Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn bacillus sp ở bãi rác bình đức TP long xuyên t an giang đề tài nghiên cứu khoa học cấp trường

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA SƯ PHẠM BỘ MÔN SINH ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN BACILLUS sp Ở BÃI RÁC BÌNH ĐỨC, TP LONG XUYÊN, T AN GIANG CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: NGUYỄN THANH ĐÀO NĂM 2011 TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA SƯ PHẠM BỘ MÔN SINH ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN BACILLUS sp Ở BÃI RÁC BÌNH ĐỨC, TP LONG XUYÊN, T AN GIANG BAN GIÁM HIỆU HOÀNG XUÂN QUẢNG LÃNH ĐẠO ĐƠN VỊ CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI THỰC HIỆN ĐỀ TÀI TRẦN THỂ NĂM 2011 NGUYỄN THANH ĐÀO MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU Chương – TỔNG QUAN TÀI LIỆU I Rác thải Phân loại Thành phần Hiện trạng xử lý chất thải rắn II Vi khuẩn Bacillus sp Phân loại Đặc điểm chung Bacillus sp Ứng dụng enzyme vi khuẩn Bacillus sp Ứng dụng tác hại vi khuẩn Bacillus sp III Enzyme vi sinh vật 10 Catalase 10 1.1 Giới thiệu catalase 10 1.2 Ứng dụng enzyme catalase 10 Amylase 10 2.1 Giới thiệu amylase 10 2.2 Ứng dụng enzyme amylase 11 Protease 11 3.1 Giới thiệu protease 11 3.2 Ứng dụng enzyme protease 11 Chương – VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 13 A Vật liệu 14 I Thiết bị dụng cụ 14 Thiết bị 14 Dụng cụ 14 II Hóa chất mơi trường 14 Hóa chất 14 1.1 Hóa chất kiểm tra khả sinh enzyme catalase 14 1.2 Hóa chất kiểm tra khả sinh enzyme amylase 14 1.3 Hóa chất kiểm tra khả sinh enzyme protease 14 1.4 Hóa chất nhuộm Gram 15 1.5 Hóa chất nhuộm tiên mao (thuốc nhuộm Nishizawa kangen) 15 1.6 Hóa chất nhuộm bào tử 16 Môi trường 16 2.1 Môi trường dinh dưỡng tối thiểu rắn 16 2.2 Môi trường kiểm tra khả sinh enzyme protease 17 III Vật liệu thí nghiệm 17 B Địa điểm thời gian thực đề tài 17 I Địa điểm 17 II Thời gian 17 C Nội dung phương pháp nghiên cứu 17 I Phân lập 17 Pha chế môi trường thạch đĩa thạch nghiêng 17 Thu mẫu 18 Xử lí mẫu 18 Phân lập khiết giống 18 Giữ giống 19 II Tuyển chọn giống Bacillus có khả tổng hợp enzyme tốt 19 Thu nhận chế phẩm enzyme thơ từ phương pháp ni cấy chìm 19 Khả sinh enzyme catalase 19 1.1 Định tính 19 1.2 Định lượng 20 Khả sinh enzyme amylase 20 2.1 Định tính 20 2.2 Định lượng (theo phương pháp Wolhgemuth) 21 Khả sinh enzyme protease 21 3.1 Định tính 21 3.2 Định lượng (theo phương pháp Gross Fuld) 22 III Khảo sát đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa chủng tuyển chọn23 Đặc điểm hình thái 23 1.1 Quan sát đại thể 23 1.2 Quan sát vi thể 23 1.2.1 Hình dạng 23 1.2.2 Nhuộm Gram đo kích thước vi khuẩn 24 1.2.3 Khả di động nhuộm tiên mao 26 1.2.4 Nhuộm bào tử (theo phương pháp Schaffer Fulton) 28 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 28 2.1 Khả sống điều kiện hiếu khí, kị khí 28 2.2 Khả sử dụng số nguồn carbon 29 IV Định danh vi khuẩn 29 Định danh vi khuẩn Test Kit API 50CH 29 1.1 Nguyên tắc 29 1.2 Chuẩn bị 30 1.3 Tiến hành 30 1.4 Kết 30 Định danh vi khuẩn giải trình tự gen 16S rRNA 32 2.1 Nguyên tắc 32 2.2 Tiến hành 33 2.3 Kết 33 Chương – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 I Phân lập 35 II Tuyển chọn giống Bacillus có khả tổng hợp enzyme tốt 37 Khả sinh enzyme catalase chủng C1-1, C8, C6, A2-1, 2, A8-2, A6 A5-2 38 1.1 Định tính 38 1.2 Định lượng 39 Khả sinh enzyme amylase chủng C1-1, C8, C6, A2-1, 2, A8-2, A6 A5-2 40 2.1 Định tính 40 2.2 Định lượng 41 Khả sinh enzyme protease chủng C1-1, C8, C6, A2-1, 2, A8-2, A6 A5-2 42 3.1 Định tính 42 3.2 Định lượng 43 III Khảo sát đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa chủng C1-1 A5-2 45 Đặc điểm hình thái 45 1.1 Quan sát đại thể 45 1.2 Quan sát vi thể 45 1.2.1 Hình dạng 45 1.2.2 Nhuộm Gram đo kích thước vi khuẩn 45 1.2.3 Khả di động nhuộm tiên mao 46 1.2.4 Nhuộm bào tử 47 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 47 2.1 Khả sống điều kiện hiếu khí, kị khí 47 2.2 Khả sử dụng số nguồn carbon 48 III Định danh vi khuẩn 49 Định danh vi khuẩn Test Kit API 50CH 49 Định danh vi khuẩn giải trình tự gene 16S rRNA 50 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC 58 LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc đến: Ban Giám Hiệu, Phòng Quản lý Khoa học Hợp tác Quốc tế, Phòng Kế hoạch Tài vụ trường Đại học An Giang giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho thực nghiên cứu khoa học Quý đồng nghiệp Bộ mơn Sinh - Khoa Sư phạm, Phịng Thí nghiệm - Khoa Nông nghiệp Tài nguyên Thiên nhiên hỗ trợ, động viên giúp đỡ suốt trình thực nghiệm Chị Nguyễn Thị Lan Phương, Cán phòng Quản lý Khoa học Hợp tác Quốc tế người tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi hồn chỉnh đề cương chi tiết đề tài nghiên cứu khoa học Ths Nguyễn Hữu Thanh, Phó Bộ mơn Cơng nghệ Sinh học - Khoa Nông nghiệp Tài nguyên Thiên nhiên khơng có đóng góp chân thành hữu ích cho tơi hồn thiện đề cương chi tiết mà cịn dẫn tận tình hỗ trợ kịp thời suốt q trình tơi thực nghiên cứu khoa học Ths Nguyễn Văn Tâm (nguyên Trưởng Bộ môn Sinh, nghỉ hưu) Ths Nguyễn Bách Thắng (ngun Trưởng Phịng Thí nghiệm Bộ mơn Sinh, Phó trưởng phịng Hành chánh - Tổng hợp) định hướng thực nghiên cứu khoa học Tơi ln biết ơn chân tình gửi lời cảm ơn chân thành đến người thân u tơi – gia đình đồng nghiệp suốt thời gian qua Xin chúc sức khỏe tất quí vị Chủ nhiệm đề tài Nguyễn Thanh Đào TÓM TẮT Rác thải ngày nhiều hiểm họa người gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng Vấn đề xử lý rác thải trở nên thiết thực cấp bách Phân lập vi khuẩn Bacillus sp từ bãi rác thành phố Long Xuyên, chọn số chủng Bacillus có khả sinh tổng hợp cao số enzyme catalase, amylase protease, định danh vi khuẩn Bacillus sp đến loài nhằm bước xây dựng sưu tập số chủng chi Bacillus đã, ngày trở thành vi sinh vật quan trọng hàng đầu mặt ứng dụng đặc biệt ứng dụng xử lý rác thải, không gây ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng Trong kết nghiên cứu, chủng Bacillus phân lập từ mẫu rác Khi khảo sát đặc điểm khuẩn lạc chủng nhận thấy khuẩn lạc có dạng trịn đều, nhày, phẳng lồi, trắng sữa vàng nhạt, trơn khơ, bóng khơng bóng Từ chủng tiến hành khảo sát hoạt tính enzyme ngoại bào catalase, amylase protease, kết chọn chủng ký hiệu C1-1 A5-2 có hoạt tính enzyme cao Kết khảo sát đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa: x C1-1 hình que ngắn, thẳng, sống riêng lẻ, kết đôi kết chuỗi ; Gram dương; kích thước: (0,7-0,8)µm x (2,0-2,1)µm ; có song chùm mao, di động chậm ; có nội bào tử hình bầu dục, lệch tâm, khơng làm phình tế bào, chiều dài bào tử ngắn chiều dài tế bào, kị khí tùy ý, sử dụng 26 loại đường x A5-2 hình que ngắn, thẳng, sống riêng lẻ, kết đơi kết chuỗi ; Gram dương; kích thước: (0,9-1,0)µm x (1,6-1,8)µm ; có chùm mao, di động nhanh C1-1 ; có nội bào tử hình bầu dục, lệch tâm, khơng làm phình tế bào, chiều dài bào tử ngắn chiều dài tế bào, kị khí tùy ý, sử dụng 25 loại đường Kết định danh: x C1-1 Bacillus subtilis strain PAN MC46 x A5-2 Bacillus subtilis DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng Thành phần chất thải rắn sinh hoạt thành phố Long Xuyên Bảng Các giếng API 50CH 30 Bảng Quality control for Bacillus: Bacillus polymyxa (*) ATCC 43865 (with API 50 CHB/E Medium) 32 Bảng Đặc điểm khuẩn lạc chủng vi khuẩn môi trường dinh dưỡng tối thiểu rắn 37 Bảng Hoạt độ catalase chủng vi khuẩn 39 Bảng Hoạt độ amylase chủng vi khuẩn 42 Bảng Hoạt độ protease chủng vi khuẩn 44 Bảng Kích thước ngang lớn vết cấy đo theo không gian chiều 46 Bảng Khả phát triển chủng thông qua vết cấy thạch bán rắn 48 Bảng 10 Kết kiểm tra khả sử dụng số nguồn carbon chủng C1-1 49 Bảng 11 Kết kiểm tra khả sử dụng số nguồn carbon chủng A5-249 Bảng 12 Định danh vi khuẩn Test Kit API 50CH 49 Bảng 13 Định danh vi khuẩn giải trình tự gene 16S rRNA 50 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Trang Biểu đồ Hoạt độ catalase chủng vi khuẩn 40 Biểu đồ Hoạt độ amylase chủng vi khuẩn 42 Biểu đồ Hoạt độ protease chủng vi khuẩn 44 A5-2 Hình 16 Khảo sát hoạt độ protease Bảng Hoạt độ protease chủng vi khuẩn Chủng vi khuẩn C1-1 C8 C6 A2-1 A8-2 A6 A5-2 Hoạt độ protease 2 2 Ghi chú: Dấu “-“: khơng có hoạt độ protease Biểu đồ Hoạt độ protease chủng vi khuẩn Hoạt độ protease C1-1 C8 C6 A2-1 A8-2 A6 A5-2 Chủng vi khuẩn Qua kết ghi nhận g biểu diễn biểu đồ nhận thấy có chủng C1-1 A5-2 có hoạt độ protease cao Như vậy, dựa vào kết khảo sát hoạt độ enzyme catalase, amylase protease chọn chủng C1-1 A5-2 có hoạt tính enzyme trội để khảo sát tiếp đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa III Khảo sát đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa chủng C1-1 A5-2 Đặc điểm hình thái 1.1 Quan sát đại thể Các chủng C1-1 A5-2 nuôi cấy môi trường dinh dưỡng tối thiểu rắn Sau ngày quan sát nhận thấy trình sinh trưởng phát triển, sản phẩm trao đổi chất vi khuẩn không làm thay đổi pH môi trường Đặc điểm khuẩn lạc chủng C1-1 A5-2 nuôi cấy môi trường dinh dưỡng tối thiểu rắn 370C ghi nhận bảng 1.2 Quan sát vi thể Các chủng C1-1 A5-2 nuôi cấy môi trường dinh dưỡng tối thiểu lỏng, sau 24 tiến hành quan sát: 1.2.1 Hình dạng Tiến hành nhuộm đơn: quan sát hình dạng tế bào, kết cho thấy tế bào C1-1 A5-2 hình que ngắn, thẳng, sống riêng lẻ, kết đôi kết chuỗi 1.2.2 Nhuộm Gram đo kích thước vi khuẩn Nhuộm Gram: tiến hành nhuộm Gram, dùng E coli - vi khuẩn Gram âm làm đối chứng Kết minh họa hình 17 cho thấy vi khuẩn E coli bắt màu hồng fuchsin, cịn chủng thí nghiệm C1-1 A5-2 không bắt màu hồng fuchsin Như chủng C1-1 A5-2 thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương C1-1 A5-2 Hình 17 Kết nhuộm Gram chủng C1-1 A5-2 Ghi chú: Vi khuẩn màu hồng: E coli , vi khuẩn màu tím: chủng thí nghiệm Đo kích thước tế bào: dùng vi trắc kế tìm hệ số đo, sau đặt mẫu vào đo ghi nhận hình 18 19 Kích thước mẫu tích khoảng cách thể hình 18 (chủng C1-1) hình 19 (chủng A5-2) với hệ số đo Hình 18 Kích thước chủng C1-1 Hình 19 Kích thước chủng A5-2 Ghi chú: Chiều dài - hình bên trái ; chiều rộng - hình bên phải Sau tính tốn, kích thước chủng tương ứng là: C1-1: (0,7-0,8)µm x (2,0-2,1)µm A5-2: (0,9-1,0)µm x (1,6-1,8)µm 1.2.3 Khả di động nhuộm tiên mao Kiểm tra khả di động Khi làm tiêu giọt ép nhận thấy C1-1 A5-2 di động, A5-2 di động nhanh C1-1 Khi quan sát khả di chuyển đường cấy chủng môi trường thạch bán rắn, kết ghi nhận hình 20 bảng C1-1 A5-2 Hình 20 Vết cấy chủng mơi trường thạch bán rắn Bảng Kích thước ngang lớn vết cấy đo theo không gian chiều Chủng vi khuẩn C1-1 A5-2 Chiều ngang (mm) 5,7 b 6,9 a C.V% 0,65 LSD 0,1 Qua kết ghi nhận bảng hình 20 thấy có xuất mờ khói xung quanh vết cấy, điều lại khẳng định chủng vi khuẩn có khả di động Tiến hành nhuộm tiên mao để tìm hiểu xem có phải loại vi khuẩn di động có tiên mao hay khơng có tiên mao Nhuộm tiên mao phẩm nhuộm Nishizawa kangen, kết quả: tiên mao tế bào vi khuẩn có màu hồng nâu minh họa hình 21 C1-1 A5-2 Hình 21 Kết nhuộm tiên mao chủng C1-1 A5-2 Qua kết ghi nhận hình 21 cho thấy chủng C1-1 A5-2 có tiên mao, C1-1 thuộc loại song chùm mao A5-2 thuộc loại chùm mao 1.2.4 Nhuộm bào tử Vi khuẩn ủ 370C môi trường thạch nghiêng Sau ngày tiến hành nhuộm mẫu với lục malachite nước Kết thể hình 22 với bào tử bắt màu xanh lục, tế bào vi khuẩn bắt màu hồng nhạt C1-1 A5-2 Hình 22 Kết nhuộm bào tử chủng C1-1 A5-2 Kết hình 22 cho thấy tế bào có bào tử hình bầu dục, lệch tâm, khơng làm phình tế bào, chiều dài bào tử ngắn chiều dài tế bào Do có số nhóm vi khuẩn có nhiều mức tương đồng cao đặc điểm hình thái nên tiếp tục khảo sát thêm số phản ứng sinh hóa Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 2.1 Khả sống điều kiện hiếu khí, kị khí Trở lại hình 20 mục 1.2.3, xem sinh trưởng vi khuẩn bề mặt dọc theo vết cấy Kết chủng vi khuẩn sinh trưởng bề mặt lan rộng qua bên vết cấy với mờ khói xuất độ sâu khác ghi nhận bảng Bảng Khả phát triển chủng thông qua vết cấy thạch bán rắn Chủng vi khuẩn C1-1 A5-2 Chiều ngang (mm) 5,7 b 6,9 a C.V% 0,65 LSD 0,1 Chiều sâu (mm) 38,53 a 15,13 b C.V% 0,91 LSD 0,555 Qua kết ghi nhận bảng thấy chủng có sinh trưởng độ sâu khác nhau: chủng A5-2 có khả sống điều kiện thiếu oxy C1-1 Chính chủng sinh trưởng bề mặt môi trường lẫn dọc theo vết cấy nên chủng thuộc loại kị khí tùy ý 2.2 Khả sử dụng số nguồn carbon Sử dụng API 50CH với 50 giếng có chứa thuốc thử với giếng giếng đối chứng, lại 49 giếng tương ứng với 49 loại đường tinh Cho dịch nuôi cấy vi khuẩn vào tất giếng từ – 49 hình 23 C1-1 A5-2 Hình 23 Bộ API 50CH sau nhỏ dịch nuôi cấy vi khuẩn Khả sử dụng nguồn carbon vi khuẩn tạo thay đổi màu sắc thể hình 24 C1-1 A5-2 Hình 24 Khả sử dụng số nguồn carbon chủng sau 24 ủ 370C Kết 24 48 chủng nhau, so sánh kết với bảng Analytical Profile Index, kết ghi nhận bảng 10 11 Bảng 10 Kết kiểm tra khả sử dụng số nguồn carbon chủng C1-1 10 11 12 13 14 15 16 24 - + - - + + + - - - - + + + - - - 48 - + - - + + + - - - - + + + - - - 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 24 + + + - + - + + + + + + - + + + + 48 + + + - + - + + + + + + - + + + + 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 24 - + + + - + + - - - - - - - - - 48 - + + + - + + - - - - - - - - - Bảng 11 Kết kiểm tra khả sử dụng số nguồn carbon chủng A5-2 10 11 12 13 14 15 16 24 - + - - + + - - - - - + + + - - - 48 - + - - + + + - - - - + + + - - - 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 24 + + + - + - + + + + + + - + + + + 48 + + + - + - + + + + + + - + + + + 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 24 - + + + - + + - - - - - - - - - 48 - + + + - + + - - - - - - - - - Ghi chú: Dấu “+”: vi khuẩn có khả sử dụng nguồn carbon Dấu “-” : vi khuẩn khơng có khả sử dụng nguồn carbon Khi so sánh chủng nhận thấy chủng vi khuẩn khảo sát có khả sử dụng nguồn carbon trừ D-Xylose (giếng số 6) III Định danh vi khuẩn Định danh vi khuẩn Test Kit API 50CH Với kết thí nghiệm thử khả sử dụng nguồn carbon, dùng phần mềm Identification software để kết luận Kết ghi nhận bảng 12 (chi tiết trình bày phần phụ lục) Bảng 12 Định danh vi khuẩn Test Kit API 50CH Chủng Định danh Độ tin cậy (% ID) C1-1 Bacillus subtilis 95,3 A5-2 Bacillus subtilis 97,8 Với kết có độ tin cậy tương đối cao này, tiếp tục dùng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA để kết luận chắn Định danh vi khuẩn giải trình tự gene 16S rRNA Gửi ống thạch nghiêng ni cấy ngày đến phịng xét nghiệm Nam Khoa – Thành phố Hồ Chí Minh Sau giải trình tự gene 16S rRNA, tiến hành tra cứu BLAST SEARCH cách vào trang http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, BASIC BLAST chọn nucleotide blast, Enter Query Sequence gõ trình tự gene 16S rRNA vừa giải mã, Choose Search Set chọn Others, nhấn BLAST cuối trang Kết ghi nhận bảng 13 (chi tiết trình bày phần phụ lục) Bảng 13 Định danh vi khuẩn giải trình tự gene 16S rRNA Chủng Định danh Độ tin cậy (% ID) C1-1 Bacillus subtilis strain PAN MC46 99,0 A5-2 Bacillus subtilis 99,0 Qua phương pháp định danh vi khuẩn nhận kết trùng khớp với độ tin cậy cao, chủng C1-1 giải trình tự gene 16S rARN phân loại Bacillus subtilis đến dòng PAN MC46, Test Kit API 50CH dừng lại loài Bacillus subtilis Điều khẳng định việc tiến hành dùng phương pháp định danh vi khuẩn giải trình tự gene 16S rRNA có ý nghĩa KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I Kết luận Phân lập Đã phân lập dạng khuẩn lạc, tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sp có khả sinh enzyme catalase, amylase protease tốt, ký hiệu C1-1 A5-2 Sử dụng chủng để định danh Đặc điểm hình thái 2.1 Khuẩn lạc C1-1 đường kính 5,9-6,5mm ; màu trắng sữa ; hình dạng trịn ; bề mặt trơn, bóng, nhày, nhơ thấp ; mép tia A5-2 đường kính 4,5-6,0mm ; màu trắng sữa, tâm nâu đậm ; hình dạng trịn ; bề mặt trơn, bóng, nhày, nhơ cao ; mép tia C1-1 2.2 Tế bào C1-1 hình que ngắn, thẳng, sống riêng lẻ, kết đôi kết chuỗi ; Gram dương ; kích thước: (0,7-0,8)µm x (2,0-2,1)µm ; có song chùm mao, di động chậm ; có nội bào tử hình bầu dục, lệch tâm, khơng làm phình tế bào, chiều dài bào tử ngắn chiều dài tế bào A5-2 hình que ngắn, thẳng, sống riêng lẻ, kết đơi kết chuỗi ; Gram dương; kích thước: (0,9-1,0)µm x (1,6-1,8)µm ; có chùm mao, di động nhanh C1-1 ; có nội bào tử hình bầu dục, lệch tâm, khơng làm phình tế bào, chiều dài bào tử ngắn chiều dài tế bào Đặc điểm sinh lý, sinh hóa C1-1 A5-2 thuộc loại kị khí tùy ý Trong 49 loại đường ghi chi tiết bảng 2, C1-1 sử dụng 26 loại đường, A5-2 sử dụng 25 loại đường (xem chi tiết bảng 10 11) Như vậy, chủng vi khuẩn khảo sát có khả sử dụng nguồn carbon trừ D-Xylose (giếng số 6) Định danh 4.1 Bằng Test Kit API 50CH C1-1 định danh Bacillus subtilis với độ tin cậy 95,3% A5-2 định danh Bacillus subtilis với độ tin cậy 97,8% 4.2 Bằng giải trình tự gen 16S rRNA C1-1 định danh Bacillus subtilis strain PAN MC46 với độ tin cậy 99% A5-2 định danh Bacillus subtilis với độ tin cậy 99% II Kiến nghị Từ chủng vi khuẩn vừa định danh xin đơn vị chủ quản cho phép phổ biến rộng rãi giảng dạy nghiên cứu Trong điều kiện xin đề nghị dùng chủng tiếp tục: - Tìm mơi trường ni cấy tối ưu để thu enzyme có hoạt tính cao - Định danh thêm nhiều chủng phân lập thiết bị nhập trường nhằm bổ sung vào kho tàng giống - Khảo sát số enzyme ngoại bào khác có tác dụng xử lý thành phần rác thải - Phân lập chủng khác ngồi vi khuẩn có hoạt tính enzyme cao, sống hịa bình với với vi khuẩn để tăng hiệu suất xử lý rác TÀI LIỆU THAM KHẢO A,Hammed, T,Keshavarz, C,S.Evan 1999 Effect of dissolved oxygen tension and pH on the production of extracellular protease from a new isolate of Bacillus subtilis K2, for use in leather processing J Chem Technol Biotechnol 74 B,D.Rebeca, Pena-Vera, MT, Diaz-Castaneda, M 1991 Production of fish protein hydrolysates with bacterial proteases ; yield and nutritional value J Food Sci 56 Dương Văn Hợp, Nguyễn Lân Dũng 27.2.2007 Phân loại vi sinh sinh học phân tử [trực tuyến] Vietsciences Đọc từ: http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/phanloaivisinhbangsinhhocphan tu.htm (đọc ngày 12.8.2010) Đoàn Văn Thược, Mai Thị Hằng 2005 "Tuyển chọn nghiên cứu số chủng vi sinh vật có khả sinh amylaza bã sắn phế thải để sản xuất enzym cho chăn nuôi gia súc" TC Nông nghiệp phát triển nơng thơn (17) : 45-47 Đỗ Thị Bích Thủy, Trần Thị Xô 2004 Phân lập số chủng vi sinh vật có khả sinh protease cao từ vỏ tơm Huế: Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nơng thơn 41: 611-612 Đỗ Thị Bích Thủy, Trần Thị Xơ 2005 Ảnh hưởng thay nguồn cacbon nitơ tự nhiên lên trình sản xuất chế phẩm protease từ Bacillus subtilis Huế: Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nông thôn 59: 42-43 Đỗ Thị Ngọc Huyền, Nguyễn Ngọc Huyền, Nguyễn Thùy Châu 2005 "Phân lập, tuyển chọn định loại chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả sinh phytaza" TC Nông nghiệp phát triển nông thôn (7) : Đường Hồng Dật, Nguyễn Lân Dũng 1979 Giáo trình vi sinh vật học nơng nghiệp Hà Nội : NXB Nơng Nghiệp Êgơrơv, N.X người dịch: phó giáo sư Nguyễn Lân Dũng Thực tập vi sinh vật học Hà Nội: NXB Đại học Trung học chuyên nghiệp F,G.Priest 1977 Extracellular Enzyme synthesis in the Genus Bacillus Bacteriological Reviews 41 H,Outtrup, T,S.Jorgensen ST 2002 The importance of Bacillus species in the production of industrial enzymes In: Berkeley R, Heyndrickx M, Logan N, De Vos P (eds) Application and systematics of Bacillus and relatives UK: Blackwell John,G.Holt, Noel,R.Krieg, Peter,H.A.Sneath, James,T.Staley, Stanley,T.Williams 1994 Bergey’s Manual of Determinative bacteriology USA: Williams & Wilkins Lê Duy Linh (chủ biên), Trần Thị Hường, Trịnh Thị Hồng, Lê Duy Thắng 2001 Thực tập vi sinh sở TP.HCM: NXB Đại học quốc gia Lê Thị Loan, Lê Văn Hiệp, Dương Hồng Quân, Nguyễn Tiến Minh, Đinh Duy Kháng 2005 "Định loại chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus dùng sản xuất Biosubtyl viện vacxin phương pháp xác định trình tự gen 16S rRNA Western Blot" TC Y học dự phòng, số 77 Lương Đức Phẩm, Hồ Xưởng 1978 Vi sinh tổng hợp Hà Nội: NXB Khoa học kỹ thuật Lưu Đức Cường 2008 Báo cáo tổng hợp: Nghiên cứu đề xuất xây dựng phương án xử lý bãi rác gây ô nhiễm môi trường theo định 64/2003/QĐ-TTG (bãi rác thị xã Bến Tre, tỉnh Bến Tre ; bãi rác Bình Đức, TP.Long Xuyên, tỉnh An Giang ; bãi rác thị xã Cao Lãnh, tỉnh Đồng Tháp) Hà Nội M,Kubo, J,Okajima, F,Hasumi 1994 Isolation and charecterization of soybean waste – degrading microorganisms and analysis of fertilizer effects of the degraded products Applied and Environmental Microbiology 60 M,Schallmey, A,Singh, P,O.Ward 2004 Developments in the use of Bacillus species for industrial production Can J Microbiol 50 Nakano,Michiko M Zuber,Peter 10.1998 "Anaerobic growth of a "strict aerobe" (Bacillus subtilis)" [trực tuyến] Annual Review of Microbiology, Vol 52: 165-190 Đọc từ: http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.micro.52.1.165 (đọc ngày 8.11.2010) Ngô Tự Thành, Bùi Thị Việt Hà, Vũ Minh Đức, Chu Văn Mẫn 2.4.2007 Nghiên cứu hoạt tính enzyme ngoại bào số chủng Bacillus phân lập khả ứng dụng chúng xử lý nước thải [trực tuyến] Tạp chí khoa học đại học Quốc gia Hà Nội, Khoa học Tự nhiên Công nghệ 25 (2009) 101-106 Đọc từ: http://news.vnu.edu.vn/tn_2_09/b6.pdf (đọc ngày 5.2.2010) Nguyễn Đình Bảng, Hồng Ngọc Hiển, Phạm Lê Hùng, Đàm Viết Cương 1992 Vi sinh vật y học Hà Nội: NXB Đại học Trung học chuyên nghiệp Nguyễn Đức Lượng 2001 Công nghệ sinh học TP.HCM: NXB Đại học quốc gia Nguyễn Đức Lượng 2002 Công nghệ vi sinh, tập TP.HCM: NXB Đại học quốc gia Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Thị Thùy Dương 2003 Công nghệ xử lý nước thải, tập TP.HCM: NXB Đại học quốc gia Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), Phan Thị Huyền, Lê Thị Thủy Tiên, Huỳnh Thị Ngọc Oanh, Cao Cường 2002 Công nghệ gen TP.HCM: NXB Đại học quốc gia Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), Phan Thị Huyền, Nguyễn Thị Ánh Tuyết 2006 Thí nghiệm cơng nghệ sinh học, tập TP.HCM: NXB Đại học quốc gia Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết 2003 Thí nghiệm Vi sinh vật học TP Hồ Chí Minh: NXB Giáo dục Nguyễn Hữu Hiệp, Cao Ngọc Điệp 2002 Giáo trình thực tập Vi sinh vật đại cương Cần Thơ: Viện nghiên cứu phát triển Công nghệ Sinh học Nguyễn Lân Dũng 5.10.2005 Cấu trúc tế bào vi khuẩn [trực tuyến] Vietsciences Đọc từ: http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/cautructebaovk.htm (đọc ngày 28.1.2010) Nguyễn Lân Dũng, Đinh Thúy Hằng 24.4.2006 Phương pháp thực nghiệm dùng để định tên loài vi khuẩn [trực tuyến] Vietsciences Đọc từ: http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/phuongphapthucnghiemdinhtenvk.htm (đọc ngày 6.3.2010) Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty 2000 Vi sinh vật học (lần 3) Hà Nội: NXB Giáo dục Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình Lương, Đồn Xn Mượu, Phạm Văn Ty 1978 Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập Hà Nội: NXB Khoa học kỹ thuật Nguyễn Lân Dũng, Phạm Văn Ty 1979 Vi sinh vật học, tập (lần 2) Hà Nội: NXB Khoa học kỹ thuật Nguyễn Phú Thọ 2009 Nghiên cứu qui trình sản xuất bột papain thơ ứng dụng thủy phân phụ phẩm cá Tra Luận văn thạc sỹ khoa học ngành công nghệ thực phẩm Viện Nghiên cứu phát triển công nghệ sinh học, Đại học Cần Thơ Nguyễn Trọng Cẩn (chủ biên), Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến 1998 Công nghệ enzym TP.HCM: NXB Nông nghiệp P,G.Dalev 1994 Utilization of waste feathers from poultry slaughter for production of a protein concentrate Bioresour Technol 48 Phạm Thị Tuyết Ngân Không ngày tháng Các yếu tố ảnh hưởng lên hiệu sử dụng vi sinh vật hữu ích ni trồng thủy sản [trực tuyến] UV-Việt Nam Đọc từ: http://uv-vietnam.com.vn/NewsDetail.aspx?newsId=1423 (đọc ngày 29.5.2012) Phạm Thị Tuyết Ngân Khơng ngày tháng Ứng dụng dịng Bacillus sp có ích ni trồng thủy sản [trực tuyến] UV-Việt Nam Đọc từ: http://uvvietnam.com.vn/NewsDetail.aspx?newsId=1097 (đọc ngày 29.5.2012) R,Gupta, Q,K.Bey, P,Lorenz 2002 Bacterial alkaline proteases: molecular approaches and industrial application, Appl Microbiol Biotechnol 59 Schallmey,M., Singh,A., Ward,O.P 2004 Developments in the use of Bacillus species for industrial production Canadian Journal of Microbiology, Volume 50, Number 1, January 2004, pp 1-17 (17) Trần Đình Toại, Trần Thị Hồng 2007 Tương lai ứng dụng enzyme xử lý phế thải [trực tuyến] Tạp chí khoa học đại học Quốc gia Hà Nội, Khoa học Tự nhiên Công nghệ 23 (2007) 75-85 Đọc từ: http://js.vnu.edu.vn/tn_2_07/b1.pdf (đọc ngày 16.8.2011) Trần Linh Thước (chủ biên), Nguyễn Đức Hoàng, Phan Thị Phượng Trang, Phạm Thị Hồng Tươi 2001 Thực tập Vi sinh vật học TP Hồ Chí Minh: NXB Đại học Quốc gia Trần Linh Thước 2007 Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm TP Hồ Chí Minh: NXB Giáo dục Trần Quốc Hậu 2008 Phân lập nhận diện vi khuẩn Bacillus sp ao nuôi tôm xanh Khóa luận tốt nghiệp kỹ sư ngành Cơng nghệ sinh học Khoa Nông nghiệp tài nguyên thiên nhiên, Đại học An Giang Trần Thanh Thủy 1998 Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học TP.HCM: NXB Giáo dục Trần Thị Ánh Tuyết, Trương Quốc Huy 2010 Khảo sát điều kiện nuôi cấy phương pháp tách chiết enzyme cellulase từ vi khuẩn Bacillus subtilis [trực tuyến] Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ Đại học Đà Nẵng Đọc từ: http://www.kh-sdh.udn.vn/zipfiles/08.tbCNMT/08.02.r.tuyethuy.pdf (đọc ngày 16.8.2011) Trần Thị Hồng Nghi, Lê Thanh Hùng, Trương Quang Bình Khơng ngày tháng Nghiên cứu ứng dụng enzyme protease từ vi khuẩn (Bacillus subtilis) để thủy phân phụ phẩm cá tra [trực tuyến] Đọc từ: http://fof.hcmuaf.edu.vn/data/49_%20TTH%20Nghi%20et%20al-DHNLUng%20dung%20enzyme%20protease%20tu%20vi%20khuan.pdf (đọc ngày 29.5.2012) Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Không ngày tháng Nghiên cứu sử dụng chế phẩm sinh học từ vi khuẩn đối kháng để kiểm soát nấm hại trồng [trực tuyến] Đọc từ: http://www.vast.ac.vn/index.php?option=com_content&view=article&id=1046&c atid=37%3Atin-khcn-trong-nc-&Itemid=34&lang=vi (đọc ngày 29.5.2012) Võ Bích Hiểu 2008 Phân lập nhận diện vi khuẩn Bacillus sp ao nuôi cá tra An Giang: Khoa Nông nghiệp Tài nguyên thiên nhiên Vũ Thị Minh Đức 2001 Thực tập Vi sinh vật học Hà Nội: NXB Đại học Quốc gia Wolfgang,Fritsche người dịch: Kiều Hữu Ảnh, Ngô Tự Thành 1983 Cơ sở hóa sinh vi sinh vật học công nghiệp Hà Nội: NXB Khoa Học Kỹ Thuật PHỤ LỤC ...TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA SƯ PHẠM BỘ MÔN SINH ĐỀ T? ?I NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN BACILLUS sp Ở BÃI RÁC BÌNH ĐỨC, TP LONG XUYÊN, T AN GIANG BAN GIÁM... phạm vi nghiên cứu I Đối t? ?ợng nghiên cứu Chủng vi khuẩn Bacillus sp II Phạm vi nghiên cứu Thu mẫu bãi rác TP Long Xuyên đem phân lập chủng vi khuẩn Bacillus sp Tiến hành tuyển chọn chủng có ho? ?t. .. ô nhiễm môi trường nghiêm trọng Vấn đề xử lý rác thải trở nên thi? ?t thực cấp bách Phân lập vi khuẩn Bacillus sp t? ?? bãi rác thành phố Long Xuyên, chọn số chủng Bacillus có khả sinh t? ??ng hợp cao