Phân lập và xác định khả năng khử đạm của vi khuẩn pseudomonas stutzeri trong nước thải ao nuôi cá tra

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP – TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG KHỬ ĐẠM CỦA VI KHUẨN Pseudomonas stutzeri TRONG NƯỚC THẢI AO NUÔI CÁ TRA Chủ nhiệm đề tài: Ths Trịnh Hoài Vũ Long Xuyên, tháng năm 2012 i TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP – TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG KHỬ ĐẠM CỦA VI KHUẨN Pseudomonas stutzeri TRONG NƯỚC THẢI AO NUÔI CÁ TRA BAN GIÁM HIỆU KHOA NN-TNTN CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI Long Xuyên, tháng năm 2012 ii LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực đề tài gặp nhiều khó khăn động viên, giúp đỡ Ban giám hiệu, quý đồng nghiệp khoa NN-TNTN giúp tơi có động lực để vượt qua khó khăn q trình thí nghiệm Tơi xin trân trọng gởi lời cám ơn đến: - Trường Đại học An Giang cấp kinh phí cho tơi thực đề tài nghiên cứu - Ban chủ nhiệm Khoa Nông nghiệp-TNTN, trường Đại học An Giang tạo điều kiện thuận lợi cho thực đề tài - Các đồng nghiệp Bộ mơn Cơng nghệ sinh học hết lịng hỗ trợ, đóng góp nhiều ý kiến quý báu giúp đỡ tơi q trình hồn thành đề tài Xin chân thành cảm ơn! Long Xuyên, ngày 22 tháng 05 năm 2012 iii TÓM LƯỢC Từ nước ao nuôi cá tra huyện Chợ Mới, Phú Tân Châu Phú phân lập 21 dòng vi khuẩn có 11/21 dịng nhận diện xác vi khuẩn Pseudomonas stutzeri phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu fps158 rps743 Kết giải trình tự cho thấy dịng CM8 PT5 có mức độ đồng hình với vi khuẩn Pseudomonas stutzeri chuẩn 99% Các dịng CP1, CM8, PT3 PT5 có khả phát triển tốt mơi trường Minimal có bổ sung NH4+ NO3- nồng độ 500 mM mơi trường có bổ sung 100 mM NO2- Ba dòng vi khuẩn CP1, CM8 PT5 sử dụng thí nghiệm nước thải ao ni cá tra có khả oxy hóa NH4+, NO3- NO2-, làm giảm đáng kể lượng chất với hiệu suất cao khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng không xử lý Kết cho thấy có khả sử dụng chúng việc xử lý nước thải chứa đạm từ ao cá tra có triển vọng việc xử lý loại nước thải ô nhiễm đạm khác Từ khóa: Pseudomonas stutzeri, vi khuẩn khử đạm, nước thải ao nuôi cá tra, nitrat, kỹ thuật PCR iv MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ TÓM LƯỢC MỤC LỤC DANH SÁCH BẢNG DANH SÁCH HÌNH GIỚI THIỆU CHƯƠNG LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 1.1 Chu trình Nitrogen 1.2 Vi sinh vật chu trình Nitrogen 1.2.1 Cố định đạm 1.2.2 Sự đồng hóa Nitrogen 1.2.3 Sự khống hóa đạm (Ammonium hóa) 1.2.4 Sự nitrat hóa 1.2.5 Sự khử nitrat 1.3 Vi khuẩn Pseudomonas stutzeri 1.3.1 Vị trí Pseudomonas stutzeri hệ thống phân loại sinh vật 1.3.2 Các gen tham gia vào trình khử nitrat Pseudomonas stutzeri 1.3.3 Một số nghiên cứu khả khử nitrat Pseudomonas stutzeri 1.4 Các dạng đạm mơi trường nước 1.4.1 Ammonium (NH4+) 1.4.2 Nitrat (NO3-) 1.4.3 Nitrit (NO2-) 1.4.4 Nhu cầu oxy hóa học - COD (Chemical Oxygen Demand) CHƯƠNG PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phương tiện nghiên cứu 2.1.1 Thiết bị 2.2.2 Hóa chất 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Thời gian địa điểm thực thí nghiệm 2.2.2 Thu mẫu 2.2.3 Phân lập vi khuẩn 2.2.4 Nhận diện (identification) vi khuẩn Pseudomonas stutzeri 2.2.5 Đánh giá khả khử dòng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri 2.2.6 Giải trình tự dịng vi khuẩn có khả khử nitrate tốt 2.2.7 Thử nghiệm xử lý khả khử đạm loài vi khuẩn Pseudomonas stutzeri điều kiện thực tế CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết phân lập vi khuẩn khử đạm nước thải ao ni cá tra 3.2 Nhận diện dịng vi khuẩn phân lập kỹ thuật PCR Trang iii iv v vii viii 3 3 4 6 8 9 10 10 10 12 12 12 12 13 13 13 13 14 16 17 17 18 18 20 v 3.3 Kết giải trình tự số dịng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri phân lập 3.4 Khả khử nitrate, nitrite oxid hóa ammonium dịng Pseudomonas stutzeri 3.5 Thí nghiệm khả khử nitrate, nitrite dòng Pseudomonas stutzeri nước thải ao nuôi cá tra 3.5.1 pH 3.5.2 Ammonium (NH4+) 3.5.3 Nitrat (NO3-) 3.5.4 Nitrit (NO2-) 3.5.5 Nhu cầu oxy hóa học - COD (Chemical Oxygen Demand) KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Đề nghị TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ CHƯƠNG PHỤ CHƯƠNG 22 25 25 26 26 27 29 30 31 31 31 32 35 36 vi DANH SÁCH BẢNG Bảng Bảng Chu kỳ phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen khử đạm vùng 16S rRNA Pseudomonas stutzeri Bảng Trình tự primer dùng nhận diện vi khuẩn khử đạm Pseudomonas stutzeri (dựa vùng 16S rRNA) Bảng Đặc điểm dòng vi khuẩn phân lập tại ao nuôi cá tra Bảng Kết giải trình tự dịng CM8 Bảng Kết giải trình tự dịng PT5 Bảng Khả phát triển mơi trường Minimal có bổ sung NH4+, NO3- NO2-của dòng Pseudomonas stutzeri phân lập Bảng Các dịng sử dụng thí nghiệm xử lý đạm nước ao nuôi cá tra Bảng Ảnh hưởng vi khuẩn khử đạm lên pH nước ao nuôi cá tra Bảng Ảnh hưởng vi khuẩn khử đạm lên hàm lượng ammonium (mg/L) nước ao nuôi cá tra Bảng 10 Ảnh hưởng vi khuẩn khử đạm lên hàm lượng nitrat (mg/L) nước ao nuôi cá tra Bảng 11 Ảnh hưởng vi khuẩn khử đạm lên hàm lượng nitrit nước ao nuôi cá tra Bảng 12 Ảnh hưởng vi khuẩn khử đạm lên COD (mgO2/L) nước ao nuôi cá tra Trang 16 16 18 22 23 25 26 26 27 28 29 30 vii DANH SÁCH HÌNH Hình Hình Chu trình nitrogen (Nguồn: Tortora et al., 2004) Hình 2: Một số dạng khuẩn lạc vi khuẩn Pseudomonas stutzeri (Lalucat et al., 2006) Hình Tổ chức gen tham gia vào trình khử nitrate vi khuẩn Pseudomonas stutzeri (Lalucat et al., 2006) Hình Sơ đồ bố trí thí nghiệm khử đạm dịng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri Hình Dịng vi khuẩn CP1 chụp kính hiển vi điện tử quét độ phóng đại 10.000 lần Hình Dịng vi khuẩn CM8 chụp kính hiển vi điện tử quét độ phóng đại 11.000 lần Hình Dịng vi khuẩn PT5 chụp kính hiển vi điện tử quét độ phóng đại 7.000 lần Hình Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi tổng 16f27 16r1488 25 dịng vi khuẩn phân lập Hình Kết điện di sản phẩm PCR cặp mồi fps158 rps743 Hình 10 Tương đồng dịng CM8 với vi khuẩn Pseudomonas stutzeri Hình 11 So sánh trình tự dịng CM8 với vi khuẩn Pseudomonas stutzeri Hình 12 Tương đồng dòng PT5 với vi khuẩn Pseudomonas stutzeri dịng P4 Hình 13 So sánh trình tự dịng PT5 với vi khuẩn Pseudomonas stutzeri dịng P4 Hình 14 Diễn biến pH nghiệm thức trình xử lý Hình 15 Sự thay đổi nồng độ NH4+ nghiệm thức q trình thí nghiệm Hình 16 Sự thay đổi nồng độ NO3- nghiệm thức q trình thí nghiệm Hình 17 Sự thay đổi nồng độ NO2- nghiệm thức q trình thí nghiệm Hình 18 Sự thay đổi COD nghiệm thức q trình thí nghiệm Trang 17 19 20 20 21 22 23 23 24 24 26 27 28 29 30 viii PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG KHỬ ĐẠM CỦA VI KHUẨN Pseudomonas stutzeri TRONG NƯỚC THẢI AO NUÔI CÁ TRA Trịnh Hoài Vũ1 ABSTRACT Twenty-one denitrifying bacterial isolates were isolated from the sediment and wastewater of catfish ponds in An Giang province Among them, 11/21 isolates were determined as Pseudomonas stutzeri by using PCR technique with specific fps158 and rps743 primers The result of DNA sequence showed that two isolates (CM8, PT5) had the identity with standard Pseudomonas stutzeri were 99% Most of them could grow on Minimal medium complemented with various concentration of NH4+, NO3- NO2- Especially, many isolates such as CP1, CM8, PT3 and PT5 could develop well in 500 mM NH4+, NO3and 100 mM NO2- concentration Key words: Pseudomonas stutzeri, denitrifying bacteria, catfish pond’s wastewater, PCR technique GIỚI THIỆU Có nhiều nghiên cứu vấn đề xử lý hợp chất chứa đạm nước thải, số biện pháp xử lý vi sinh vật ý đặc biệt hiệu xử lý cao tốn chi phí Trong xử lý nước thải, loại thải hợp chất đạm thực kết hợp q trình nitrat hóa q trình khử nitrat (khử nitrat thành N2O N2) Điều đòi hỏi hoạt động phối hợp nối tiếp nhóm vi sinh vật khác nhau, đặc biệt vi khuẩn nitrat hóa vi khuẩn khử nitrat (Lee et al., 2002) Một số dịng vi khuẩn tham gia chu trình nitơ Pseudomonas stutzeri có khả khử đạm (denitrifying bacteria) dạng thức ăn thừa phân giúp giảm lượng nitrat, ammonium gây ô nhiễm nguồn nước, cải thiện chất lượng nước ao ni, góp phần thực ni thủy sản bền vững 1.1 Vi khuẩn Pseudomonas stutzeri Loài vi khuẩn Pseudomonas stutzeri phân lập xác định lần Burri Stutzer vào 1895 với tên gọi Bacillus denitrificans II, sau van Niel Allen xác định tên thức Pseudomonas stutzeri (van Niel Allen, 1952) Đây lồi vi khuẩn Gram âm, hình que, kích thước khoảng 1,4-2,8 x 0,7-0,8, di chuyển chiên mao đầu Các dòng khuẩn lạc phân lập đến dính chặt, có màu nâu tối có đặc điểm bên nhăn nheo, đặc điểm thường bị sau vài lần cấy truyền mơi trường thí nghiệm (Garrity, 2005) Các khuẩn lạc cuối trở nên trơn láng, đặc màu Trong số đặc điểm để nhận diện P stutzeri khả khử nitrat mạnh, xuất khuẩn lạc việc sử dụng tinh bột làm nguồn carbon lượng Có thể sinh trưởng nhiệt độ từ 4-45oC (Lalucat et al., 2006) Nhiệt độ tối thích khoảng 35oC (van Niel Allen, 1952) pH tối thích khoảng sinh trưởng pH (van Niel Allen, 1952) Hàm lượng G-C DNA từ 60,6-66,3 (Garrity, 2005) Dòng mẫu loài là: AB 201, ATCC 17588, CCUG 11256, DSM 5190 đăng ký GenBank PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phương tiện nghiên cứu Môi trường Minimal (Sikorski et al., 2002) gồm: sodium succinate (8,1 g/l); KH2PO4 (340 mg/l); K2HPO4 (435 mg/l); vi lượng (1 ml/l); stock gồm 10 mM NaNO3, 10 mM NH4Cl, 100 mM artificial seawater (SW) (gồm NaHCO3 [0,11 g/l], MgSO4 7H2O [10,5 g/l], NaCl [24 g/l] ); KOH 4M ( 50 ml/l); pH 6,8 điều chỉnh KOH 0,1M; agar (2 %) Môi trường Luria Bertani (LB) (Bennasar et al., 1998): Bacto yeast extract (YE) (5 g/l); Bacto tryptone (10 g/l); NaCl (10 g/l); cycloheximide (50 mg) dùng để nhân mật số vi khuẩn chuẩn bị cho việc trích DNA 2.2 Phuơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Thời gian địa điểm thực thí nghiệm Thí nghiệm phân lập xác định đặc tính P stutzeri đuợc thực phịng thí nghiệm mơn Cơng nghệ Sinh học, khoa Nông nghiệp – TNTN, trường đại học An Giang; thí nghiệm nhận diện vi khuẩn phương pháp sinh học phân tử thực phịng thí nghiệm Sinh học phân tử, viện Nghiên cứu phát triển Công nghệ sinh học, trường đại học Ths GV Bộ môn CNSH, khoa Nông nghiệp - TNTN, Đại học An Giang; Email: thvu@agu.edu.vn Cần Thơ; thí nghiệm áp dụng xử lý khử đạm thực nước thải ao nuôi cá Tra 34 tháng tuổi từ tháng 2/ 2009 - 12/2009 2.2.2 Thu mẫu phân lập vi khuẩn Mẫu bùn đáy ao mẫu nước thải (được thu thập riêng biệt) ao nuôi cá Tra 3-4 tháng tuổi huyện Châu Phú (xã Khánh Hịa), huyện Phú Tân (xã Phú Bình) huyện Chợ Mới (xã Long Giang) Mỗi xã thu lấy mẫu để phân lập vi khuẩn 2.2.3 Nhận diện vi khuẩn P stutzeri Bảng Trình tự primer dùng nhận diện vi khuẩn khử đạm P stutzeri Primer Trình tự primer (5’ – 3’) Kích thước 1.456 bp 16F27 AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 16R1488 CGG TTA CCT TGT TAG GAC TTC ACC fps 158 GTG GGG GAC AAC GTT TC 625 bp rps 743 CTA CGA TCG GTT TTA TGG 2.2.4 Đánh giá khả khử dòng vi khuẩn P stutzeri Đánh giá khả khử nitrat dòng vi khuẩn P stutzeri vừa phân lập dựa phát triển dịng vi khuẩn mơi trường Minimal đặc có bổ sung NH4+, NO3- nồng độ tăng dần từ 10 đến 500 mM NO2- nồng độ 10, 100 mM 2.2.5 Giải trình tự dịng vi khuẩn có khả khử nitrat tốt Sau xác định khả khử nitrat môi trường Minimal, chọn dịng vi khuẩn có khả khử mạnh đem giải trình tự, sau tìm GeneBank NCBI với phần mềm BLASTN để xác định xác dòng vi khuẩn P stutzeri 2.2.6 Thử nghiệm khả khử đạm vi khuẩn P stutzeri điều kiện thực tế Sử dụng dịng vi khuẩn có khả khử nitrat mạnh để bố trí thí nghiệm Thí nghiệm bố trí theo thể thức hồn tồn ngẫu nhiên, lần lặp lại với nghiệm thức: - Nghiệm thức 1: dòng vi khuẩn (D1) tỉ lệ 1% (v/v) - Nghiệm thức 2: dòng vi khuẩn (D2) tỉ lệ 1% (v/v) - Nghiệm thức 3: dòng vi khuẩn (D3) tỉ lệ 1% (v/v) - Nghiệm thức 4: đối chứng (ĐC) (không xử lý với vi khuẩn) Các nghiệm thức với dòng vi khuẩn chọn chủng hoàn toàn ngẫu nhiên vào thùng nhựa, thùng chứa 100 lít nước thải từ ao nuôi cá Tra 3-4 tháng tuổi, để thống khí điều kiện tự nhiên, định kỳ 24, 48, 72, 96 lấy mẫu (mỗi mẫu lít nước thải) để phân tích tiêu: NH4+, NO2-, NO3- so sánh với TCVN 5942:1995 Số liệu thống kê chương trình Minitab ver.14, dùng kiểm định LSD để so sánh trung bình nghiệm thức KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết phân lập vi khuẩn khử đạm nước thải ao nuôi cá tra Tổng cộng có mẫu (bùn nước) thu ao nuôi cá tra ba huyện Châu Phú, Phú Tân Chợ Mới Sử dụng môi trường Minimal (pH = 6,8) chuyên dùng để phân lập nuôi cấy vi khuẩn khử đạm phân lập tổng cộng 21 dịng vi khuẩn có khả loài P stutzeri để tiến hành bước nhận diện Về hình dạng khuẩn lạc: 17/21 dịng vi khuẩn phân lập có hình trịn (80,95%) 4/21 dịng có hình dạng khơng Về màu sắc khuẩn lạc: có 12/21 (57,14%) khuẩn lạc màu trắng đục, số khuẩn lạc có màu trắng sữa, vàng nhạt Về đặc điểm màu sắc khuẩn lạc, trình phân lập có có biến đổi màu sắc khuẩn lạc trình phân lập: thời kỳ đầu phân lập số khuẩn lạc có màu tối sau vài lần cấy truyền, khuẩn lạc bị màu có màu nhạt hay chuyển sang màu trắng đục Điều phù hợp với mô tả van Niel Allen (1952), Garrity et al (2005) khuẩn lạc bị màu sau vài lần cấy truyền Về đặc điểm hình dạng tế bào vi khuẩn: 19/21 dịng vi khuẩn có que ngắn (chiếm 90,48%), đa số có khả chuyển động (20/21 dịng chiếm 95,24%) Điều đa số dòng vi khuẩn phân lập có chiên mao Kết phù hợp với mơ tả van Niel Allen (1952), Garrity et al (2005) Lalucat et al (2006) vi khuẩn P stutzeri chuyển động nhờ vào chiên mao gắn đầu Sau phân lập, số dòng 3.4 Khả khử nitrate, nitrite oxid hóa ammonium dòng Pseudomonas stutzeri Các dòng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri nhận diện xác cặp mồi đặc hiệu fps158 rps743 tiếp tục xác định khả khử đạm phương pháp kiểm tra đĩa petri chứa môi trường Minimal đặc bổ sung NH4+, NO3- NO2ở nồng độ khác Trên môi trường Minimal đặc có bổ sung bổ sung NH4+, NO3- nồng độ 10 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM, 500 mM NO2- nồng độ 10 mM, 100mM cho thấy: dòng Pseudomonas stutzeri phân lập có khả phát triển Trong dịng CP1, CM8, PT3 PT5 có khả phát triển tốt nồng độ NH4+, NO3- thử nghiệm 500 mM, nồng độ NO2- thử nghiệm 100 mM (Bảng 6) Kết cho thấy dịng Pseudomonas stutzeri phân lập có khả khử nitrate, nitrite oxid hóa ammonium Kết phù hợp với kết Cartson et al (1983), Su et al (2001), Phan Trường Khanh (2007), Nguyễn Thành Nhân (2008), Huỳnh Thị Cẩm Tú (2009), Nguyễn Thị Thủy Trinh (2009) Nguyễn Thị Ngọc Hà (2009) Bảng Khả phát triển môi trường Minimal có bổ sung NH4+, NO3- NO2của dịng Pseudomonas stutzeri phân lập STT Dòng vi khuẩn CP1 CP2 CP5 CM1 CM3 CM5 10 CM7 CM8 PT1 PT3 NH 4+ (500 mM) ++++ ++ + ++ ++ +++ NO3− (500 mM) +++ + + ++ ++ NO2− (100 mM) + + + ++++ + ++++ + +++ +++ + + 11 PT5 ++++ ++++ + (-) Không phát triển, (+) Yếu, (++) Khá, (+++) Tốt, (++++) Rất tốt 3.5 Thí nghiệm khả khử nitrate, nitrite dòng Pseudomonas stutzeri nước thải ao nuôi cá tra Sau xác định khả khử nitrat, nitrit dòng vi khuẩn nhận diện xác vi khuẩn Pseudomonas stutzeri Tiếp tục chọn dòng vi khuẩn có khả phát triển tốt đĩa petri để tiến hành xác định khả khử đạm chúng nước thải ao nuôi cá Danh sách dịng trình bày Bảng 7: 25 Bảng Các dịng sử dụng thí nghiệm xử lý đạm nước ao nuôi cá tra STT Dòng vi khuẩn Dòng CP1 Dòng CM8 Dòng PT5 Nguồn gốc Châu Phú Chợ Mới Phú Tân 3.5.1 pH Bảng Ảnh hưởng vi khuẩn khử đạm lên pH nước ao nuôi cá tra 6,89 6,89 6,89 6,89 24 7,52 7,33 7,28 7,44 48 7,33 7,59 7,58 7,31 72 7,55 8,44 8,26 7,65 96 7,36 7,84 7,87 7,50 pH Nghiệm thức Đối chứng Dịng CP1 Dịng CM8 Dịng PT5 Hình 14 Diễn biến pH nghiệm thức trình xử lý Kết thí nghiệm cho thấy diễn biến nồng độ pH nước thí nghiệm tương đối ổn định (Hình 14) Trong tất nghiệm thức pH cao 8,44 nghiệm thức sử dụng dòng vi khuẩn CP1 vào thời điểm 72 sau xử lý Theo Trương Quốc Phú et al (2006), nuôi trồng thủy sản, nồng độ pH thích hợp cho lồi tơm, cá phát triển Nhìn chung thí nghiệm pH nước thay đổi từ 6,89-8,44 nằm giới hạn cho phép TCVN 5942-95 - Chất lượng nước Tiêu chuẩn chất lượng nước mặt (mức B – Dùng cho mục đích giao thông thuỷ, tưới tiêu, bơi lội, nuôi thuỷ sản, trồng trọt ) pH = 5,5 – theo Boyd (1998) giới hạn pH thích hợp cho ni trồng thủy sản 6,5 - Nước có pH từ 6,8 - thích hợp cho hầu hết lồi cá nuôi (Nguyễn Văn Bé, 1995) 3.5.2 Ammonium (NH4+) Hàm lượng NH4+ lúc bắt đầu thí nghiệm 10,513 mg/l Bắt đầu sau 24 có khác biệt nghiệm thức sử dụng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri so với đối chứng không xử lý Sau 48, 72 96 khác biệt suy trì suốt q trình thí nghiệm 96 khơng có khác biệt nghiệm thức xử lý với vi khuẩn Pseudomonas stutzeri với (Bảng 9) Hình 16 cho thấy hàm lượng NH4+ giảm dần theo thời gian ba dịng vi khuẩn có khả oxy hóa ammonium làm giảm đáng kể lượng NH4+ với hiệu suất cao Dòng CM8 sau 26 kết thúc 96 thí nghiệm, hàm lượng NH4+ cịn lại 1,39 mg/l, hiệu suất oxy hóa 86,77%; dòng CP1 81,16%; dòng PT5 77,35% Kết tương tự thí nghiệm Su et al (2001), thực với vi khuẩn P stutzeri dịng NS-2 ni cấy mơi trường BM/NO3 Theo TCVN 5942-95 - Chất lượng nước - Tiêu chuẩn chất lượng nước mặt, giá trị cho phép hàm lượng ammonium cột B mg/L, kết thí nghiệm cho thấy hàm lượng ammonium sau xử lý đạt mức tương đương mg/L, gần đạt yêu cầu chuẩn đầu nước thải công nghiệp xả vào nguồn tiếp nhận nguồn nước khơng dùng cho mục đích cấp nước sinh hoạt Bảng Ảnh hưởng vi khuẩn khử đạm lên hàm lượng ammonium (mg/L) nước ao nuôi cá tra Nghiệm thức Đối chứng Dòng CP1 Dòng CM8 Dòng PT5 F CV (%) 10,51 10,51 10,51 10,51 - 24 8,73 a 3,30 b 2,86 b 3,96 b ** 11,74 48 8,07 a 2,35 b 2,42 b 2,82 b ** 19,77 72 7,99 a 1,91 b 1,61 b 2,29 b ** 12,54 96 8,87 a 1,98 b 1,39 b 2,38 b ** 10,42 Hàm lượng NH4+ (mg/l) Ghi chú: Trong cột, số có chữ theo sau khác biệt khơng ý nghĩa với qua phân tích thống kê mức ý nghĩa 1% Hình 15 Sự thay đổi nồng độ NH4+ nghiệm thức q trình thí nghiệm 3.5.3 Nitrat (NO3-) Theo Trương Quốc Phú et al (2006) Boyd (1998), nồng độ nitrat thích hợp cho ao nuôi cá từ 0,1 – 10 mg/L, nồng độ nitrat cao khơng gây độc cho cá làm thực vật phù du nở hoa gây biến đổi chất lượng nước khơng có lợi cho tôm, cá nuôi Nồng độ NO3- > 50 mg/L gây sốc nghiêm trọng cho tôm cá (Phạm Văn Ty et al., 2007) 27 Bảng 10 Ảnh hưởng vi khuẩn khử đạm lên hàm lượng nitrat (mg/L) nước ao ni cá tra Nghiệm thức Đối chứng Dịng CP1 Dòng CM8 Dòng PT5 F CV (%) 2,91 2,91 2,91 2,91 - 24 4,00 a 2,91 b 2,97 b 3,55 ab ** 9,79 48 4,96 a 2,24 b 2,84 b 2,79 b ** 12,93 72 4,91 a 2,63 b 2,77 b 2,85 b ** 10,65 96 3,71 a 2,26 b 2,29 b 1,77 b ** 13,06 Hàm lượng NO3- (mg/l) Ghi chú: Trong cột, số có chữ theo sau khác biệt khơng ý nghĩa với qua phân tích thống kê mức ý nghĩa 1% Hình 16 Sự thay đổi nồng độ NO3- nghiệm thức q trình thí nghiệm Hàm lượng NO3- lúc bắt đầu thí nghiệm 2,91 mg/l Sau 96 thí nghiệm có khác biệt nghiệm thức sử dụng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri so với đối chứng không xử lý suốt q trình thí nghiệm 96 khơng có khác biệt nghiệm thức xử lý với vi khuẩn Pseudomonas stutzeri với (Bảng 10) Hình 16 cho thấy hàm lượng NO3- giảm dần theo thời gian ba dịng vi khuẩn có khả oxy hóa NO3- làm giảm đáng kể lượng NO3- với hiệu suất cao Dòng PT5 sau kết thúc 96 thí nghiệm, hàm lượng NO3- cịn lại 1,77 mg/l, hiệu suất oxy hóa 39,18%; dòng CP1 2,26 mg/l (hiệu suất 22,34%), dòng CM8 2,29 mg/l thấp (hiệu suất 21,31%) khác biệt không ý nghĩa so với nghiệm thức lại Theo TCVN 5942-1995 quy định giới hạn thông số nồng độ cho phép chất nhiễm nước mặt nồng độ NO3- < 15 mg/L (mức B – Dùng cho mục đích giao thông thuỷ, tưới tiêu, bơi lội, nuôi thuỷ sản, trồng trọt ) Như vậy, nồng độ NO3- đo nghiệm thức mức thấp nên chưa ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển thủy sinh vật nước Tuy nhiên, nồng độ nitrat khơng giảm nhiều sau ngày thí nghiệm có lẽ chuyển hóa ammonium nitrit sang nitrat nguồn nước bị nhiễm, NO3- sản phẩm cuối q trình oxy hóa NH4+ (Lê Văn Cát et al., 2006) 28 3.5.4 Nitrit (NO2-) Hàm lượng NO2- lúc bắt đầu thí nghiệm 1,43 mg/l Bắt đầu sau 24 có khác biệt nghiệm thức sử dụng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri so với đối chứng không xử lý Sau 48, 72 96 khác biệt suy trì sau 96 có khác biệt nghiệm thức xử lý với vi khuẩn Pseudomonas stutzeri với nhau, hai dòng CP1 CM8 đạt hiệu suất xử lý cao khác biệt có ý nghĩa với dịng vi khuẩn PT5 Dịng CM8 sau kết thúc 96 thí nghiệm, hàm lượng NO2- lại 0,02 mg/l, hiệu suất oxy hóa 98,60%; dịng CP1 97,90% so với dịng PT5 90,21% (Bảng 11) Hình 18 cho thấy hàm lượng NO2- giảm dần theo thời gian ba dịng vi khuẩn có khả oxy hóa nitrit làm giảm đáng kể lượng NO2- với hiệu suất cao Bảng 11 Ảnh hưởng vi khuẩn khử đạm lên hàm lượng nitrit nước ao nuôi cá tra Nghiệm thức Đối chứng Dòng CP1 Dòng CM8 Dòng PT5 F CV (%) 1,43 1,43 1,43 1,43 - 24 1,78 a 0,97 b 1,17 b 1,08 b ** 6,80 48 1,50 a 0,05 c 0,04 c 0,32 b ** 16,00 72 0,69 a 0,08 bc 0,03 c 0,15 b ** 14,49 96 0,66 a 0,03 c 0,02 c 0,14 b ** 14,92 Hàm lượng NO2- (mg/l) Ghi chú: Trong cột, số có chữ theo sau khác biệt khơng ý nghĩa với qua phân tích thống kê mức ý nghĩa 1% Hình 17 Sự thay đổi nồng độ NO2− nghiệm thức trình thí nghiệm Theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5942 – 1995 (mức B – Dùng cho mục đích giao thơng thuỷ, tưới tiêu, bơi lội, nuôi thuỷ sản, trồng trọt ) chất lượng nước mặt quy định nồng độ NO2- phải mức 0,05 mg/L, theo Boyd (1998) nồng độ NO2< 0,3 mg/L, Trương Quốc Phú et al (2006) cho biết sinh trưởng tôm xanh giảm đáng kể nồng độ nitrit 1,8 6,2 mg/L theo Nguyễn Thanh Phương et al (2007) nồng độ NO2- ao nuôi thủy sản phải nhỏ mg/L Kết thí nghiệm cho thấy hai dịng CP1, CM8 có khả xử lý tốt hàm lượng nitrit nước sau xử lý đạt mức tiêu chuẩn cho phép theo TCVN 5942-1995 29 3.5.5 Nhu cầu oxy hóa học - COD (Chemical Oxygen Demand) Biến động COD nước thải ao nuôi cá tra sau 96 bố trí thí nghiệm nghiệm thức trình bày Bảng 14 Bảng 12 Ảnh hưởng vi khuẩn khử đạm lên COD (mgO2/L) nước ao nuôi cá tra Nghiệm thức Đối chứng Dòng CP1 Dòng CM8 Dòng PT5 F CV (%) 73 73 73 73 - 24 62 c 83 ab 93 a 73 bc ** 5,36 48 65 b 84 a 93 a 70 b ** 4,23 72 44 b 83 a 91 a 48 b ** 8,07 96 49 b 75 a 84 a 48 b ** 6,24 COD (mgO2/L) Ghi chú: Trong cột, số có chữ theo sau khác biệt khơng ý nghĩa với qua phân tích thống kê mức ý nghĩa 1% Hình 18 Sự thay đổi COD nghiệm thức q trình thí nghiệm Theo Dương Nhật Long (2003) COD thích hợp cho ao cá thâm canh 10 – 20 mgO2/L Theo Lê Như Xuân ctv (1994) COD thích hợp cho ao ni cá 15 – 30 mg O2/L Theo TCVN 5942-1995 quy định giới hạn thông số nồng độ cho phép chất nhiễm nước mặt nồng độ COD < 35 mg/L (mức B – Dùng cho mục đích giao thơng thuỷ, tưới tiêu, bơi lội, ni thuỷ sản, trồng trọt ) mức 35 < COD < 100 cao giới hạn cho phép Nghiệm thức sử dụng vi khuẩn CP1 CM8 có COD cao nghiệm thức sử dụng dòng PT5 đối chứng COD nước nghiệm thức nằm giới hạn cho phép Sự thay đổi COD nghiệm thức trình phân hủy chất hữu nước vi sinh vật làm cho COD nước biến đổi theo (Hình 18) 30 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận - Đề tài phân lập 21 dịng vi khuẩn có khả phát triển mơi trường Minimal chuyên dùng cho vi khuẩn khử đạm từ ao ni cá tra Trong đó, có 11/21 dịng nhận diện xác vi khuẩn Pseudomonas stutzeri phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu fps158 rps743 Kết giải trình tự cho thấy dịng CM8 PT5 có mức độ tương đồng với vi khuẩn Pseudomonas stutzeri 99% - Đa số dịng Pseudomonas stutzeri phân lập có khả phát triển mơi trường Minimal có bổ sung NH4+, NO3- NO2- Trong đó, dịng CP1, CM8, PT3, PT5 có khả phát triển tốt nồng độ NH4+, NO3- lên đến 500 mM môi trường có bổ sung NO2- lên đến 100 mM - Ba dòng vi khuẩn CP1, CM8, PT5 sử dụng thí nghiệm nước thải ao ni cá tra có khả oxy hóa NH4+, NO3- NO2-, làm giảm đáng kể lượng chất với hiệu suất cao khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng không xử lý Kết đề tài cho thấy khả loài vi khuẩn Pseudomonas stutzeri việc ứng dụng để khử đạm từ nước thải ao nuôi cá tra mở hướng ứng dụng để xử lý loại nước ô nhiễm nitrat khác Đề nghị - Khảo sát khả khử đạm dịng vi khuẩn có khả phát triển mơi trường có bổ sung NH4+, NO3- NO2- cao nước thải ao nuôi cá tra mức độ lớn loại nước thải ô nhiễm đạm khác - Tiếp tục phân lập nhận diện dịng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri có khả khử đạm hiệu hơn, phát triển thành chế phẩm sinh học xử lý môi trường nuôi thủy sản bị nhiễm ammonia, nitrate nhằm đạt kết tốt 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO Baggi, G., P Barbieri, E Galli, and S Tollari 1987 Isolation of a Pseudomonas stutzeri strain that degrades o-xylene Appl Environ Microbiol 53: 2129-2132 Bộ Khoa học Công nghệ Môi trường 2002 TCVN 5942 – 1995 - Chất lượng nước – Tiêu chuẩn chất lượng nước mặt Kèm theo định số 35/2002/QĐBKHCN&MT ngày 25/6/2002 Bennasar, A., R Rossello´-Mora, J Lalucat, and E R B Moore 1996 16S rRNA gene sequence analysis relative to genomovars of Pseudomonas stutzeri and proposal of Pseudomonas balearica sp nov Int J Syst Bacteriol 46: 200–205 Bennasar, A., C Guasp, M Tesar, and J Lalucat 1998 Genetic relationships among Pseudomonas stutzeri strains based on molecular typing methods, J App Microbiol 85: 643- 656 Bennasar, A., C Guasp and J Lalucat 1998 Molecular methods for the detection and identification of Pseudomonas stutzeri in pure culture and environmental samples, Microb Ecol 35: 22- 33 Bitton G 2005 Wastewater Microbiology, 3rd Edition John Wiley and Sons, Inc New Jersey pp 75-89 Braun, C., and W G Zumft 1992 The structural genes of the nitric oxide reductase complex from Pseudomonas stutzeri are part of a 30-kilobase gene cluster for denitrification J Bacteriol 174: 2394-2397 Carlson, C A and J L Ingraham 1983 Comparison of Denitrification by Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas aeruginosa, and Paracoccus denitrificans Appl Environ Microbiol 45 (4): 1247-1253 Carter, J P., Y H Hsiao, S Spiro and D J Richardson 1995 Soil and sediment bacteria capable of aerobic nitrate respiration Appl Environ Microbiol 61: 28522858 Dijk, J A., A J M Stams, G Schraa, H Ballerstedt, J A M de Bont, J Gerritse 2003 Anaerobic oxidation of 2-chloroethanol under denitrifying conditions by Pseudomonas stutzeri strain JJ Appl Microbiol Biotechnol 63: 68-74 Dương Nhựt Long 2003 Giáo trình kỹ thuật ni thủy sản nước Khoa Thủy Sản, trường Đại học Cần Thơ Garrity, G M., J A Bell and T Lilburn 2005 Order IX Pseudomonadales, Family I Pseudomonadaceae, Genus I Pseudomonas In Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, 2nd Edition, Volume The Proteobacteria, Part B The Gammaproteobacteria Springer, New York pp 323-378 Ginard, M., J Lalucat, B Tümmler, and U Römling 1997 Genome organization of Pseudomonas stutzeri and resulting taxonomic and evolutionary considerations Int J Syst Bacteriol 47: 132-143 Hallin, S., and P.- E Lindgren 1999 PCR detection of genes encoding nitrite reductase in denitrifying bacteria, Appl Environ Microbiol 65 (4): 1652- 1657 32 Henry, S., D Bru, B Stres, S Hallet, and L Philippot 2006 Quantitative detection of the nosZ gene, encoding nitrous oxide reductase, and comparison of the abundances of 16S rRNA, narG, nirK, and nosZ genes in soils, Appl Environ Microbiol 72 (8): 5181-5189 Heylen, K., B Vanparys, L Wittebolle, W Verstraete, N Boon, and P De Vos 2006 Cultivation of denitrifying bacteria: Optimization of isolation conditions and diversity study Appl Environ Microbiol 72 (4): 2637- 2643 Huỳnh Thị Cẩm Tú 2009 Phân lập vi khuẩn khử đạm Pseudomonas stutzeri ao nuôi tôm sú Bạc Liêu Luận văn thạc sĩ khoa học ngành Công nghệ sinh học, trường Đại học Cần Thơ Knowles, R 1982 Denitrification Microbiol Rev 46: 43-70 Lalucat, J., A Bennasar, R Bosch, E García-Valdés, and N J Palleroni 2006 Biology of Pseudomonas stutzeri Microbiol Mol Biol Rev 70 (2): 510-547 Lee H W., S Y Lee, J W Lee, J B Park, E S Choi, and Y K Park 2002 Molecular characterization of microbial community in nitrate-removing activated sludge, FEMS Microb Ecol 41: 85-94 Lê Thị Ngọc Hà 2009 Phân lập vi khuẩn Pseudomonas stutzeri nước thải ao nuôi cá tra tỉnh An Giang Luận văn thạc sĩ khoa học ngành Sinh thái học, trường Đại học Cần Thơ Nguyễn Đức Lượng Nguyễn Thị Thủy Tiên 2003 Công nghệ sinh học môi trường, Tập 1: Công nghệ xử lý nước thải Nxb Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh TP Hồ Chí Minh Nguyễn Thành Nhân 2008 Phân lập nhận diện số dòng vi khuẩn khử đạm từ chất thải trại chăn nuôi Luận văn thạc sĩ khoa học ngành Công nghệ sinh học, trường Đại học Cần Thơ Nguyễn Thanh Phương ctv 2007 Quan trắc môi trường xác định tác nhân gây bệnh cá da trơn (Tra – Pangasius hypophthalmus basa – P Bocourti) tôm xanh (Macrobrachium rosenbergii) tỉnh An Giang Báo cáo tổng kết đề tài Nguyễn Thị Thủy Trinh 2009 Phân lập vi khuẩn Pseudomonas stutzeri nước thải ao nuôi tỉnh Bến Tre Luận văn thạc sĩ khoa học ngành Công nghệ sinh học, trường Đại học Cần Thơ Nguyễn Trần Hải Bằng 2008 Nhận diện gen nosZ, cd1-nir vi khuẩn Pseudomonas stutzeri Luận văn tốt nghiệp Đại học chuyên ngành Công nghệ sinh học, trường Đại học Cần Thơ Patureau, D., J Davison, N Bernet, and R Moletta 1994 Denitrification under various aeration conditions in Comamonas sp., strain SGLY2 FEMS Microbiol Ecol 14: 71-78 Phan Trường Khanh 2007 Phân lập vi khuẩn Pseudomonas stutzeri đất đồng sông Cửu Long ứng dụng xử lý ammonia nước điều kiện phịng thí nghiệm Luận văn thạc sĩ Khoa học môi trường, trường Đại học Cần Thơ Rossello´-Mora, R A., J Lalucat, W Dott and P Kaămpfer 1994 Biochemical and chemotaxonomic characterization of Pseudomonas stutzeri genomovars J Appl Bacteriol 76: 226-233 33 Shintani, M., H Nojiri, T Yoshida, H Habe and T Omori 2003 Carbazole/dioxindegrading car gene cluster is located on the chromosome of Pseudomonas stutzeri strain OM1 in a form different from the simple transposition of Tn4676 Biotechnol Lett 25: 1255-1261 Sikorski, J., N Teschner, and W Wackernagel 2002 Highly different levels of natural transformation are associated with genomic subgroups within a local population of Pseudomonas stutzeri from soil, Appl Environ Microbiol 68 (2): 865- 873 Sikorski, J., J Lalucat and W Wackernagel 2005 Genomovars 11 to 18 of Pseudomonas stutzeri, identified among isolates from soil and marine sediment Int J Syst Evol Microbiol 55: 1767-1770 Spieck, E and E Bock 2005 The Lithoautotrophic Nitrite-Oxidizing Bacteria In Brenner, Krieg, Staley, and Garrity (Editors) Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, 2nd Edition, Volume The Proteobacteria, Part A Introductory Essays Springer, New York pp 149-154 Su, J J., J Lin, B Y Liu, and J B Yang 2001 Isolation of an aerobic denitrifying bacterial strain NS-2 from the activated sludge of piggery wastewater treatment systems in Taiwan possessing denitrification under 92% oxygen atmosphere J Appl Microbiol 91: 853-860 Tô Thị Lài 2008 Xử lý ammonia nước ao cá tra vi khuẩn Pseudomonas stutzeri qui mơ phịng thí nghiệm Luận văn tốt nghiệp Đại học chuyên ngành Công nghệ sinh học Tổng Cục Thống Kê 2008 Niên giám Thống kê năm 2006 Nxb Thống Kê Hà Nội Trương Quốc Phú Vũ Ngọc Út 2006 Bài giảng quản lý chất lượng nước Khoa Thủy sản Đại học Cần Thơ van Niel, C B., and M B Allen 1952 A note on of Pseudomonas stutzeri Bacteriol 64: 413- 422 Wilson, K 1997 Preparation of genomic DNA from bacteria In: Ausubel FM, Brent R, Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., Struhl, K Current protocols in molecular biology John Wiley & Sons, New York: 2.4.1.–2.4.5 Zumft, W.G 1997 Cell biology and molecular basis of denitrification, Microbiol Mol Biol Rev 61 (4): 533- 616 34 PHỤ CHƯƠNG CHẤT LƯỢNG NƯỚC – TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG NƯỚC MẶT (TCVN 5942-95) TT Thông số Đơn vị 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 pH BOD5 (200C) COD Oxy hoà tan Chất rắn lơ lửng Asen Bari Cadimi Chì Crom (VI) Crom (III) Đồng Kẽm Mangan Niken Sắt Thuỷ ngân Thiếc Amoniac ( tính theo N) Florua Nitrat ( tính theo N) Nitrit ( tính theo N) Xianua Phenola (tổng số) Dầu, mỡ Chất tẩy rửa Coliform Tổng hoá chất bảo vệ thực vật (trừ DDT) DDT Tổng hoạt độ phóng xạ α Tổng hoạt độ phóng xạ β mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l mg/l MPN/100 ml mg/l 29 30 31 mg/l Bq/l Bq/l Giá trị giới hạn A B đến 8,5 5,5 đến