Phân lập và đặc tính hóa các chủng vi khuẩn phát triển nhanh có khả năng phân hủy chitin từ môi trường biển việt nam

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Phân lập đặc tính hố chủng vi khuẩn phát triển nhanh có khả phân huỷ chitin từ môi trường biển Việt Nam TRẦN THỊ VÂN ANH Anh.TTV202898M@sis.hust.edu.vn Ngành Công nghệ Sinh học Giảng viên hướng dẫn: PGS TS Lê Thanh Hà Bộ môn: Công nghệ Sinh học Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm Viện: HÀ NỘI, 04/2023 Chữ ký GVHD CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên tác giả luận văn: TRẦN THỊ VÂN ANH Đề tài luận văn: Phân lập đặc tính hố chủng vi khuẩn phát triển nhanh có khả phân huỷ chitin từ mơi trường biển Việt Nam Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số SV: 20202898M Tác giả, Người hướng dẫn khoa học Hội đồng chấm luận văn xác nhận tác giả sửa chữa, bổ sung luận văn theo biên họp Hội đồng ngày 24 tháng 04 năm 2023 với nội dung sau: STT Yêu cầu chỉnh sửa phản biện hội đồng Nội dung chỉnh sửa, bổ sung, làm rõ (ghi số trang chỉnh sửa) Bổ sung danh mục chữ viết tắt Đã chỉnh sửa bổ sung thêm (trang IX) Tóm tắt nội dung luận văn: Thêm trích dẫn tham khảo chỉnh sửa số chỉnh sửa số lỗi dùng từ lỗi dùng từ (trang III) Phần Tổng quan Chuyển số dạng ký hiệu thành chữ dùng đầu câu, chỉnh sửa tiêu đề cho phù hợp với nội dung Đã chỉnh sửa ký hiệu α, β, γ thành chữ (trang 2) Đã chỉnh sửa tiêu đề mục 1.1.1 1.3 (trang 1, trang 5) Cập nhật thêm hệ enzyme Đã bổ sung thơng tin hệ enzyme oxy hố phân giải chitin phân giải chitin (trang 5, 6) Sửa hình ảnh mờ: Hình 1.5, Đã chỉnh sửa Hình 1.5, Hình 1.6 (trang 7, 9) Hình 1.6 Hạn chế đưa kết thí nghiệm Đã lược bỏ Hình 1.7 (trang 10) Hình 1.8 nghiên cứu khác vào nội (trang 11) thay diễn giải lời (trang 10, dung tổng quan 11) Phần Vật liệu Phương pháp Bỏ ký hiệu thiết bị, ghi tên Đã xoá mã số máy PTN quy định (trang 19), hãng sản xuất hoá chất, bổ sung ghi tên hãng sản xuất hoá chất (trang 19) nguyên vật liệu sử dụng Đã bổ sung thông tin nguyên liệu chitin (trang 20), chủng vi sinh vật sử dụng làm kiểm chứng (trang 21) Làm rõ nội dung số Đã làm rõ nội dung phương pháp nuôi thu phương pháp thí nghiệm enzyme (trang 21) Bổ sung cách tính hoạt độ chitinase tổng số (trang 22) Bổ sung tên cơng ty gửi giải trình tự (trang 25) Bổ sung điều kiện so sánh tốc Đã bổ sung điều kiện nuôi xác định tốc độ sinh độ sinh trưởng chủng trưởng (mục 2.3.5 trang 24, trang 36) Phần Kết Thảo luận, Kết luận Kiến nghị Chú thích hình ảnh đặc Đã bổ sung ví dụ hình ảnh bảng 3.1 điểm nhóm khuẩn lạc (trang 29) 10 Thống cách viết chitin keo Đã chỉnh sửa thống (trang 30, trang 48) gel Việt hoá số thuật ngữ Đã việt hoá số từ: periplasm (trang 38), amino acid, putative (trang 39) 11 Làm rõ nội dung so sánh in Đã giải thích rõ trình tự lựa chọn để so silico sánh (phần phương pháp trang 27) thích bảng kết (trang 42) 12 Thêm nhận xét khả sử Đã bổ sung số nhận xét kết tương dụng chitin thô ứng (trang 46, 47) 13 Bổ sung kết lượng đường Đã bổ sung kết lượng đường tiêu thụ sau tiêu thụ nhắc đến 24h (Hình S2.4 phụ lục) 14 Hình 3.5 mờ 15 Viết ngắn gọn lại phần kết luận Đã chỉnh sửa số nội dung phần kết luận (trang 50) Đã bổ sung lý cho việc tạo chủng V natriegens có khả phân giải tốt chitin Bổ sung phần phóng to Hình 3.5 (phụ lục) Hà Nội, Ngày 10 tháng 05 năm 2023 Giảng viên hướng dẫn Tác giả luận văn CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG ĐỀ TÀI LUẬN VĂN Họ tên học viên: Trần Thị Vân Anh Số hiệu học viên: 20202898M Khóa: CH2020B Viện: Cơng nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm Ngành: Công nghệ Sinh học Đề tài nghiên cứu: Phân lập đặc tính hố chủng vi khuẩn phát triển nhanh có khả phân huỷ chitin từ môi trường biển Việt Nam Nội dung: x Phân lập sàng lọc chủng vi khuẩn có khả phát triển nhanh mơi trường khoáng chứa chitin nguồn carbon từ nước biển x Định danh xác định đặc tính hoá sinh, tốc độ sinh trưởng chủng sau sàng lọc x Khảo sát có mặt số gen chitinase chủng mức độ phân tử x Đánh giá thực tế khả phân giải chitin chủng thơng qua xác định hoạt tính enzyme chitinase khảo sát sinh trưởng chủng sàng lọc nguồn chất chitin sản phẩm thuỷ phân chitin x Xây dựng mối liên quan có mặt gen chitinase với khả phân giải chitin vi khuẩn thuộc họ Vibrionaceae Họ tên cán hướng dẫn: PGS TS Lê Thanh Hà Ngày giao nhiệm vụ: Ngày hoàn thành luận văn: Ngày tháng năm 2023 Giảng viên hướng dẫn (Ký, ghi rõ họ, tên) I Lời cảm ơn Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn tới Thầy Cô, Cán Viện Công nghệ Sinh học- Công nghệ Thực phẩm Thầy Cô Đại học Bách Khoa Hà Nội dạy tạo điều kiện nhiều cho em suốt năm học tập nghiên cứu mái trường Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.TS Lê Thanh Hà, Bộ môn Công nghệ Sinh học, TS Đàm Thuý Hằng, Bộ mơn Vi sinh- Hố sinh- Sinh học phân tử, Viện Công nghệ Sinh học- Công nghệ Thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội tận tình hướng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ cho em tham gia nghiên cứu, hoàn thành luận văn Đồng thời, em xin cảm ơn tài trợ từ dự án NĐT/DE/21/08 giúp em thực đề tài Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới người thân gia đình, bạn bè ln điểm tựa tinh thần vững động viên, giúp đỡ em thời gian thực luận văn Trong q trình hồn thiện luận văn, hạn chế mặt kiến thức kinh nghiệm nên em khó tránh khỏi thiếu sót Em mong nhận góp ý Thầy, Cơ để Luận văn em hồn thiện Em xin chân thành cảm ơn! II Tóm tắt nội dung Luận văn Chitin polysaccharide có khối lượng lớn thứ hai tự nhiên sau cellulose, phân bố đặc biệt rộng rãi hệ sinh thái biển với sản lượng 1011 năm, đóng vai trò nguồn carbon nito chủ yếu đại dương Hệ sinh thái đại dương môi trường đa dạng vi sinh vật với số lượng vi khuẩn đáy biển lên đến 3.5 × 1030 (Whitmann cộng sự, 1998) Đây nguồn hứa hẹn môi trường chưa khám phá tiềm gen đa dạng trao đổi chất Nghiên cứu thực phân lập, sàng lọc chủng vi khuẩn phát triển nhanh mơi trường khống chứa chitin nguồn carbon từ nguồn nước biển số tỉnh Việt Nam kiểm tra có mặt số gen chitinase mức độ phân tử chủng sau sàng lọc, từ đánh giá mối liên quan có mặt gen với khả phân giải chitin chủng vi khuẩn Nghiên cứu góp phần làm rõ thêm đặc tính phân huỷ chitin vốn đặc tính lõi vi sinh vật biển giúp chúng thích nghi phân bố rộng rãi nhiều môi trường Kết thu được: x Phân lập sàng lọc 14 chủng vi khuẩn phát triển nhanh môi trường khoáng chứa chitin nguồn carbon Kết định danh cho thấy chủng thuộc họ Vibrionaceae x Các chủng có tốc độ sinh trưởng nhanh, cao chủng đối chứng E.coli BL21 từ 1.5-2 lần mơi trường LB 37°C Nhóm chủng lồi có tương đồng cao đặc tính hố sinh x Đa số chủng chứa đủ gen chitinase thiết yếu cho kết PCR phù hợp với đánh giá in silico Nhóm chủng V natriegens khơng chứa gen VC_1952 (chitinase), VC_0769 (endochitinase) Chủng P ganghwense 6.3D cho thấy phân ly cao trình tự amino acid/ nucleotide so với chủng Vibrio khác x Hoạt tính ba loại chitinase có tương đương nhóm chủng lồi phân bố theo thứ tự: V natriegens < V alginolyticus/V diabolicus < V proteolyticus B02 Tất chủng sinh trưởng α β-chitin thô, dịch thuỷ phân chitin keo (chứa chitin oligomer) đơn phân GlcNAc Khả sinh trưởng nguồn chất chitin phân bố theo nhóm chủng tương tự kết đo hoạt độ enzyme Sự vắng mặt số gen chitinase làm giảm khả phân giải chitin loài V natriegens Học viên thực III MỤC LỤC MỤC LỤC III DANH MỤC HÌNH VI DANH MỤC BẢNG BIỂU VIII DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT IX CHƯƠNG ĐẶT VẤN ĐỀ VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan chitin Chitin tự nhiên Cấu trúc chitin 1.2 Enzyme phân giải chitin Enzyme thuỷ phân chitin-Chitinase Enzyme oxi hoá phân giải chitin 1.3 Vi khuẩn biển chế thuỷ phân phân giải chitin Họ Vibrionaceae Con đường thuỷ phân chitin phân bố gen liên quan họ Vibrionaceae Một số gen quan trọng tham gia phân giải chitin 11 Sử dụng mồi thoái hoá phát gen chitinase 14 Mối liên quan khả sinh trưởng chất chitin/ GlcNAc với có mặt gen chitinase 14 1.4 Tổng hợp số nghiên cứu liên quan đến vi khuẩn phân giải chitin (tập trung họ Vibrionaceae) gen chitinase 16 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 19 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 19 2.2 2.1.2 Thiết bị dùng cho thí nghiệm 19 2.1.3 Hoá chất, vật liệu sử dụng 19 MÔI TRƯỜNG SỬ DỤNG 20 2.2.1 Môi trường phân lập, mơi trường thử định tính hoạt tính chitinase, môi trường nuôi sinh enzyme 20 2.2.2 Môi trường giữ chủng sau phân lập: mơi trường khống môi trường LB bổ sung chitin keo 20 2.3 CHỦNG VI SINH VẬT 20 2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.4.1 Phương pháp phân lập 21 IV 2.4.2 Phương pháp xác định định tính chitinase đĩa thạch 21 2.4.3 Phương pháp nuôi thu enzyme 21 2.4.4 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme 22 2.4.5 phân lập Xác định đặc điểm sinh trưởng đặc tính hố sinh chủng 24 2.4.6 Định danh chủng xác định gen sinh học phân tử 24 2.4.7 Xây dựng phát sinh chủng loài 26 2.4.8 Kiểm tra có mặt số gen phân giải chitin 26 2.4.9 Kiểm tra in silico có mặt gen chitinase 27 2.4.10 Xác định khả sinh trưởng chitin sản phẩm thuỷ phân từ chitin 28 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Phân lập sàng lọc vi khuẩn phát triển nhanh mơi trường khống chứa chitin nguồn carbon 29 Kết phân lập 29 Sàng lọc thu nhận chủng sinh chitinase tốt 30 Kết định danh chủng phân lập 31 Đặc tính hố sinh chủng phân lập 36 3.2 Xác định có mặt gen liên quan đến trình phân giải chitin chủng sàng lọc 38 Kết thiết kế mồi thoái hoá phát gen chitinase 38 Kết PCR kiểm tra có mặt gen 40 Kiểm tra in silico có mặt gen 41 3.3 Khả phân giải chitin chủng sàng lọc 43 Hoạt tính chitinase chủng 43 Khả sinh trưởng chitin sản phẩm thuỷ phân từ chitin (chitin oligomer, GlcNAc) 45 3.4 Mối liên quan có mặt trình tự gen chitinase khả phân giải chitin chủng sàng lọc 50 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 PHỤ LỤC 58 V DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hố học chitin/chitosan số ví dụ nguồn chứa chitin [1] Hình 1.2 Dạng cấu trúc α, β, γ- chitin [3] Hình 1.3 Hoạt động hệ enzyme chitinase [6] Hình 1.4 Quá trình phân giải chất đơn phân theo chế khác [4] Hình 1.5 Cây phân loại xây dựng dựa trình tự 16S rRNA họ Vibrionaceae (có bổ sung chi khác) sử dụng thuật toán neightbor-joining method [11] Hình 1.6 Con đường phân giải chitin V cholerae N16961 [13] Hình 1.7 Phân bố gen liên quan đến đường phân giải chitin hệ gen Vibrionaceae [11] 11 Hình 1.8 Vai trị gen chitinase khả sinh trưởng V cholerae môi trường M9 chứa chitin nguồn C [14] 13 Hình 1.9 ChiA2 VC_A0700 đủ cho sinh trưởng chitin 13 Hình 1.10 Thống kê số lượng chủng có chứa gen chiA (phản ứng PCR dương tính) chủng sinh trưởng nguồn chất chitin nghiên cứu Hunt cộng [13] 14 Hình 2.1 Các bước thực thiết kế mồi thối hố 26 Hình 2.2 Khung Blast nucleotide tiêu chí lựa chọn cho việc kiểm tra in silico trình tự chitinase 27 Hình 2.3 Khung Blast trình tự amino acid tiêu chí lựa chọn cho việc kiểm tra in silico trình tự chitinase 28 Hình 3.1 Khuẩn lạc số chủng phân lập 29 Hình 3.2 Vịng thuỷ phân số chủng đĩa thạch mơi trường khống chứa chitin keo nguồn carbon 30 Hình 3.3 Phân bố số lượng chủng phân lập theo loài 32 Hình 3.4 Cây phát sinh chủng lồi dựa trình tự 16S rRNA chủng phân lập chủng đại diện họ Vibrionaceae đặc tính phân giải chitin 35 Hình 3.5 Kết Align trình tự amino acid lồi khác họ Vibrionaceae nhằm tìm vùng bảo thủ (khung đỏ) để thiết kế mồi phát gen VC_1952 39 Hình 3.6 Kết PCR số gen chủng (khung trắng thể phản ứng âm tính phản ứng có band sản phẩm khác kích thước dự đốn) 40 Hình 3.7 Hoạt độ enzyme chitinase tổng (A), hexosaminidase (B) endochitinase (C) chủng phân lập 44 Hình 3.8 Sinh trưởng chủng (xác định qua OD 600nm) mơi trường chứa khống mơi trường chứa khống bổ sung 1% (w/v) chitin thơ dạng α β sau 24h 46 VI Hình 3.9 Các ống ni thử khả sinh trưởng chủng phân lập chất α-chitin (các chủng từ trái sang: V diabolicus 5.4, V natriegens 10.3, E.coli BL21) 47 Hình 3.10 Sắc ký đồ HPLC dịch thuỷ phân chitin keo sử dụng enzyme thô chủng B02 48 Hình 3.11 Khả sinh trưởng chủng dịch thuỷ phân chitin keo sau 24 h 48 Hình 3.12 Sinh trưởng chủng phân lập mơi trường khống chứa 10g/L GlcNAc 49 VII TÀI LIỆU THAM KHẢO 10 11 12 13 14 15 16 Leen Bastiaens, L.S., Els D’Hondt, and Kathy Elst, Sources of Chitin and Chitosan and their Isolation Chitin and Chitosan: Properties and Applications, ed L.A.M.v.d.B.a.C.G Boeriu 2020, Belgium: John Wiley & Sons Ltd Souza, C.P., et al., The importance of chitin in the marine environment Mar Biotechnol (NY), 2011 13(5): p 823-30 I., A., Functional Characterization of Chitin and Chitosan Current Chemical Biology, 2009 3: p 203-230 Jiang, W.X., et al., A pathway for chitin oxidation in marine bacteria Nat Commun, 2022 13(1): p 5899 Dukariya, G and A Kumar, Distribution and Biotechnological Applications of Chitinase: A Review International Journal of Biochemistry and Biophysics, 2020 8(2): p 17-29 Mathew, G.M., et al., Thermophilic Chitinases: Structural, Functional and Engineering Attributes for Industrial Applications Appl Biochem Biotechnol, 2021 193(1): p 142-164 Mekasha, S., et al., A trimodular bacterial enzyme combining hydrolytic activity with oxidative glycosidic bond cleavage efficiently degrades chitin J Biol Chem, 2020 295(27): p 9134-9146 SVITIL, A.L., Chitin Degradation Proteins Produced by the Marine Bacterium Vibrio harveyi Growing on Different Forms of Chitin Applied and Environmental Microbiology, 1997 Vol 63, No.2: p 408-413 Keyhani, N.O., X.B Li, and S Roseman, Chitin catabolism in the marine bacterium Vibrio furnissii Identification and molecular cloning of a chitoporin J Biol Chem, 2000 275(42): p 33068-76 Meibom, K.L., et al., The Vibrio cholerae chitin utilization program Proc Natl Acad Sci U S A, 2004 101(8): p 2524-9 Gomez-Gil, B., et al., The Famlily Vibrionaceae, in The Prokaryotes 2014 p 659-747 Itoh, T and H Kimoto, Bacterial Chitinase System as a Model of Chitin Biodegradation Adv Exp Med Biol, 2019 1142: p 131-151 Hunt, D.E., et al., Conservation of the chitin utilization pathway in the Vibrionaceae Appl Environ Microbiol, 2008 74(1): p 44-51 Hayes, C.A., T.N Dalia, and A.B Dalia, Systematic genetic dissection of chitin degradation and uptake in Vibrio cholerae Environ Microbiol, 2017 19(10): p 4154-4163 Debnath, A., T Mizuno, and S.I Miyoshi, Regulation of Chitin-Dependent Growth and Natural Competence in Vibrio parahaemolyticus Microorganisms, 2020 8(9) Ramaiah, N., Use of a chiA probe for detection of chitinase genes in bacteria from the Chesapeake Bay FEMS Microbiology Ecology, 2000 34 (2000) 63^71 53 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 Keyhani, N.O., The Chitin Catabolic Cascade in the Marine Bacterium Vibrio furnissii The Journal of Biological chemistry, 1996 Vol 271, No 52: p pp 33414–33424 Soto-Gil, R.W and J.W Zyskind, N,N'-diacetylchitobiase of Vibrio harveyi Primary structure, processing, and evolutionary relationships J Biol Chem, 1989 264(25): p 14778-83 Somerville, C.C and R.R Colwell, Sequence analysis of the beta-Nacetylhexosaminidase gene of Vibrio vulnificus: evidence for a common evolutionary origin of hexosaminidases Proc Natl Acad Sci U S A, 1993 90(14): p 6751-5 LeCleir, G.R., A Buchan, and J.T Hollibaugh, Chitinase gene sequences retrieved from diverse aquatic habitats reveal environment-specific distributions Appl Environ Microbiol, 2004 70(12): p 6977-83 Konopka, J.B., N-acetylglucosamine (GlcNAc) functions in cell signaling Scientifica (Cairo), 2012 2012 Thompson, F.L., et al., Effect of N-Acetyl-D-Glucosamine on Gene Expression in Vibrio parahaemolyticus Microbes and Environments, 2011 26(1): p 61-66 Zavala-Norzagaray, A.A., et al., Isolation, characterization, and antibiotic resistance of Vibrio spp in sea turtles from Northwestern Mexico Front Microbiol, 2015 6: p 635 Paulsen, S.S., et al., Biological Potential of Chitinolytic Marine Bacteria Mar Drugs, 2016 14(12) Lin, H., et al., Comparative genomic analysis reveals the evolution and environmental adaptation strategies of vibrios BMC Genomics, 2018 19(1): p 135 Xue, M., et al., Comparative Genomic Analysis of Seven Vibrio alginolyticus Strains Isolated From Shrimp Larviculture Water With Emphasis on Chitin Utilization Front Microbiol, 2022 13: p 925747 Salas-Ovilla, R., et al., Isolation and identification of marine strains of Stenotrophomona maltophilia with high chitinolytic activity PeerJ, 2019 7: p e6102 Suginta, W., Chitinases from Vibrio: activity screening and purification of chiA from Vibrio carchariae Journal of Applied Microbiology, 2000 89: p 76-84 Subramanian, Bioconversion of chitin and concomitant production of chitinase and n‑acetylglucosamine by novel Achromobacter xylosoxidans isolated from shrimp waste disposal area Scientific Reports, Nature research, 2020 10:11898 YABUKI, M., Purification chitinase and characterization and chitobiase by Aeromonas Hydrophila anaerogenes A52 J Gen Appl Microbiol., 1986 32: p 25-38 Waterborg, J.H., The Lowry Method for Protein Quantitation, in The Protein Protocols Handbook, J.M Walker, Editor 2009, Humana Press: Totowa, NJ p 7-10 54 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 Li, Z., M Nimtz, and U Rinas, The metabolic potential of Escherichia coli BL21 in defined and rich medium Microbial Cell Factories, 2014 13(1): p 45 Pearson, W.R., An introduction to sequence similarity ("homology") searching Curr Protoc Bioinformatics, 2013 Chapter 3: p 3.1.1-3.1.8 Saima, et al., Isolation of novel chitinolytic bacteria and production optimization of extracellular chitinase Journal of Genetic Engineering and Biotechnology, 2013 11(1): p 39-46 Mathews, S., et al., Methods for Facilitating Microbial Growth on Pulp Mill Waste Streams and Characterization of the Biodegradation Potential of Cultured Microbes Journal of visualized experiments : JoVE, 2013 82 Lami, M., et al., Pseudomonas stutzeri MJL19, a rhizosphere‐colonizing bacterium that promotes plant growth under saline stress Journal of Applied Microbiology, 2020 129 Howard, M.B., et al., Detection and characterization of chitinases and other chitin-modifying enzymes J Ind Microbiol Biotechnol, 2003 30(11): p 627-35 Walter, A., S Friz, and C Mayer, Chitin, Chitin Oligosaccharide, and Chitin Disaccharide Metabolism of Escherichia coli Revisited: Reassignment of the Roles of ChiA, ChbR, ChbF, and ChbG Microb Physiol, 2021 31(2): p 178-194 Anuradha, V., Purification and Characterization of Bacterial Chitinase isolated from Crustacean Shells International Journal of Pure & Applied Bioscience, 2013 (4): p 1-11 Younes, I and M Rinaudo, Chitin and chitosan preparation from marine sources Structure, properties and applications Mar Drugs, 2015 13(3): p 1133-74 Peniche, C., W Argüelles-Monal, and F.M Goycoolea, Chapter 25 - Chitin and Chitosan: Major Sources, Properties and Applications, in Monomers, Polymers and Composites from Renewable Resources, M.N Belgacem and A Gandini, Editors 2008, Elsevier: Amsterdam p 517-542 Park, S.H., Purification and Characterization of Chitinase from a Marine Bacterium, Vibrio sp 98CJ11027 The Journal of Microbiology, 2000 Vol 38, No.4: p 224-229 Bhattacharya, D., A Nagpure, and R.K Gupta, Bacterial Chitinases: Properties and Potential Critical Reviews in Biotechnology, 2008 27(1): p 21-28 Xiao, Y., et al., Distribution and Molecular Characteristics of Vibrio Species Isolated from Aquatic Environments in China, 2020 Microorganisms, 2022 10(10) Urbanczyk, H., J.C Ast, and P.V Dunlap, Phylogeny, genomics, and symbiosis of Photobacterium FEMS Microbiology Reviews, 2011 35(2): p 324-342 Weinstock, M.T., et al., Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology Nat Methods, 2016 13(10): p 849-51 55 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 Takemura, A.F., D.M Chien, and M.F Polz, Associations and dynamics of Vibrionaceae in the environment, from the genus to the population level Front Microbiol, 2014 5: p 38 Yang, B., Y Wang, and P.Y Qian, Sensitivity and correlation of hypervariable regions in 16S rRNA genes in phylogenetic analysis BMC Bioinformatics, 2016 17: p 135 Kozińska, A and A Pekala-Safinska, First isolation of Shewanella putrefaciens from freshwater fish - A potential new pathogen of fish Bulletin- European Association of Fish Pathologists, 2004 24 Wang, M.Q and L Sun, Shewanella inventionis sp nov., isolated from deep-sea sediment Int J Syst Evol Microbiol, 2016 66(12): p 4947-4953 Laribi-Habchi, H., et al., Characterization of chitinase from Shewanella inventionis HE3 with bio-insecticidal effect against granary weevil, Sitophilus granarius Linnaeus (Coleoptera: Curculionidae) Process Biochemistry, 2020 97: p 222-233 Chase, E and V.J Harwood, Comparison of the effects of environmental parameters on growth rates of Vibrio vulnificus biotypes I, II, and III by culture and quantitative PCR analysis Appl Environ Microbiol, 2011 77(12): p 4200-7 Hu, S., et al., Effects of NaCl Concentration on the Behavior of Vibrio brasiliensis and Transcriptome Analysis Foods, 2022 11(6) Park, Y.D., et al., Photobacterium ganghwense sp nov., a halophilic bacterium isolated from sea water Int J Syst Evol Microbiol, 2006 56(Pt 4): p 745-749 Ohishi, K., et al., Purification and properties of two chitinases from Vibrio alginolyticus H-8 Journal of Fermentation and Bioengineering, 1996 82(6): p 598-600 Honda, Y., H Taniguchi, and M Kitaoka, A reducing-end-acting chitinase from Vibrio proteolyticus belonging to glycoside hydrolase family 19 Appl Microbiol Biotechnol, 2008 78(4): p 627-34 CHEN, -.L., et al., - Mutation Breeding and Enzymatic Properties of Coldadapted Chitinolytic Strain Photobacterium sp from Marine %J Science and Technology of Food Industry 2021 - 42(- 10): p - 105 Kaczmarek, M.B., et al., Enzymatic Modifications of Chitin, Chitosan, and Chitooligosaccharides Front Bioeng Biotechnol, 2019 7: p 243 Kadokura, K., et al., Purification and characterization of Vibrio parahaemolyticus extracellular chitinase and chitin oligosaccharide deacetylase involved in the production of heterodisaccharide from chitin Appl Microbiol Biotechnol, 2007 75(2): p 357-65 Takiguchi, Y., N,N -Diacetylchitobiose production from chitin by Vibrio anguillarum strain E-383a Letters in Applied Microbioloyy, 1988 MS/071: p 129-131 Hirano, S and N Nagao, An Improved Method for the Preparation of Colloidal Chitin by using Methanesulfonic Acid Agricultural and Biological Chemistry, 2016 52(8): p 2111-2112 56 62 63 64 65 66 67 68 Plumbridge, J.A., Induction of the nag regulon of Escherichia coli by Nacetylglucosamine and glucosamine: role of the cyclic AMP-catabolite activator protein complex in expression of the regulon J Bacteriol, 1990 172(5): p 2728-35 White, R.J., The role of the phosphoenolpyruvate phosphotransferase system in the transport of N-acetyl-D-glucosamine by Escherichia coli Biochem J, 1970 118(1): p 89-92 Baumann, P., L Baumann, and M Mandel, Taxonomy of marine bacteria: the genus Beneckea J Bacteriol, 1971 107(1): p 268-94 Thoma, F and B Blombach, Metabolic engineering of Vibrio natriegens Essays Biochem, 2021 65(2): p 381-392 Hoff, J., et al., Vibrio natriegens: an ultrafast-growing marine bacterium as emerging synthetic biology chassis Environ Microbiol, 2020 22(10): p 4394-4408 Kormanová, Ľ., et al., Comparison of simple expression procedures in novel expression host Vibrio natriegens and established Escherichia coli system Journal of Biotechnology, 2020 321: p 57-67 Abd-Elsalam, K.A., Bioinformatic tools and guideline for PCR primer design Advanced Journal of Microbiology Research 2003 Vol 2003 57 PHỤ LỤC Nguyên tắc chung thiết kế mồi cho phản ứng PCR Bảng S1 Nguyên tắc thiết kế mồi cho phản ứng PCR [68] Yếu tố Yêu cầu thiết kế Nguyên nhân Chiều dài mồi 18-22bp Mồi có chiều dài phù hợp nhằm đảm bảo độ đặc hiệu bám dễ dàng lên khuôn nhiệt độ gắn mồi Nhiệt độ nóng chảy 52-58°C Tm nhiệt độ 50% DNA mạch kép bị tách tạo sợi đơn, thể độ bền DNA kép Tm > 65°C có xu hướng tạo cấu trúc bám bậc hai (Tm) Thông thường: Nhiệt độ gắn mồi (Ta) Ta = Tm-5 (°C) Ta cao làm trình bám mồi hiệu dẫn đến hiệu suất PCR thấp Ta thấp dễ hình thành sản phẩm khơng đặc hiệu bắt cặp nhầm 40-60% Hàm lượng GC % hàm lượng G-C ảnh hưởng đến độ ổn định nhiệt độ nóng chảy mồi GC Clamp Có G C Giúp tăng cường khả bám đặc hiệu đầu nu cuối đầu 3’ 3’ liên kết mạnh nu G/C Tránh nu G C liên tiếp Cấu trúc bậc hai mồi (primer) - Cấu trúc kẹp tóc: ΔG ~ -2kcal/mol Self-dimer Hetero-dimer: Ở vị trí đầu 3’: ΔG ≤ -5 kcal/mol Nội phân tử: ΔG ≤ -6 kcal/mol Cấu trúc bậc hai primer tạo thành tương tác nội ngoại phân tử dẫn đến hiệu suất tạo sản phẩm tác động ngược đến khuôn phản ứng khuếch đại x Cấu trúc kẹp tóc: hình thành liên kết liên phân tử mồi x Self-dimer: hình thành liên kết hai primer chiều (same sense), làm giảm hiệu suất tạo sản phẩm x Hetero-dimer: hình thành liên kết liên phân tử mồi sense antisense vị trí bắt cặp bổ sung Do phản ứng PCR dùng lượng primer lớn nhiều lần so với khuôn, liên kết primer-primer dễ xảy bắt cặp primer-khuôn Đoạn lặp Số lượng di- Đoạn lặp nu bắt cặp bổ sung (VD: nucleotide ATATATATAT) đoạn lặp dài nucleotide lặp ≤ 4bp nu (VD: AGCGGGGGATGGGG) gây bắt cặp nhầm 58 Cấu trúc bậc hai mạch khuôn Tránh thiết kế mồi bám mạch khuôn vùng dễ tạo cấu trúc bậc hai Độ dài đoạn khuếch đại ~500 bp (với phản Gen đích có độ dài phù hợp dễ khuếch đại dễ ứng PCR tiêu chuẩn) biến tính nhiệt, tạo cấu trúc bậc hai Chênh lệch nhiệt độ mồi Ta) bám vào mạch khuôn, làm ảnh hưởng đến hiệu phản ứng ΔTm lớn dẫn đến khơng có phản ứng khuếch đại Một số kết thí nghiệm bổ sung Hình S2.1 Giá trị OD 600nm thời điểm 0h (ngay sau cấp giống) chủng môi trường kiểm chứng chứa khống mơi trường khống bổ sung 1% (w/v) chitin thơ 59 Hình S2.2 Giá trị OD 600nm chủng chất chitin thô α (A), β (B) theo thời gian Hình S2.3 Lượng đường sử dụng chủng (%) nuôi môi trường dịch thuỷ phân chitin keo enzyme thô thu từ chủng V proteolyticus B02 (Lượng (GlcNAc)i, với i từ – xác định phương pháp sắc ký HPLC: thiết bị Agilent 1200 infinity, áp suất bơm Pmax = 100 bar, cột Aminex HPX-87H tách rửa nhiệt độ 400C, pha động H2SO4 10 mM, vận tốc dịng v = 0,6 ml/ phút, thể tích mẫu 0,02 ml, phát bước sóng 210 nm Từ sắc ký đồ (GlcNAc)i chuẩn, ta tính lượng (GlcNAc)i với i = 1-2) 60 Hình S2.4 OD 600nm lượng đường tiêu thụ sau 24h chủng nuôi mơi trường khống chứa 10g/L GlcNAc Hình S2.5 Vùng tương đồng phần kết so sánh trình tự gen VC_1952 loài đại diện họ Vibrionaceae Các đường chuẩn sử dụng xác định hoạt tính chitinase 3.1 Đường chuẩn GlcNAc (xác định phương pháp DNS) 3.2 Đường chuẩn p-NP 61 3.3 Đường chuẩn BSA (xác định phương pháp Lowry) Trình tự 16S rRNA chủng phân lập 4.1 V natriegens 7.2 TGCAAGTCGAGCGGAAACGAGTTAACTGAACCTTCGGGGGACGTTAACGGCGTCGAGCGGCGGACGGGTG AGTAATGCCTAGGAAATTGCCCTGATGTGGGGGATAACCATTGGAAACGATGGCTAATACCGCATGATGC CTACGGGCCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTCGCGTCAGGATATGCCTAGGTGGGATTAGCTAGTTGG TGAGGTAAGGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGA GACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGC CATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTCGTGAGGAAGGTAGTGGAGTTA ATAGCTGCATTATTTGACGTTAGCGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATA CGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCATGCAGGTGGTTTGTTAAGTCAGATGT GAAAGCCCGGGGCTCAACCTCGGAATAGCATTTGAAACTGGCAGACTAGAGTACTGTAGAGGGGGGTAGA ATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACA GATACTGACACTCAGATGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAA ACGATGTCTACTTGGAGGTTGTGGCCTTGAGCCGTGGCTTTCGGAGCTAACGCGTTAAGTAGACCGCCTG GGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGT TTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAATTTTCCAGAGATGGATTGGT GCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGT CCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTGTTTGCCAGCGAGTAATGTCGGGAACTCCAGGGAGACTGCCGG TGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGC TACAATGGCGCATACAGAGGGCGGCCAACTTGCGAAAGTGAGCGAATCCCAAAAAGTGCGTCGTAGTCCG GATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGA ATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGCTGCAAAAGAAGTAGGTAGTT TAACCTTCGGGGGGACGCTTACCCAC 4.2 > V natriegens 10.3 ATGCAAGTCGAGCGGAAACGAGTTAACTGAACCTTCGGGGGACGTTAACGGCGTCGAGCGGCGGACGGGT GAGTAATGCCTAGGAAATTGCCCTGATGTGGGGGATAACCATTGGAAACGATGGCTAATACCGCATGATG CCTACGGGCCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTCGCGTCAGGATATGCCTAGGTGGGATTAGCTAGTTG GTGAGGTAAGGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTG AGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAG CCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTCGTGAGGAAGGTTTATGCGTT AATAGCGTATATATTTGACGTTAGCGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAAT ACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCATGCAGGTGGTTTGTTAAGTCAGATG 62 TGAAAGCCCGGGGCTCAACCTCGGAATAGCATTTGAAACTGGCAGACTAGAGTACTGTAGAGGGGGGTAG AATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGAC AGATACTGACACTCAGATGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTA AACGATGTCTACTTGGAGGTTGTGGCCTTGAGCCGTGGCTTTCGGAGCTAACGCGTTAAGTAGACCGCCT GGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGG TTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGG TGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAG TCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTGTTTGCCAGCGAGTAATGTCGGGAACTCCAGGGAGACTGCCG GTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACAACTTCAAGTCATCATGGCCCTTACAAATAGGGCTACACACGTG CTACAATGGCGCATACAGAGGGCGGCCAACTTGCGAAAGTGAGCGAATCCCAAAAAGTGCGTCGTAGTCC GGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTG AATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGCTGCAAAAGAAGTAGGTAGT TTAACCTTCGGGGGGACGCTTACCCACTT 4.3 > V natriegens N53 GCTACCATGCAAGTCGAGCGGAAACGAGTTAACTGAACCTTCGGGGGACGTTAACGGCGTCGAGCGGCGG ACGGGTGAGTAATGCCTAGGAAATTGCCCTGATGTGGGGGATAACCATTGGAAACGATGGCTAATACCGC ATGATGCCTACGGGCCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTCGCGTCAGGATATGCCTAGGTGGGATTAGC TAGTTGGTGAGGTAAGGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTG GAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTG ATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTCGTGAGGAAGGTTTA TGCGTTAATAGCGTATAGATTTGACGTTAGCGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGC GGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCATGCAGGTGGTTTGTTAAGT CAGATGTGAAAGCCCGGGGCTCAACCTCGGAATAGCATTTGAAACTGGCAGACTAGAGTACTGTAGAGGG GGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCC CTGGACAGATACTGACACTCAGATGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCAC GCCGTAAACGATGTCTACTTGGAGGTTGTGGCCTTGAGCCGTGGCTTTCGGAGCTAACGCGTTAAGTAGA CCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGC ATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTCAGAGATGG ATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGG TTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTGTTTGCCAGCGAGTAATGTCGGGAACTCCAGGGAGAC TGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACAAGTAGGGCTACNA CGTGCTACAATGGCGCGCGAATCCCAAAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCA TGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACAC CGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGCTGCAAAAGAAGTAGGTAGTTTAACCTTCGGGGGACGCTTACCA 4.4 > V alginolyticus 4.1 TGCAAGTCGAGCGGAAACGAGTTATCTGAACCTTCGGGGGACGATAACGGCGTCGAGCGGCGGACGGGTG AGTAATGCCTAGGAAATTGCCCTGATGTGGGGGATAACCATTGGAAACGATGGCTAATACCGCATGATGC CTACGGGCCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTCGCGTCAGGATATGCCTAGGTGGGATTAGCTAGTTGG TGAGGTAAGGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGA GACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGC CATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTCGTGAGGAAGGTGGTGTAGTTA ATAGCTGCATTATTTGACGTTAGCGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATA CGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCATGCAGGTGGTTTGTTAAGTCAGATGT GAAAGCCCGGGGCTCAACCTCGGAATAGCATTTGAAACTGGCAGACTAGAGTACTGTAGAGGGGGGTAGA ATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACA GATACTGACACTCAGATGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAA ACGATGTCTACTTGGAGGTTGTGGCCTTGAGCCGTGGCTTTCGGAGCTAACGCGTTAAGTAGACCGCCTG GGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGT TTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGT GCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGT CCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTGTTTGCCAGCGAGTAATGTCGGGAACTCCAGGGAAACTGCCGG TGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACAAGTAGGCTAGCTACACACG TGCTACAATGGCGCATACAGAGGGCGGCCAACTTGCGAAAGTGAGCGAATCCCAAAAAGTGCGTCGTAGT CCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGG TGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGCTGCAAAAGAAGTAGGTA GTTTAACCTTCGGGGGACGCTTACCCACTTT 4.5 > V alginolyticus 5.4 TGCAAGTCGAGCGGAAACGAGTTATCTGAACCTTCGGGGAACGATAACGGCGTCGAGCGGCGGACGGGTG AGTAATGCCTAGGAAATTGCCCTGATGTGGGGGATAACCATTGGAAACGATGGCTAATACCGCATGATGC CTACGGGCCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTCGCGTCAGGATATGCCTAGGTGGGATTAGCTAGTTGG TGAGGTAAGGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGA GACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGC CATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTCGTGAGGAAGGTAGTGTAGTTA ATAGCTGCATTATTTGACGTTAGCGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATA 63 CGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCATGCAGGTGGTTTGTTAAGTCAGATGT GAAAGCCCGGGGCTCAACCTCGGAATAGCATTTGAAACTGGCAGACTAGAGTACTGTAGAGGGGGGTAGA ATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACA GATACTGACACTCAGATGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAA ACGATGTCTACTTGGAGGTTGTGGCCTTGAGCCGTGGCTTTCGGAGCTAACGCGTTAAGTAGACCGCCTG GGGAGTACGGTCGCAAGATTATAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGT TTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGT GCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGT CCCGCAACGAGCGCAACCTTATCCTTGTTTGCCAGCGAGTAATGTCGGGAACTCCAGGGAAACTGCCTGG AGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGT TCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGCTGCAAAAGAAGTAGGTAGTTTAACCT TCGGGGGGACGCTTACCCACTTTGGTCAAGGGG 4.6 > V alginolyticus 5.5.1 AGTTATCTGAACCTTCGGGGAACGATAACGGCGTCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAAATTG CCCTGATGTGGGGGATAACCATTGGAAACGATGGCTAATACCGCATGATGCCTACGGGCCAAAGAGGGGG ACCTTCGGGCCTCTCGCGTCAGGATATGCCTAGGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAGGGCTCACCAA GGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTA CGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGA AGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTCGTGAGGAAGGTAGTGTAGTTAATAGCTGCATTATTTGACG TTAGCGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAA TCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCATGCAGGTGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAAGCCCGGGGCTCAACC TCGGAATAGCATTTGAAACTGGCAGACTAGAGTACTGTAGAGGGGGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGA AATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAGATACTGACACTCAGATGC GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTTGGAGGT TGTGGCCTTGAGCCGTGGCTTTCGGAGCTAACGCGTTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGAT TAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGA AGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGA CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCACCCT TATCCTTGTTTGCCAGCGAGTAATGTCGGGAACTCCAGGGAAACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTG GGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAGAGG GCGGCCAACTTGCGAAAGTGAGCGAATCCCAAAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGA CTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTA CACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGCTGCAAAAGAAGTAGGTAGTTTAACCTTCGGGGGGACGCTT ACCCACTTTG 4.7 > V alginolyticus B01 TGCAAGTCGAGCGGAAACGAGTTATCTGAACCTTCGGGGAACGATAACGGCGTCGAGCGGCGGACGGGTG AGTAATGCCTAGGAAATTGCCCTGATGTGGGGGATAACCATTGGAAACGATGGCTAATACCGCATGATGC CTACGGGCCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTCGCGTCAGGATATGCCTAGGTGGGATTAGCTAGTTGG TGAGGTAAGGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGA GACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGC CATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTCGTGAGGAAGGTGGTGTAGTTA ATAGCTGCATTATTTGACGTTAGCGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATA CGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCATGCAGGTGGTTTGTTAAGTCAGATGT GAAAGCCCGGGGCTCAACCTCGGAATAGCATTTGAAACTGGCAGACTAGAGTACTGTAGAGGGGGGTAGA ATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACA GATACTGACACTCAGATGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAA ACGATGTCTACTTGGAGGTTGTGGCCTTGAGCCGTGGCTTTCGGAGCTAACGCGTTAAGTAGACCGCCTG GGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGT TTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGT GCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGT CCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTGTTTGCCAGCGAGTAATGTCGGGAACTCCAGGGAGACTGCCGG TGATAAACCGGAGGAAGGGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCT ACAATGGCGCATACAGAGGGCGGCCAACTTGCGAAAGTGAGCGAATCCCAAAAAGTGCGTCGTAGTCCGG ATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAA TACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGCTGCAAAAGAAGTAGGTAGTTT AACCTTCGGGGGGACGCTTACCACTTT 4.8 > V alginolyticus MK2-1 GGTGAGTAACGACTAGGAAATTGCCCTGATGTGGGGGATAACCATTGGAAACGATGGCTAATACCGCATG ATGCCTACGGGCCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTCGCGTCAGGATATGCCTAGGTGGGATTAGCTAG TTGGTGAGGTAAGGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAA CTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATG 64 CAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTCGTGAGGAAGGTAGTGTA GTTAATAGCTGCATTATTTGACGTTAGCGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGT AATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCATGCAGGTGGTTTGTTAAGTCAG ATGTGAAAGCCCGGGGCTCAACCTCGGAATAGCATTTGAAACTGGCAGACTAGAGTACTGTAGAGGGGGG TAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTG GACAGATACTGACACTCAGATGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCC GTAAACGATGTCTACTTGGAGGTTGTGGCCTTGAGCCGTGGCTTTCGGAGCTAACGCGTTAAGTAGACCG CCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATG TGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTCCAGAGATGGAT TGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTT AAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTGTTTGCCAGCGAGTAATGTCGGGAACTCCAGGGAGACTG CCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACAC GTGCTACAATGGCGCATACAGAGGGCGGCCAACTTGCGAAAGTGAGCGAATCCCAAAAAGTGCGTCGTAG TCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACG GTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGCTGCAAAAGAAGTAGGT AGTTTAACCTTCGGGGGGACGCTTACCC 4.9 > V diabolicus 4.5.0 GCCTACCATGCAAGTCGAGCGGAAACGAGTTATCTGAACCTTCGGGGGACGATAACGGCGTCGAGCGGCG GACGGGTGAGTAATGCCTAGGAAATTGCCCTGATGTGGGGGATAACCATTGGAAACGATGGCTAATACCG CATGATGCCTACGGGCCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTCGCGTCAGGATATGCCTAGGTGGGATTAG CTAGTTGGTGAGGTAAGGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACT GGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCT GATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGTCGTGAGGAAGGCGG CGTCGTTAATAGCGGCGTTGTTTGACGTTAGCGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCG CGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCATGCAGGTGGTTTGTTAAG TCAGATGTGAAAGCCCGGGGCTCAACCTCGGAATAGCATTTGAAACTGGCAGACTAGAGTACTGTAGAGG GGGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCC CCTGGACAGATACTGACACTCAGATGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCA CGCCGTAAACGATGTCTACTTGGAGGTTGTGGCCTTGAGCCGTGGCTTTCGGAGCTAACGCGTTAAGTAG ACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAG CATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTCCAGAGAT GGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTG GGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTGTTTGCCAGCGAGTAATGTCGGGAACTCCAGGGAG ACTGCCGGTGATAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACA CACGTGCTACAATGGCGCATACAGAGGGCGGCCAACTTGCGAAAGTGAGCGAATCCCAAAAAGTGCGTCG TAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCC ACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGCTGCAAAAGAAGTA GGTAGTTTAACCTTCGGGGGGACGCTTACCCACTTT 4.10 > V diabolicus 5.2S CTACACATGCAAGTCGAGCGGAAACGAGTTATCTGAACCTTCGGGGAACGATAACGGCGTCGAGCGGCGG ACGGGTGAGTAATGCCTAGGAAATTGCCCTGATGTGGGGGATAACCATTGGAAACGATGGCTAATACCGC ATGATGCCTACGGGCCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTCGCGTCAGGATATGCCTAGGTGGGATTAGC TAGTTGGTGAGGTAAGGGCTCACCAAGGCAACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTG GAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTG ATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGTCGTGAGGAAGGCGGC GTCGTTAATAGCGGCGTTGTTTGACGTTAGCGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGC GGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCATGCAGGTGGTTTGTTAAGT CAGATGTGAAAGCCCGGGGCTCAACCTCGGAATAGCATTTGAAACTGGCAGACTAGAGTACTGTAGAGGG GGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCC CTGGACAGATACTGACACTCAGATGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCAC GCCGTAAACGATGTCTACTTGGAGGTTGTGGCCTTGAGCCGTGGCTTTCGGAGCTAACGCGTTAAGTAGA CCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGC ATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTCCAGAGATG GATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGG GTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTGTTTGCCAGCGAGTAATGTCGGGAACTCCAGGGAGA CTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACA CACGTGCTACAATGGCGCATACAGAGGGCGGCCAACTTGCGAGAGTGAGCGAATCCCAAAAAGTGCGTCG TAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCC ACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGCTGCAAAAGAAGTA GGTAGTTTAACCTTCGGGGGACGCTTACCACTTT 65 4.11 > V proteolyticus B02 TGCAAGTCGAGCGGAAACGAGTTATCTGAACCTTCGGGGGACGATANCGGCGTCGAGCGGCGGACGGGTG AGTAATGCCTGGGAAATTGCCCTGATGTGGGGGATAACCATTGGAAACGATGGCTAATACCGCATAATAG CTTCGGCTCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTCGCGTCAGGATATGCCCAGGTGGGATTAGCTAGTTGG TGAGGTAAGGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGA GACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGC CATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTCGTGAGGAAGGTAGTGTGTTTA ATAGATGCATTATTTGACGTTAGCGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATA CGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCATGCAGGTGGTGTGTTAAGTCAGATGT GAAAGCCCGGGGCTCAACCTCGGAATTGCATTTGAAACTGGCAGACTAGAGTACTGTAGAGGGGGGTAGA ATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCGCCCTGGACA GATACTGACACTCAGATGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAA ACGATGTCTACTTGGAGGTTGTGGCCTTGAGCCGTGGCTTTCGGAGCTAACGCGTTAAGTAGACCGCCTG GGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGT TTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGT GCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGT CCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTGTTTGCCAGCGAGTCATGTCGGGAACTCCAGGGAGACTGCCGG TGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACAAGTAGGGCTACACACGTGC TACAATGGCGCATACAGAGGGCGGCCAACTTGCGAAAGTGAGCGAATCCCAAAAAGTGCGTCGTAGTCCG GATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGA ATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGCTGCAAAAGAAGTGGGTAGTT TAACCTTCGGGAGGACGCTCACCCACTTT 4.12 > V parahaemolyticus 10.2T TGCAAGTCGAGCGGAAACGAGTTNTCTGAACCTTCGGGGGACGATAACGGCGTCGAGCGGCGGACGGGTG AGTAATGCCTAGGAAATTGCCCTGATGTGGGGGATAACCATTGGAAACGATGGCTAATACCGCATGATGC CTACGGGCCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTCGCGTCAGGATATGCCTAGGTGGGATTAGCTAGTTGG TGAGGTAAGGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGA GACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGC CATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTCGTGAGGAAGGTAGTGTAGTTA ATAGCTGCATTATTTGACGTTAGCGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATA CGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCATGCAGGTGGTTTGTTAAGTCAGATGT GAAAGCCCGGGGCTCAACCTCGGAATTGCATTTGAAACTGGCAGACTAGAGTACTGTAGAGGGGGGTAGA ATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACA GATACTGACACTCAGATGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAA ACGATGTCTACTTGGAGGTTGTGGCCTTGAGCCGTGGCTTTCGGAGCTAACGCGTTAAGTAGACCGCCTG GGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGT TTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGT GCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGT CCCGCCACGAGCGCAACCCTTATCCTTGTTTGCCAGCGAGTAATGTCGGGAACTCCAGGGAGACTGCCGG TGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGC TACAATGGCGCATACAGAGGGCAGCCAACTTGCGAAAGTGAGCGAATCCCAAAAAGTGCGTCGTAGTCCG GATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGA ATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGCTGCAAAAGAAGTAGGTAGTT TAACCTTCGGGGGGACGCTTACCCACTTT 4.13 > V harveyi MK9 ATGCAAGTCGAGCGGAAACGAGTTATCTGAACCTTCGGGGAACGATAACGGCGTCGAGCGGCGGACGGGT GAGTAATGCCTAGGAAATTGCCCTGATGTGGGGGATAACCATTGGAAACGATGGCTAATACCGCATAATA CCTTCGGGTCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTCGCGTCAGGATATGCCTAGGTGGGATTAGCTAGTTG GTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTG AGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAG CCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTCGTGAGGAAGGTAGTGTAGTT AATAGCTGCATTATTTGACGTTAGCGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAAT ACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCATGCAGGTGGTTTGTTAAGTCAGATG TGAAAGCCCGGGGCTCAACCTCGGAATAGCATTTGAAACTGGCAGACTAGAGTACTGTAGAGGGGGGTAG AATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGAC AGATACTGACACTCAGATGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTA AACGATGTCTACTTGGAGGTTGTGGCCTTGAGCCGTGGCTTTCGGAGCTAACGCGTTAAGTAGACCGCCT GGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGG TTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGG TGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAG TCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTGTTTGCCAGCACTTCGGGTGGGAACTCCAGGGAGACTGCCGG TGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAATAGGGCTACACACGTGC 66 TACAATGGCGCATACAGAGGGCGGCCAACTTGCGAGAGTGAGCGAATCCCAAAAAGTGCGTCGTAGTCCG GATCGGAGTCTGCAACTCGACTCCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGA ATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGCTGCAAAAGAAGTAGGTAGTT TAACCTTCGGGAGGACGCTTACCCACTTT 4.14 > P ganghwense 6.3Đ TGCAAGTCGAGCGGCAGCGACAACATTGACCCTTCGGGGGATTTGTTGGGCGGCGAGCGGCGGACGGGTG AGTAATGCCTGGGAACATGCCTTAGTGTGGGGGATAACCATTGGAAACGATGGCTAATACCGCATAATCT CTACGGAGCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTCGCGCTAAGATTGGCCCAGGTGGGATTAGCTAGTAGG TGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGA GACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGC CATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCAGTGAGGAAGGCGGTATCGTTA ATAGCGGTATTGTTTGACGTTAGCTGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATA CGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCATGCAGGCGGCTTGTTAAGCCAGATGT GAAAGCCCGGGGCTCAACCTCGGAATCGCATTTGGAACTGGCAGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGA ATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACA AAGACTGACGCTCAGATGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAA ACGATGTCTACTTGGAGGTTGGTGTCTTGAACACTGGCTTTCGGAGCTAACGCGTTAAGTAGACCGCCTG GGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGT TTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCACGGAATCCTGCAGAGATGCGGGAGT GCCTTCGGGAACCGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGT CCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTGTTTGCCAGCACTTCGGGTGGGAACTCCAGGGAGACTGCCGGT GATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCT ACAATGGCATATACAGAGGGCAGCAAGACCGCGAGGTGGAGCGAATCCCACAAAGTATGTCGTAGTCCGG ATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAA TACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGCTGCACCAGAAGTAGATAGCTT AACCTTCGGGAGGGCGTTA 67