PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS

I.LỜI MỞ ĐẦU:5I.NỘI DUNG:61.Giới thiệu chung:61.1.Một số vi sinh vật thủy phân protein:61.1.1.pseudomonas sp.p :61.1.2.Bacilus sp.p:71.2.Giới thiệu về B. subtilis:71.2.1. Đặc điểm nuôi cấy:81.2.2. Đặc điểm phân bố:81.2.3. Đặc điểm hình thái:81.2.4. Đặc điểm sinh hóa:91.2.5. Cấu trúc kháng nguyên:91.2.6. Ứng dụng:91.2.7.Bào từ:112.Phân lập và tuyển chọn Baccillus subtilis trong đất:112.1.Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn:112.2.Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacilus subtilis122.3.Khảo sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn phân lập được:132.4. Các thí nghiệm về vi khuẩn Bacillus subtilis:142.4.1. Ảnh hưởng của chế độ sục khí và thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis:142.4.2. Ảnh hưởng của môi trường đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn Bacilus subtilis:151.4.3.Khảo sát điều kiện (Ph, thời gian) thích hợp cho sự sản xuất enzyme của các chủng Bacillus subtilis:172.5. Thử nghiệm thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm từ Bacilus subtilis172.5.2. Kiểm tra chế phẩm trong thời gian bảo quản:182.6. Khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacilus subtilis:182.6.1. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc nghi ngờ là Bacilus subtilis182.6.2. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Bacilus subtilis:192.7. Các thí nghiệm222.7.1. Thí nghiệm 1: ảnh hưởng của chế độ sục khí và thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme amylase và protease của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilics phân lập được222.7.2. Thí nghiệm 2: ảnh hưởng của môi tường đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis232.8. Khảo sát thời gian bảo quản chế phẩm sau khi sản xuất253.Đặc tính sinh lísinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis263.1.Thành phần hóa học của vi khuẩn b.subtilis263.1.1.Nước263.1.2.Protein263.1.3.Lipid273.1.4.Glucid273.1.5.Acid nucleic273.1.6.Khoáng283.1.7.Enzyme, độc tố:283.2. Nguồn dinh dưỡng của vi khuẩn B.subtilis283.2.1. Nguồn dinh dưỡng C283.2.2. Nguồn dinh dưỡng N303.2.3.Nguồn dinh dưỡng khoáng313.3.Kiểu dinh dưỡng của B.subtilis333.4.Đặc điểm sinh hóa333.5.Sự hấp thu các chất dinh dưỡng của vi khuẩn bacillus subtilis353.5.1.Sự khuếch tán xúc tiến và khuếch tán bị động353.5.2.Sự vận chuyển chủ động (Active Transport)363.5.3. Sự chuyển vị nhóm (Group Translocation)39IV. Kết luận:40

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

-BÁO CÁO VI SINH THỰC PHẨM

Chủ đề báo cáo:

Phân lập và tuyển chọn vi sinh vật có khả

năng sản xuất protease dùng để thủy phân

protein trong phế liệu thủy sản

Nha Trang-2016

Chủ đề báo cáo: Phân lập và tuyển chọn vi sinh vật có khả năng sản xuất protease dùng để thủy phân protein trong phế liệu thủy sản.

Tên chủ đề nghiên cứu:

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN

VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS

I LỜI MỞ ĐẦU:

Hiện nay trên toàn cầu, có gần 70 triệu tấn thủy sản đang được chế biến ở dạng philê,đông lạnh, đóng hộp hoặc ngâm tẩm Hầu hết các quá trình này đều thải ra một số lượnglớn các loại phụ phẩm và phế phẩm

Cụ thể, trong năm 2011, trong khi sản lượng khai thác cá ngừ toàn cầu đạt khoảng4,76 triệu tấn, thì lượng sản phẩm cá ngừ đóng hộp chỉ có gần 2 triệu tấn Chất thải rắnhoặc các phụ phẩm được thải ra từ sản xuất cá ngừ đóng hộp (bao gồm đầu, bộ xương,nội tạng, mang, phần thịt màu sẫm, vây bụng và da) có thể chiếm khoảng 65% lượngnguyên liệu ban đầu Các số liệu báo cáo trong ngành sản xuất thịt cá ngừ cũng cho thấycác phế phẩm, phụ phẩm chiếm khoảng 50% tổng nguyên liệu ban đầu Khi philê cá, sản

phẩm đạt được thường chỉ chiếm khoảng 30-50% so với lượng nguyên liệu ban đầu Sảnlượng cá hồi toàn cầu năm 2011 đạt khoảng 1,93 triệu tấn và hầu hết là các sản phẩm ởdạng philê, sản phẩm này cũng được báo cáo đạt khoảng 55% tổng khối lượng nguyênliệu Một lượng lớn các sản phẩm philê cá rô phi và cá tra hiện cũng đang được bán trênthị trường với hiệu suất philê đạt khoảng 30-37% cho cá rô phi và 35% cho cá tra.

Có thể thấy, ngành chế biến thủy sản đã và đang tạo ra một lượng đáng kể các phếphẩm, phụ phẩm và thịt vụn từ các thành phần như đầu, bộ xương, bụng, gan và trứng.Đây là những bộ phận chứa protein chất lượng cao, axit béo omega-3, vi chất dinhdưỡng (như vitamin A, D, riboflavin, niacin) và khoáng chất (như sắt, kẽm, selen và i-ốt) Vì vậy, việc tối đa hóa gia trị thặng dư nhằm đảm bảo lợi nhuận tối đa cho cácdoanh nghiệp chế biến là vô cùng quan trọng Trong đó, việc tận dụng các protein từ phếphẩm thủy sản sẽ đem lại giá trị kinh tế cao

Với sự phát triển của khoa học công nghệ hiện nay thì việc ứng dụng từ vi sinh vậtkhá phổ biến bởi vi sinh vật dễ nuôi cấy, vòng đời ngắn, sinh sản nhiều, chi phí thấp…này có khả năng sản xuất protease có hoạt tính cao và nhiều ưu thế hơn hẳn

I NỘI DUNG:

1 Giới thiệu chung:

1.1 Một số vi sinh vật thủy phân protein:

1.1.1. pseudomonas sp.p :

- Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens là một loài vi khuẩn hình roi gram âm Nó thuộcchi Pseudomonas, dựa vào phân tích 16S rRNA nó được đặt vào nhóm P.fluorescens của chi Đối với ĐVTS khi còn sống: VSV tồn tại trên da (nhớt) sốlượng tứ 10 2 -105 tb/cm2: Pseudomonas fluorescens,

- Trong quá trình bảo quản và chế biến: VSV cũng nhiễm vào nguyên liệu với sốlượng phụ thuộc vào phương pháp bảo quản và chế biến

- Khi ĐVTS chết, kháng thể không còn > VSV sẽ phát triển rất mạnh, đặc biệt lànhóm Pseudomonas, khi ươn thối số lượng VSV tăng lên đến 107-1010tb/gam

Hiện nay đã có nhiều doanh nghiệp thành công trong việc ứng dụng vi sinh vật thủyphân protein từ phế phẩm thủy sản Thời gian gần đây, một số nhà khoahọc đã tiến hành nghiên cứu sử dụng protease trong chế biếnthủy sản nhưng các nghiên cứu này vẫn chưa đầy đủ và cần được

tiếp tục Nguồn protease từ vi sinh vật nhất là vi khuẩn Bacillus

subtilis là hướng nghiên cứu có nhiều triển vọng vì loại vi sinh vật

này có khả năng sản xuất protease có hoạt tính cao và nhiều ưu thếhơn hẳn

Với chủ đề báo cáo được chọn là: “Phân lập và tuyển chọn vi sinh vật có khả năng

sản xuất protease dùng để thủy phân protein trong phế liệu thủy sản”, chúng em đã

chọn chủ đề “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bacillus subtilis” Đây là

vi sinh vật có khả năng thủy phân protein trong phế liệu thủy sản Đây

là một đề tài được nhiều nhà khoa học trẻ nghiên cứu và có thể pháttriển trong tương lai

1.1.2 Bacilus sp.p:

- Từ bacillus nhằm miêu tả hình dáng của một nhóm vi khuẩn khi được quan sát dướikính hiển vi Nó xuất phát từ tiếng Latin có nghĩa là hình que Do đó, một số nơi gọi

là khuẩn que hoặc trực khuẩn

- Tuy nhiên, Bacillus (viết hoa và in nghiêng) là tên của một chi gồm các vi khuẩnhình que, Gram dương, hiếu khí thuộc về họ Bacillaceae trong Firmicutes Trong

đó, B subtilis là chủng được ứng dụng phổ biến trong thủy phân protein trong phếphẩm thủy sản

1.2 Giới thiệu về B subtilis:

-Điều kiện phát triển : hiếu khí, nhiệt độ tối ưu: 370C

- Điều kiện oxi: B subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng có khả năng phát triển trong môitrường thiếu oxi.

- Độ Ph: thích hợp Ph= 7.0- 7.4

- Môi trường thạch đĩa TSA: khuẩn lạc có dạng hình tròn, rìa răng cưa không đều, tâmsẫm màu, phát triển chậm, màu vàng xám, đường kính: 3-5 mm sau 1-4 ngày, bề mặtnhăn nheo, màu hơi sẫm

- Môi trường thạch nghiêng TSA: dễ mọc, tạ thành màu xám, rìa gợn sóng

- Môi trường canh TSB: B.subtilis phát triển làm đục môi trường, tạo màng nhăn, lắngcạn, kết lại như vầng mây ở đáy, khí tan đều

- Dinh dưỡng cần các nguyên tố: C, H, O, N và các nguyên tố khác…

-Đất nghèo dinh dưỡng ở sa mạc, đất hoang thì B subtilis rất hiếm

-Nước và bùn ở cửa sông cũng như ở nước biển có sự tồn tại của bào tử và tế bào sinhdưỡng B.subtilis

1.2.3 Đặc điểm hình thái:

-B.subtilis là vi khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, Gram dương, kích thước 0.5- 0.8 x 1.8- 3.0µ,đứng thành chuỗi ngắn hoặc đơn lẻ, di động 8- 12 lông

-Sinh bào tử nhỏ hơn vi khuẩn và nằm giữa tế bào, kích thước 0.8- 1.8 µm, phát triểnbằng cách nảy mầm do sự nứt bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm,tia tử ngoại, tia phóng xạ.

1.2.4 Đặc điểm sinh hóa:

- Lên men không sinh hơi: các loại đường glucose, maltose, manitol, saccarose, xylose,arabinose

- Indol(-), nitrat (-), VP (+), H2S(-), NH3 (+), catalase(+) , amylase (+), casein(+), citrat(+)

có khả năng di động hiếu khí

- dung huyết: một số dòng gây dung huyết ở dạng trên thạch máu ngựa và thỏ do tácđộng của hymolysine

1.2.5 Cấu trúc kháng nguyên:

- B.subtilis có kháng nguyên H, O cấu trúc kháng nguyên D, L- acid glutamic

- Sản sinh kháng sinh subtiline và baccitracin có tác dụng ức chế vi khuẩn G+ và G-,

- Bệnh học: đa số chủng B.subtilis không gây bệnh

1.2.6 Ứng dụng:

- Bacillus subtilis trong sản xuất enzyme công nghiệp

Theo thống kê, Bacillus subtilis sản xuất số lượng 50% tổng số enzyme cung cấp cho cáclĩnh vực công nghiệp enzyme như thực phẩm, tẩy rửa, dệt may, da, giấy, thuốc men…

- Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus subtilis trong lĩnh vực kiểm soát sinh học

Bacillus subtilis dùng để kiểm soát sinh học các bệnh thực vật, giúp ngăn ngừa và điều trịnhiều loại bệnh ở cây trồng như bệnh phấn trắng, sương giá, bệnh do nấm …

- Bacillus subtilis ứng dụng trong sinh học phân tử vi sinh vật học

Bacillus subtilis có thể biểu hiện 200 loại gen khác nhau nên được sử dụng trong các thínghiệm về biến đổi gen, chuyển gen …

- Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus subtilis trong phụ gia thực phẩm

Bacillus subtilis được phép sử dụng trong thực phẩm vi không gây độc hại, cải thiện chứcnăng đường ruột động vật, thúc đẩy sự tăng trưởng động vật và ngăn ngừa bệnh tật.Bacillus subtilis có thể sinh bào tử do vậy có thể xâm nhập dễ dạng vào đường ruột củađộng vật mà không bị dịch vị axit tiêu diệt, khi ở phần trên của ruột bào tử phục hồi vànảy mầm đồng thời tiết ra hàng hoạt enzyme có hoạt tính sinh học cao như protease,lipase, amylase, góp phần vào việc tiêu hóa thức ăn Ngoài ra nó còn sản xuất ra peptideđối kháng, kìm hãm các vi khuẩn gây bênh thối ruột phát triển Do Bacillus subtilis hiếukhí nên tiêu thụ oxy trong ruột ức chế các các vi khuẩn kỵ khí phát triển

- Bacillus subtilis được sử dụng trong lĩnh vực y tế và sức khỏe

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi khuẩn Bacillus subtilis có thể được sử dụng để điều trịviêm ruột, viêm phế quản và tiêu chảy và các bệnh khác, nhưng cũng để phòng ngừa vàđiều trị các nhiễm trùng vết bỏng

- Bacillus subtilis trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản

Trong nuôi trồng thủy sản, Bacillus subtilis protease và các enzym và kháng sinh, và phângiải các chất một lượng lớn thức ăn còn sót lại, các chất bài tiết, chất thải, phế thải độngvật và thực vật và các loại khí độc hại (amoniac, hydrogen sulfide vv ), Chúng cũng phângiải các chất có phân tử lượng lớn thành các phân tử nhỏ hơn va cuối cùng tạo thànhcarbon dioxide, nitrat và sunfat, vv, làm giảm COD nước, BOD, cải thiện chất lượngnước Chúng cung cấp chất dinh dưỡng cho tảo tảo đơn bào chủ yếu là để thúc đẩy sinhsản, thực vật phù du quang hợp, do vậy cung cấp oxy lại cho vật nuôi tạo thành một chutrình sinh thái lành mạnh Ngoài ra, chúng tiết ra một loại enzyme và thuốc kháng sinh cóthể ức chế sự tăng trưởng của các vi khuẩn khác và do đó làm giảm hoặc thậm chí loại bỏ

tác nhân gây bệnh động vật thủy sản Ngày càng có nhiều nghiên cứu cho thấy vai tròquan trọng của B subtilis trong nuôi trồng thủy sản.

I.2.7 Bào từ:

– Bào tử Bacillus subtilis có dạng elip đến hình cầu, có kích thước 0,6 – 0,9 µm x 1,0 –1,5 µm, được bao bọc bởi nhiều lớp màng với các thành phần lipoprotein,peptidoglycan…

- Bào tử của chúng có khả năng chịu được pH thấp của dạ dày, tiến đến ruột và nảymầm tại phần đầu của ruột non Đây là đặc điểm quan trọng trong ứng dụng sản xuấtprobiotic từ Bacillus subtilis (Nguyễn Duy Khánh, 2006)

- Khả năng tạo bào tử:

Nhờ khả năng tạo bào tử mà vi khuẩn có thể tồn tại được trong các điều kiện bất lợi (dinhdưỡng trong môi trường cạn kiệt, môi trường tích lũy các sản phẩm trao đổi chất có hại

và nhiệt độ cao…)

– Quá trình hình thành bào tử gồm các bước sau:

+ Hình thành những búi chất nhiễm sắc;

+ Tạo tiền bào tử;

+ Tiền bào tử hình thành hai lớp mảng, tăng cao tính bức xạ;

+ Tổng hợp các lớp vỏ bào tử;

+ Giải phóng bào tử.;

+ Khi gặp điều kiện thuận lợi thì bào tử sẽ nảy mầm, phát triển thành tế bào sinh dưỡngmới

2 Phân lập và tuyển chọn Baccillus subtilis trong đất:

2.1. Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn:

Dùng muỗng gạt nhẹ, bỏ phần lớp đất mặt khoảng 2- 3 cm, lấy lớp đất ở dưới Cân 10gmẫu đất cho vào bình tam giác chứa 90ml nước muối sinh lí thanh trùng và lắc đều, đượcnồng độ pha loãng 10-1 .

2.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacilus subtilis:

Chuẩn bị 4 ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lí vô trùng, đánh số thứ tự từ 1-4 Dùngmicropipet hút 1ml từ bình tam giác chứa mẫu đất phân lập có nồng độ pha loãng 10-1 chovào ống nghiệm 1 và lắc đều, được nồng độ pha loãng 10-2, tiếp tục làm cho đến ốngnghiệm cuối cùng Tiếp theo, chọn các ống nghiệm có nồng độ pha loãng 10-3, 10-4, 10-5,dùng micropipet hút 0.1 ml từ mỗi nồng độ pha loãng cho lên đĩa môi trường TSA( mỗinồng độ lặp lại 2 lần) và trang đều bằng que cấy trang vô trùng, sau đó cho những đĩaTSA này vào tủ ấm, ủ ở 37oC/ 24h Sau đó, quan sát khuẩn lạc hình thành trên đĩa, chọnnhững khuẩn lạc nghi ngờ là của vi khuẩn Bacilus subtilis, dùng que cấy vòng bắt và cấygiữ giống lại trên môi trường TSA nghiêng

MẪU ĐẤT

Dd pha loãng mẫu 10-1

Hút từ mỗi nồng độ pha loãng cho lên đĩa môi trường TSA

Chọn khuẩn điển hình, nhuộm Gram và phản ứng sinh hóa

Giữ giống trên môi trường TSA nghingê

Đồng nhất và pha loãng mẫu

Mẫu 1g mẫu : 9ml dd NaCl 9%

Lần lượt pha loãng các nồng độ tiếp theo

ủ ở 37oC/24h

Sơ đồ 2.1: Phân lập vi khuẩn Bacilus subtilis trong môi trường đất

2.3 Khảo sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn phân lập được:

- Quan sát hình dạng vi khuẩn dưới kính hiển vi

Lấy một ít sinh khối vi khuẩn từ ống TSA làm tiêu bản nhuộm Gram để quan sát dướikính hiển vi, độ phóng đại 1000 lần Các chỉ tiêu quan sát: sự bắt màu, hình dạng, cáchsắp xếp của tế bào vi khuẩn, có hay không có bào tử Sau khi quan sát dưới kính hiển vithấy tiêu bản vi khuẩn phù hợp với những đặc điểm của vi khuẩn, có hay không có bào

tử Sau khi quan sát dưới kính hiển vi nếu thấy tiêu bản vi khuẩn phù hợp với những đặc

Chủng vi khuẩn thuần đã quan sát dưới kính

điểm của Bacilus subtilis(như: là trực khuẩn, hai đầu tròn, G+, bắt màu tím, đứng đơn lẻ

hoặc thành chuỗi ngắn Vi khuẩn có khả năng di động, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn

tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào) thì tiếp tục thử các phản ứng sinh hóa để khẳng định

- Khảo sát các phản ứng sinh hóa của vi khuẩn phân lập được

2.4 Các thí nghiệm về vi khuẩn Bacillus subtilis:

2.4.1 Ảnh hưởng của chế độ sục khí và thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh

enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis :

 Mục đích : xác định thời gian và chế độ nào phù hợp nhất

Sơ đồ 3.1: Định danh vi khuẩn Baccillus subtilis

T h ử p h ả n ứ

Chế độ sục khíí Lô 1: sục khí liên tục Lô 2: không sục khí

Thời gian Hoạt độ amylase Hoạt độ protease Hoạt độ amylase Hoạt độ protease

Sau đó chuẩn bị 2 bình ( cho 1 ống giống), mỗi bình chứa 150ml môi trường TSB cấy

giống Bacilus subtilisvới tỉ lệ 3% cho vòi sục khí vào bình, với thời gian và chế độ sục

khí khác nhau: bình 1 sục khí liên tục, bình 2 không sục khí Lấy mẫu vào các thời điểm24h, 48h Thí nghiệm được trong 48h và ở nhiệt độ phòng và sau đó đọc kết quả

Kiểm tra hoạt độ enzyme vào các thời điểm 24h, 48h ở 2 chế độ nuôi cấy khác nhau

Thí nghiệm được lặp lại 2 lần:

Từ đó chọn được chế độ nuôi cấy vi khuẩn Bacilus subtilis thích hợp, lựa chọn 4 chủng

cho kết quả tốt để tiếp tục khảo sát các thí nghiệm tiếp theo

2.4.2 Ảnh hưởng của môi trường đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn Bacilus subtilis:

 Mục đích: xác định môi trường nuôi cấy thích hợp với các chủng đã chọn ở thí nghiệm1

 Cách làm:

Cấy vi khuẩn từ các ống giống vaò các ống nghiệm chứa 4-5 ml nước muối sinh lí đã hấpkhử trùng đem đo độ đục

Sau đó chuyển vi khuẩn từ các ống nghiệm vào 4 loại môi trường thử nghiệm: Rỉ đường +2% tinh bột, rỉ đường+ 1% tinh bột, TSB + 1% tinh bột, rỉ đường+ 1% tinh bột+ 0.5%pepton với các điều kiện khảo sát:

- Nhiệt độ: nhiệt độ phòng

- Tỉ lệ giống: 3%

- pH =6

- Thời gian nuôi cấy và chế độ được chọn theo kết quả thí nghiệm 1

Sau đó, tiến hành kiểm tra hoạt độ enzyme amylase và protease

Thí nghiệm được lặp lại 2 lần:

Phương pháp kiểm tra hoạt độ enzyme:

- Kiểm tra hoạt độ enzyme amylase bằng phương pháp Wolhgemuth,

Kiểm tra hoạt độ enzyme protease bằng phương pháp Gross+ Fluld

- Sau khi kiểm tra hoạt độ enzyme trên từng loại môi trường tiến hành chọnmôi trường nuôi cấy thích hợp để làm thí nghiệm tiếp theo

Bảng 4.2

Môi trường Hoạt độ enzyme

amylase Hoạt độ enzyme protease Lần 1 Lần 2 Lần 1 Lần 2

Rỉ đường + 2% tinh bột

Rỉ đường + 1 % tinh bột

Rỉ đường + 1 % tinh bột + 0,5% pepton

Cấy vi khuẩn từ các ống giống vào các ống chứa 4- 5 ml nước muối sinh lí đã hấp khửtrùng đem đo độ đục.

Sau đó chuyển vi khuẩn từ các ống nghiệm vào môi trường đã chọn ở thí nghiệm 2 ở các

Ph và thời gian khác nhau với tỉ lệ 3% và nuôi cấy pử chế độ đã chọn ở thí nghiệm 1

Kiểm tra hoạt độ amylase và protease ( thí nghiệm được lặp lại 2 lần )

Các giống vi khuẩn đã chọn ở thí nghiệm 1

Môi trường nhân giống môi trường TSB với điều kiện môi trường đã chọn

Môi trường sản xuất: cám gạo

Sấy khô chế phẩm ở nhiệt độ 40- 50oC

Kiểm tra hoạt độ enzyme protease và amylase

Thời gian 48h, nhiệt độ 37oC

Thu hoạch

2.5.2 Kiểm tra chế phẩm trong thời gian bảo quản:

Chế phẩm được kiểm tra hoạt độ enzyme ở các khoảng thời gian: 10 ngày, 20ngày, 30 ngày theo hai chế độ bảo quản: 4- 1f 0o C và nhiệt độ phòng

2.6 Khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacilus subtilis:

2.6.1 Quan sát đặc điểm khuẩn lạc nghi ngờ là Bacilus subtilis

Sau khi pha loãng mẫu và cấy trang trên môi trường TSA đĩa, ủ 24h, quan sát vàbắt giữ giống những khuẩn lạc có đặc điểm như hình 6.1: khuẩn lạc có bề mặt khô, mọclan trên mặt thạch, dạng tròn, rìa răng cưa không đều, có tâm sẫm màu, màu vàng xám.Tiếp tục làm tiêu bản nhuộm Gram từng chủng vi khuẩn phân lập và quan sát dưới kínhhiển vi ( độ phóng đại x1000 lần ) để khảo sát đặc điểm đặc điểm hình thái

2.6.2 Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Bacilus subtilis:

Nhuộm Gram tiêu bản và quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần,

chúng tôi nhận thấy các chúng vi khuẩn được nghi ngờ có hình thái giống Bacilus

subtilis, là những trực khuẩn bắt màu Gram dương, ngắn, nhỏ, hai đầu tròn, kích thước

0,5-0,8m, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn, có bào tử và bào tử nhỏ hơn tế bào sinhdưỡng

2.6.3 Khảo sát đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn nghi ngờ là

Bacilus subtilis:

Các chủng phân lập có đặc điểm hình thái phù hợp với Baclilus subtilis được chọn làm

một số phản ứng sinh hóa để khẳng định Kết quả được trình bày ở bảng 6.3

Sau khi thử phản ứng sinh hóa của 21 chủng nghi ngờ, chúng tôi xác định được 10

chủng là Bacilus subtilis Tiếp tục chúng tôi tiến hành các thí nghiệm khảo sát khả năng

sinh enzyme amylase và proteasetrong những môi trường và điều kiện cấy khác nhau

của chủng vi khuẩn Bacilus subtilis phân lập được.

Hình 6.2 : Đặc điểm hình thái vi khuẩn Bacilus subtilis