 Tamreihao K, Nimaichand S, Chanu S B, Devi K A, Lynda R, Jeeniita N and Ningthoujam D S (2018) "Acidotolerant Streptomyces sp MBRL 10 from limestone quarry site showing antagonism against fungal pathogens and growth promotion in rice plants." Journal of King Saud UniversityScience 30(2): 143-152 66 54 Thomma B P (, 2003) "Alternaria spp.: from general saprophyte to specific parasite." Molecular plant pathology 4(4): 225-236 55 Thompson A K (, 2011) "Postharvest Biology and Technology of Tropical and Subtropical Fruits." 56 Usha and Rajamanickam (2018) "Biodiversity of actinomycetes and secondary metabolites-a review." Innoriginal: International Journal of Sciences: 22-27 57 Vimal V, Rajan B M and Kannabiran K (2009) "Antimicrobial activity of marine actinomycete, Nocardiopsis sp VITSVK (FJ973467)." Asian J Med Sci 1(2): 57-63 58 Walton J D (2000) "Horizontal gene transfer and the evolution of secondary metabolite gene clusters in fungi: an hypothesis." Fungal genetics and biology 30(3): 167-171 59 Wei Y, Zhao Y, Zhou D, Qi D, Li K, Tang W, Xie J (2020) "A newly isolated Streptomyces sp YYS-7 with a broad-spectrum antifungal activity improves the banana plant resistance to Fusarium oxysporum f sp cubense tropical race 4." Frontiers in microbiology 11: 1712 60 Yong-ting Yu, Liangbin Zeng, Lili Huang and Zhun Yan (2015) "First Report of Black Leaf Spot Caused by Alternaria alternata on Ramie in China." 61 Yuan Gong, Lu-Ju Chen, Shi-Yao Pan, Xue-Wei Li, Ming-Jie Xu, ChunMei Zhang, Qin S (2020) "Antifungal potential evaluation and alleviation of salt stress in tomato seedlings by a halotolerant plant growth-promoting actinomycete Streptomyces sp KLBMP5084." 62 Yufeng Chen, Zhou D, Qi D, Gao Z, Xie J and Luo Y (2018) "Growth Promotion and Disease Suppression Ability of a Streptomyces sp CB-75 from Banana Rhizosphere Soil." Frontiers in Microbiology 67 63 Zhang, Fu B, LH Wang, GY Li, JZ Zhang and Y Zhang (2014) "First report of leaf spot caused by Alternaria alternata on Chinese dwarf banana in China." Plant Disease 98(5): 691-691 64 Zhu Li, Guo B, Wan K, Cong M, Huang H and Ge Y (2015) "Effects of bacteria-free filtrate from Bacillus megaterium strain L2 on the mycelium growth and spore germination of Alternaria alternata." Agriculture and Environmental Biotechnology: 1062-1068 68 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc hệ thống ISP ISP1 ISP2 ISP3 ISP5 ISP6 ISP7 ISP4 Hình Hình thái khuẩn lạc chủng XK-111 hệ thống ISP ISP1 ISP2 ISP3 ISP5 ISP6 ISP7 ISP4 Hình Hình thái khuẩn lạc chủng XK-116 hệ thống ISP 69