PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS

I.LỜI MỞ ĐẦU:5I.NỘI DUNG:61.Giới thiệu chung:61.1.Một số vi sinh vật thủy phân protein:61.1.1.pseudomonas sp.p :61.1.2.Bacilus sp.p:71.2.Giới thiệu về B. subtilis:71.2.1. Đặc điểm nuôi cấy:81.2.2. Đặc điểm phân bố:81.2.3. Đặc điểm hình thái:81.2.4. Đặc điểm sinh hóa:91.2.5. Cấu trúc kháng nguyên:91.2.6. Ứng dụng:91.2.7.Bào từ:112.Phân lập và tuyển chọn Baccillus subtilis trong đất:112.1.Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn:112.2.Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacilus subtilis122.3.Khảo sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn phân lập được:132.4. Các thí nghiệm về vi khuẩn Bacillus subtilis:142.4.1. Ảnh hưởng của chế độ sục khí và thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis:142.4.2. Ảnh hưởng của môi trường đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn Bacilus subtilis:151.4.3.Khảo sát điều kiện (Ph, thời gian) thích hợp cho sự sản xuất enzyme của các chủng Bacillus subtilis:172.5. Thử nghiệm thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm từ Bacilus subtilis172.5.2. Kiểm tra chế phẩm trong thời gian bảo quản:182.6. Khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacilus subtilis:182.6.1. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc nghi ngờ là Bacilus subtilis182.6.2. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Bacilus subtilis:192.7. Các thí nghiệm222.7.1. Thí nghiệm 1: ảnh hưởng của chế độ sục khí và thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme amylase và protease của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilics phân lập được222.7.2. Thí nghiệm 2: ảnh hưởng của môi tường đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis232.8. Khảo sát thời gian bảo quản chế phẩm sau khi sản xuất253.Đặc tính sinh lísinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis263.1.Thành phần hóa học của vi khuẩn b.subtilis263.1.1.Nước263.1.2.Protein263.1.3.Lipid273.1.4.Glucid273.1.5.Acid nucleic273.1.6.Khoáng283.1.7.Enzyme, độc tố:283.2. Nguồn dinh dưỡng của vi khuẩn B.subtilis283.2.1. Nguồn dinh dưỡng C283.2.2. Nguồn dinh dưỡng N303.2.3.Nguồn dinh dưỡng khoáng313.3.Kiểu dinh dưỡng của B.subtilis333.4.Đặc điểm sinh hóa333.5.Sự hấp thu các chất dinh dưỡng của vi khuẩn bacillus subtilis353.5.1.Sự khuếch tán xúc tiến và khuếch tán bị động353.5.2.Sự vận chuyển chủ động (Active Transport)363.5.3. Sự chuyển vị nhóm (Group Translocation)39IV. Kết luận:40

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BÁO CÁO VI SINH THỰC PHẨM Chủ đề báo cáo: Phân lập tuyển chọn vi sinh vật có khả sản xuất protease dùng để thủy phân protein phế liệu thủy sản Nha Trang-2016 Chủ đề báo cáo: Phân lập tuyển chọn vi sinh vật có khả sản xuất protease dùng để thủy phân protein phế liệu thủy sản Tên chủ đề nghiên cứu: PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS I LỜI MỞ ĐẦU: Hiện toàn cầu, có gần 70 triệu thủy sản chế biến dạng philê, đông lạnh, đóng hộp ngâm tẩm Hầu hết trình thải số lượng lớn loại phụ phẩm phế phẩm Cụ thể, năm 2011, sản lượng khai thác cá ngừ toàn cầu đạt khoảng 4,76 triệu tấn, lượng sản phẩm cá ngừ đóng hộp có gần triệu Chất thải rắn phụ phẩm thải từ sản xuất cá ngừ đóng hộp (bao gồm đầu, xương, nội tạng, mang, phần thịt màu sẫm, vây bụng da) chiếm khoảng 65% lượng nguyên liệu ban đầu Các số liệu báo cáo ngành sản xuất thịt cá ngừ cho thấy phế phẩm, phụ phẩm chiếm khoảng 50% tổng nguyên liệu ban đầu Khi philê cá, sản phẩm đạt thường chiếm khoảng 30-50% so với lượng nguyên liệu ban đầu Sản lượng cá hồi toàn cầu năm 2011 đạt khoảng 1,93 triệu hầu hết sản phẩm dạng philê, sản phẩm báo cáo đạt khoảng 55% tổng khối lượng nguyên liệu Một lượng lớn sản phẩm philê cá rô phi cá tra bán thị trường với hiệu suất philê đạt khoảng 30-37% cho cá rô phi 35% cho cá tra Có thể thấy, ngành chế biến thủy sản tạo lượng đáng kể phế phẩm, phụ phẩm thịt vụn từ thành phần đầu, xương, bụng, gan trứng Đây phận chứa protein chất lượng cao, axit béo omega-3, vi chất dinh dưỡng (như vitamin A, D, riboflavin, niacin) khoáng chất (như sắt, kẽm, selen iốt) Vì vậy, việc tối đa hóa gia trị thặng dư nhằm đảm bảo lợi nhuận tối đa cho doanh nghiệp chế biến vô quan trọng Trong đó, việc tận dụng protein từ phế phẩm thủy sản đem lại giá trị kinh tế cao Với phát triển khoa học công nghệ việc ứng dụng từ vi sinh vật phổ biến vi sinh vật dễ nuôi cấy, vòng đời ngắn, sinh sản nhiều, chi phí thấp… có khả sản xuất protease có hoạt tính cao nhiều ưu hẳn Hiện có nhiều doanh nghiệp thành công việc ứng dụng vi sinh vật thủy phân protein từ phế phẩm thủy sản Thời gian gần đây, số nhà khoa học tiến hành nghiên cứu sử dụng protease chế biến thủy sản nghiên cứu chưa đầy đủ cần tiếp tục Nguồn protease từ vi sinh vật vi khuẩn Bacillus subtilis hướng nghiên cứu có nhiều triển vọng loại vi sinh vật có khả sản xuất protease có hoạt tính cao nhiều ưu hẳn Với chủ đề báo cáo chọn là: “Phân lập tuyển chọn vi sinh vật có khả sản xuất protease dùng để thủy phân protein phế liệu thủy sản”, chúng em chọn chủ đề “Phân lập tuyển chọn vi khuẩn Bacillus subtilis” Đây vi sinh vật có khả thủy phân protein phế liệu thủy sản Đây đề tài nhiều nhà khoa học trẻ nghiên cứu phát triển tương lai I NỘI DUNG: Giới thiệu chung: 1.1 - Một số vi sinh vật thủy phân protein: 1.1.1 pseudomonas sp.p : Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens loài vi khuẩn hình roi gram âm Nó thuộc chi Pseudomonas, dựa vào phân tích 16S rRNA đặt vào nhóm P fluorescens chi Đối với ĐVTS sống: VSV tồn da (nhớt) số - lượng tứ 10 -105 tb/cm2: Pseudomonas fluorescens, Trong trình bảo quản chế biến: VSV nhiễm vào nguyên liệu với số - lượng phụ thuộc vào phương pháp bảo quản chế biến Khi ĐVTS chết, kháng thể không > VSV phát triển mạnh, đặc biệt nhóm Pseudomonas, ươn thối số lượng VSV tăng lên đến 107-1010tb/gam 1.1.2 Bacilus sp.p: - Từ bacillus nhằm miêu tả hình dáng nhóm vi khuẩn quan sát kính hiển vi Nó xuất phát từ tiếng Latin có nghĩa hình que Do đó, số nơi gọi - khuẩn que trực khuẩn Tuy nhiên, Bacillus (viết hoa in nghiêng) tên chi gồm vi khuẩn hình que, Gram dương, hiếu khí thuộc họ Bacillaceae Firmicutes Trong đó, B subtilis chủng ứng dụng phổ biến thủy phân protein phế phẩm thủy sản 1.2 Giới thiệu B subtilis: 1.2.1 Đặc điểm -Điều kiện phát triển : hiếu khí, nhiệt độ tối ưu: 370C nuôi cấy: - Điều kiện oxi: B subtilis vi khuẩn hiếu khí có khả phát triển môi trường thiếu oxi - Độ Ph: thích hợp Ph= 7.0- 7.4 - Môi trường thạch đĩa TSA: khuẩn lạc có dạng hình tròn, rìa cưa không đều, tâm sẫm màu, phát triển chậm, màu vàng xám, đường kính: 3-5 mm sau 1-4 ngày, bề mặt nhăn nheo, màu sẫm - Môi trường thạch nghiêng TSA: dễ mọc, tạ thành màu xám, rìa gợn sóng - Môi trường canh TSB: B.subtilis phát triển làm đục môi trường, tạo màng nhăn, lắng cạn, kết lại vầng mây đáy, khí tan - Dinh dưỡng cần nguyên tố: C, H, O, N nguyên tố khác… 1.2.2 Đặc điểm phân bố: -Vi khuẩn B.subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc đường ruột, chúng phân bố hầu hết tự nhiên: cỏ khô, bụi, đất, nước,… -Phần lớn chúng tồn đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng: 10- 100 triệu CFU/ gam -Đất nghèo dinh dưỡng sa mạc, đất hoang B subtilis -Nước bùn cửa sông nước biển có tồn bào tử tế bào sinh dưỡng B.subtilis 1.2.3 Đặc điểm hình thái: -B.subtilis vi khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, Gram dương, kích thước 0.5- 0.8 x 1.8- 3.0µ, đứng thành chuỗi ngắn đơn lẻ, di động 8- 12 lông -Sinh bào tử nhỏ vi khuẩn nằm tế bào, kích thước 0.8- 1.8 µm, phát triển cách nảy mầm nứt bào tử, không kháng acid, có khả chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ 1.2.4 Đặc điểm sinh hóa: - Lên men không sinh hơi: loại đường glucose, maltose, manitol, saccarose, xylose, arabinose - Indol(-), nitrat (-), VP (+), H2S(-), NH3 (+), catalase(+) , amylase (+), casein(+), citrat(+) có khả di động hiếu khí - dung huyết: số dòng gây dung huyết dạng thạch máu ngựa thỏ tác động hymolysine 1.2.5 Cấu trúc kháng nguyên: - B.subtilis có kháng nguyên H, O cấu trúc kháng nguyên D, L- acid glutamic - Sản sinh kháng sinh subtiline baccitracin có tác dụng ức chế vi khuẩn G+ G-, - Bệnh học: đa số chủng B.subtilis không gây bệnh 1.2.6 Ứng dụng: - Bacillus subtilis sản xuất enzyme công nghiệp Theo thống kê, Bacillus subtilis sản xuất số lượng 50% tổng số enzyme cung cấp cho lĩnh vực công nghiệp enzyme thực phẩm, tẩy rửa, dệt may, da, giấy, thuốc men… - Ứng dụng vi khuẩn Bacillus subtilis lĩnh vực kiểm soát sinh học Bacillus subtilis dùng để kiểm soát sinh học bệnh thực vật, giúp ngăn ngừa điều trị nhiều loại bệnh trồng bệnh phấn trắng, sương giá, bệnh nấm … - Bacillus subtilis ứng dụng sinh học phân tử vi sinh vật học Bacillus subtilis biểu 200 loại gen khác nên sử dụng thí nghiệm biến đổi gen, chuyển gen … - Ứng dụng vi khuẩn Bacillus subtilis phụ gia thực phẩm Bacillus subtilis phép sử dụng thực phẩm vi không gây độc hại, cải thiện chức đường ruột động vật, thúc đẩy tăng trưởng động vật ngăn ngừa bệnh tật Bacillus subtilis sinh bào tử xâm nhập dễ dạng vào đường ruột động vật mà không bị dịch vị axit tiêu diệt, phần ruột bào tử phục hồi nảy mầm đồng thời tiết hàng hoạt enzyme có hoạt tính sinh học cao protease, lipase, amylase, góp phần vào việc tiêu hóa thức ăn Ngoài sản xuất peptide đối kháng, kìm hãm vi khuẩn gây bênh thối ruột phát triển Do Bacillus subtilis hiếu khí nên tiêu thụ oxy ruột ức chế các vi khuẩn kỵ khí phát triển - Bacillus subtilis sử dụng lĩnh vực y tế sức khỏe Các nghiên cứu vi khuẩn Bacillus subtilis sử dụng để điều trị viêm ruột, viêm phế quản tiêu chảy bệnh khác, để phòng ngừa điều trị nhiễm trùng vết bỏng - Bacillus subtilis lĩnh vực nuôi trồng thủy sản Trong nuôi trồng thủy sản, Bacillus subtilis protease enzym kháng sinh, phân giải chất lượng lớn thức ăn sót lại, chất tiết, chất thải, phế thải động vật thực vật loại khí độc hại (amoniac, hydrogen sulfide vv ), Chúng phân giải chất có phân tử lượng lớn thành phân tử nhỏ va cuối tạo thành carbon dioxide, nitrat sunfat, vv, làm giảm COD nước, BOD, cải thiện chất lượng nước Chúng cung cấp chất dinh dưỡng cho tảo tảo đơn bào chủ yếu để thúc đẩy sinh sản, thực vật phù du quang hợp, cung cấp oxy lại cho vật nuôi tạo thành chu trình sinh thái lành mạnh Ngoài ra, chúng tiết loại enzyme thuốc kháng sinh ức chế tăng trưởng vi khuẩn khác làm giảm chí loại bỏ 10 tác nhân gây bệnh động vật thủy sản Ngày có nhiều nghiên cứu cho thấy vai trò quan trọng B subtilis nuôi trồng thủy sản I.2.7 Bào từ: – Bào tử Bacillus subtilis có dạng elip đến hình cầu, có kích thước 0,6 – 0,9 µm x 1,0 – 1,5 µm, bao bọc nhiều lớp màng với thành phần lipoprotein, peptidoglycan… - Bào tử chúng có khả chịu pH thấp dày, tiến đến ruột nảy mầm phần đầu ruột non Đây đặc điểm quan trọng ứng dụng sản xuất - probiotic từ Bacillus subtilis (Nguyễn Duy Khánh, 2006) Khả tạo bào tử: Nhờ khả tạo bào tử mà vi khuẩn tồn điều kiện bất lợi (dinh dưỡng môi trường cạn kiệt, môi trường tích lũy sản phẩm trao đổi chất có hại nhiệt độ cao…) – Quá trình hình thành bào tử gồm bước sau: + Hình thành búi chất nhiễm sắc; + Tạo tiền bào tử; + Tiền bào tử hình thành hai lớp mảng, tăng cao tính xạ; + Tổng hợp lớp vỏ bào tử; + Giải phóng bào tử.; + Khi gặp điều kiện thuận lợi bào tử nảy mầm, phát triển thành tế bào sinh dưỡng Phân lập tuyển chọn Baccillus subtilis đất: 2.1 Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn: 24 Kết trình bày bảng 8.1 Bảng 8.1: khảo sát thời gian nhiệt độ bảo quản chế phẩm 4-10oC Nhiệt độ Thời gian 30-37oC ngày Hoạt amilase 56 độ Hoạt protease 38 độ Hoạt amilase 56 độ Hoạt protease 38 10 ngày 5.25 0.0 4.75 0.0 20 5.25 0.0 4.25 0.0 30 ngày 5.0 0.0 4.5 0.0 độ Từ kết bảng cho thấy điều kiện bảo quản lạnh hoạt độ hai loại enzyme cao so với điều kiện bảo quản thường hoạt độ hai loại enzyme giảm nhanh sau 10 ngày bảo quản kết xử lí thống kê cho thấy kết cụ thể cho loại enzyme Với enzyme protease kết thống kê cho thấy khác biệt có ý nghia hai nhiệt độ thời gian bảo quản Qua kết có giảm đáng kể hoạt độ enzyme khoảng thời gian 10 ngày bảo quản, khảo sát cho thấy cám gạo chất thích hợp cho chế phẩm enzyme protease Đặc tính sinh lí-sinh hóa vi khuẩn Bacillus subtilis 3.1 Thành phần hóa học vi khuẩn b.subtilis Thành phần hóa học B.subtilis xác định kỹ thuật phân tích hóa học Bao gồm thành phần sau: 3.1.1 Nước − − Nước chiếm 80%-90% trọng lượng khô tế bào Có loại nước chính: 25 + Nước tự do: nước tham gia vào trình trao đổi chất, có khả hòa tan chất, có khả di chuyển + Nước liên kết: nước tham gia tạo liên kết với chất đa phân tử Loại nước không tham gia vào hoạt động trao đổi chất tế bào − Nếu tế bào thiếu nước tự vi khuẩn B.subtilis bị ức chế, phản ứng sinh hóa nội bào không xảy  trao đổi chất trao đổi lượng không diễn  trình sinh trưởng phát triển bị gián đoạn − Tế bào nước liên kết vi khuẩn bị chết liên kết, cấu trúc tế bào bị phá vỡ 3.1.2 Protein Protein chiếm khoảng 50-70% trọng lượng khô tế bào vi khuẩn Có loại: + Protein đơn giản: thành phần có acid amin + Protein phức tạp: acid amin chứa thành phần khác − Protein đóng nhiều vai trò quan trọng tế bào: tham gia xây dựng cấu trúc, − − xú tác cho phản ứng sinh hóa, vận chuyển chất dinh dưỡng, … − Các yếu tố làm biến tính protein: nhiệt độ, pH, cồn, … + Biến tính thuận nghịch: bị ức chế dẫn đến chức protein thực bị đình + Biến tính không thuận nghịch: chức không phục hồi dẫn đến tế bào bị chết 3.1.3 Lipid Chiếm 3-10% trọng lượng khô tế bào vi khuẩn Có loại: + Lipid đơn giản: thành phần gồm acid béo glycerol + Lipid phức tạp: bao gồm acid béo, glycerol thành phần khác − Vai trò lipid: tham gia cấu trúc tế bào, dự trữ lượng(hạt dự trữ) − − 3.1.4 Glucid − − − Chiếm 10-30% trọng lượng khô tế bào vi khuẩn Có loại: glucid đơn giản glucid phức tạp Vai trò: tham gia cấu trúc tế bào dự trữ lượng 26 3.1.5 Acid nucleic − − − Có loại: AND ARN Cấu tạo: đường ribose, H3PO4, base nito Chức lưu giữ truyền thông tin di truyền 3.1.6 Khoáng − Trong tế bào vi khuẩn có loại khoáng đa lượng vi lượng + Khoáng đa lượng: P, S, Ca+, Mg+, … xây dựng cấu trúc tế bào, thành + phần enzyme, trì đặc tính keo, … Khoáng vi lượng: Zn, Al, Co, … tham gia vào cấu trúc enzyme  xúc tác phản ứng sinh hóa, thúc đẩy sinh trưởng phát triển vi sinh vật 3.1.7 Enzyme, độc tố: − − Có loại: nội bào ngoại bào Độc tố: ngoại độc tố ( vi khuẩn G+) – chất protein 3.2 Nguồn dinh dưỡng vi khuẩn B.subtilis 3.2.1 Nguồn dinh dưỡng C Là nguồn vật chất cung cấp C trình sinh trưởng vi sinh vật Trong tế bào nguồn C trải qua loạt trình biến hoá hoá học phức tạp biến thành vật chất thân tế bào sản phẩm trao đổi chất C chiếm đến khoảng nửa trọng lượng khô tế bào Đồng thời hầu hết nguồn C trình phản ứng sinh hoá sinh tế bào nguồn lượng cần thiết cho hoạt động sống vi sinh vật Một số vi sinh vật dùng CO2 làm nguồn C hay chủ yếu để sinh trưởng, nguồn C nguồn sinh lượng Vi sinh vật sử dụng cách chọn lọc nguồn C Đường nói chung nguồn C nguồn lượng tốt cho vi sinh vật Nhưng tuỳ loại đường mà vi sinh vật có khả sử dụng khác Ví dụ môi trường chứa glucose galactose vi khuẩn Escherichia coli sử dụng trước glucose (gọi nguồn C tốc hiệu) galactose sử dụng sau (gọi nguồn C trì hiệu) Hiện sở lên men 27 công nghiệp người ta sử dụng nguồn C chủ yếu glucose, saccharose, rỉ đường (phụ phẩm nhà máy đường) tinh bột (bột ngô, bột khoai sắn ), cám gạo, nguồn cellulose tự nhiên hay dịch thuỷ phân cellulose Năng lực đồng hoá nguồn C vi sinh vật khác không giống Có loài có khả sử dụng rộng rãi nhiều nguồn C khác nhau, có loài khả chọn lọc Chẳng hạn vi khuẩn Pseudomonas đồng hoá tới 90 loại hợp chất C, vi khuẩn thuộc nhóm dinh dưỡng methyl (methylotrophs) đồng hoá hợp chất 1C methanol, methane Nguồn C chủ yếu vi sinh vật sử dụng gồm có đường, acid hữu cơ, rượu, lipid, hydrocarbon, CO2, carbonat (Bảng 13.4) Bảng 13.4: Nguồn C vi sinh vật sử dụng Nguồn C Các dạng hợp chất Đường glucose, fructose, maltose, saccharose, tinh bột, galactose, lactose, mannite, cellobiose, cellulose, hemicellulose, chitin Acid hữu acid lactic, acid citric, acid fumaric, acid béo bậc cao, acid béo bậc thấp, aminoacid Rượu Ethanol Lipid lipid, phospholipid Hydrocarbon khí thiên nhiên, dầu thô, dầu paraffin Carbonate NaHCO3, CaCO3, đá phấn Các nguồn C Hợp chất nhóm thơm, cyanide, protein, pepton, acid nucleic khác 28 3.2.2 Nguồn dinh dưỡng N Nguồn N nguồn cung cấp N cho vi sinh vật để tổng hợp nên hợp chất chứa N tế bào Thường không nguồn lượng, số vi sinh vật tự dưỡng (thuộc nhóm ammon hoá-ammonification, nhóm nitrate hoá- nitrification) dùng muối ammone, muối nitrate làm nguồn lượng Trong điều kiện thiếu nguồn C số vi sinh vật kỵ khí điều kiện oxy sử dụng số aminoacid làm nguồn lượng Nguồn N thường vi sinh vật sử dụng protein sản phẩm phân huỷ protein ( peptone, peptide, aminoacid ), muối ammone, nitrate, N phân tử (N2), purine, pyrimidine, urea, amine, amide, cyanide (bảng 13.7) Nguồn N vi sinh vật sử dụng Nguồn N Các dạng hợp chất Protein sản peptone, peptide, aminoacid (một số vi sinh vật tiết men phẩm phân giải proteinase phân giải protein thành hợp chất phân tử nhỏ protein hấp thu vào tế bào) Ammone muối NH3, (NH4)2SO4, (dễ hấp thu) ammone Nitrate KNO3 (dễ hấp thu) N phân tử N2 (với vi sinh vật cố định N) Các nguồn N khác purine, pyrimidine, urea, amine, amide, cyanide (chỉ số nhóm vi sinh vật đồng hoá được) 3.2.3.Nguồn dinh dưỡng khoáng Các muối vô nguồn chất dinh dưỡng thiếu sinh trưởng vi sinh vật Chúng có chức sinh lý chủ yếu là: tham gia vào thành phần 29 trung tâm hoạt tính enzyme vi sinh vật, trì tính ổn định kết cấu cá đại phân tử tế bào, điều tiết trì cân áp suất thẩm thấu tế bào, khống chế điện oxy hoá khử tế bào nguồn vật chất sinh lượng số loài vi sinh vật (bảng 13.8) Bảng 13.8: Muối vô chức sinh lý chúng Nguyên tố Hợp chất sử Chức sinh lý dụng Là thành phần acid nucleic, nucleoprotein, P KH2PO4, phospholipid, coenzyme, ATP Làm nên hệ thống K2HPO4 đệm giúp điều chỉnh pH môi trường Là thành phần aminoacid chứa S, số S (NH4)2SO4, vitamin; glutathione có tác dụng điều chỉnh điện MgSO4 oxy hoá khử tế bào Là thành phần trung tâm hoạt tính enzyme phosphoryl hoá hexose, dehydrogenase acid Mg MgSO4 isocitric, polymerase acid nucleic, thành phần chlorophyll bacterio-chlorophyll Tạo tính ổn định số cofactor, enzyme trì, Ca CaCl2, cần cho dựng trạng thái cảm thụ tế bào Ca(NO3)2 Thành phần hệ thống chuyển vận tế bào, Na NaCl trì áp suất thẩm thấu, trì tính ổn định số enzyme Là cofactor số enzyme, trì áp suất thẩm K KH2PO4, thấu tế bào, nhân tố ổn định ribosome 30 KH2PO4 số vi khuẩn ưa mặn Thành phần sắc tố vi khuẩn số enzyme, vật chất nguồn lượng số vi khuẩn sắt, Fe FeS04 cần thiết để tổng hợp chlorophyll độc tố vi khuẩn bạch hầu Trong trình sinh trưởng vi sinh vật cần tới số nguyên tố vi lượng Những nguyên tố có vai trò quan trọng cần với số lượng nhỏ, khoảng 10-8-10-6 mol/ L môi trường nuôi cấy Nguyên tố vi lượng tham gia vào thành phần enzyme làm hoạt hoá enzyme (Bảng 13.9) Bảng 13.9: Tác dụng sinh lý nguyên tố vi lượng Nguyên tố Zn Tác dụng sinh lý Có mặt alcohol dehydrogenase, lactodehydrogenase, phosphatase kiềm, ARNpolymerase, ADNpolymerase Mn Có mặt peroxyd dismutase, carboxylase ciitric synthetase Mo Có mặt reductase nitrate, nitrogenase, dehydrogenase formic Se Có mặt reductase glycin, reductase formic Co Có mặt mutase glutamic Cu Có mặt cytochrome oxydase 31 W Có mặt dehydrogenase formic Br Có mặt urease, cần cho sinh trưởng vi khuẩn hydrogen Nếu thiếu nguyên tố vi lượng trình sinh trưởng hoạt tính sinh lý vi sinh vật bị giảm sút, chí ngừng sinh trưởng Do nhu cầu dinh dưỡng vi sinh vật không giống khái niệm nguyên tố vi lượng chi có ý nghĩa tương đối Vi sinh vật thường tiếp nhận nguyên tố vi lượng từ chất dinh dưỡng hữu thiên nhiên, hoá chất vô cơ, nước máy hay từ dụng cụ nuôi cấy thuỷ tinh Chỉ trường hợp đặc biệt cần bổ sung nguyên tố vi lượng vào môi trường nuôi cáy vi sinh vật Vì nhiều nguyên tố vi lượng kim loại nặng dư thừa gây hại cho vi sinh vật Khi cần bổ sung thêm nguyên tô vi lượng vào môi trường cần lưu ý khống chế xác liều lượng 3.3 − Dị dưỡng hóa (chemoorganohetero-trophy) 3.4 − Kiểu dinh dưỡng B.subtilis Đặc điểm sinh hóa Lên men không sinh loại đường như: glucose, maltose, manitol, saccharose, xylose arabinose − Thử nghiệm indol (-), VP (+), nitrate (+), H2S (-), NH3 (+), catalase (+), amylase (+), casein, (+), citrate (+), có khả di động (+) hiếu khí (+) − Trao đổi chất tổng phản ứng sinh hóa tế bào thực gồm loại: + Các phản ứng giải phóng lượng + Các phản ứng thu lượng • Tạo ATP từ chu trình đường phân: 32 3.5 Sự hấp thu chất dinh dưỡng vi khuẩn bacillus subtilis 3.5.1 Sự khuếch tán xúc tiến khuếch tán bị động Một số chất, glycerol, qua màng tế bào chất theo phương thức Khuyếch tán bị động (Passive diffusion), việc chất dinh đưỡng chuyển từ chỗ có nồng độ cao đến chỗ có nồng độ thấp Khuyếch tán bị động muốn làm cho tế bào hấp thụ có hiệu số chất dinh dưỡng cần có nồng độ chất bên tế bào cao 33 bên Tốc độ hấp thu tùy theo lúc tế bào tăng lượng hấp thu chất mà giảm xuống Trừ phi loại chất dinh dưỡng sau xâm nhập tế bào sử dụng không làm nâng cao nồng độ chất tế bào Chỉ có nước (H 2O), O2 CO2, phân tử nhỏ thường vận chuyển qua màng phương thức khuếch bị động Các phân tử tương đối lớn hơn, ion chất có tính cực (polar substances) khó qua màng sinh chất băng phương thức khuếch tán bị động Hình : Khuếch tán bị độngvà khuếch tán xúc tiến Protein mang (carrier protein) gọi enzim permease loại protein gắn màng Với hỗ trợ permease nâng cao nhiều tốc độ khuếch tán qua màng có tính thẩm thấu chọn lọc Phương thức vận chuyển qua màng với hỗ trợ permease gọi khuếch tán xúc tiến (facilitated diffusion) Tốc độ trình khuếch tán xúc tiến tăng lên chênh lệch nồng độ chất dinh dưỡng tế bào tăng lên Khi nồng độ chất dinh dưỡng tương đối thấp khuôn khổ tăng lên cao so với phương thức khuếch tán bị động Lúc gradient nồng độ đạt tới trị số định dẫn đến hiệu ứng bão hòa Sự tham gia Permease làm dẫn đến hiệu ứng bão hòa Đáng ý là, lúc permease bị bão hòa, khuếch tán xúc tiến không tăng lên tăng mức chênh lệch chất dinh dưỡng tế bào 34 Hình 13.8 Một kiểu Khuếch tán xúc tiến 3.5.2 Sự vận chuyển chủ động (Active Transport) − Đặc điểm: + Là phương thức vận chuyển phân tử chất hòa tan tới nơi có nồng độ cao hơn, ngược lại với gradient nồng độ + Cần tiêu hao lượng + Cần protein vận chuyển (permease) Các phân tử chất hòa tan có tính chất tương tự liên kết với permease trường hợp-khuếch tán xúc tiến vận chuyển chủ động + Các phân tử hòa tan vận chuyển qua màng không biến đổi 35 Hình : protein vận chuyển có khả kết hợp với ATP 36 − Cơ chế: Vùng xuyên màng hình thành lỗ nhỏ màng Permease kết hợp với chất hòa tan thủy phân ATP  ADP làm thay đổi cấu hình, chất hòa tan chuyển vào màng Khi chất hòa tan giải phóng, protein vận chuyển màng trở trạng thái đầu để tiếp tục trình vận chuyển Hình : Tác dụng gradient proton natri vận chuyển chủ động 1- Proton bơm màng sinh chất vận chuyển điện tử 2-Gradient proton thông qua chế vận chuyển ngược hướng (antiport mechanism) đẻ đẩy ion natri 3- Ion natri liên kết với phức hợp protein mang (carrier protein complex) 37 4-Điểm kết hợp với chất hòa tan (dung chất) biến đổi hình dạng gắn với dung chất (đường aminoacid) 5-Cấu hình protein mang (carrier) thay đổi, ion natri chuyển vào tế bào sau dung chất rời khỏi protein mang 3.5.3 Sự chuyển vị nhóm (Group Translocation) Trong việc vận chuyển chủ động, phân tử hòa tan vận chuyển qua màng mà không cần cải biến Trong trình vật chất vận chuyển có phát sinh biến hóa hóa học Hệ thống chuyển vị nhóm quen biết Phosphoenolpyruvate: hệ thống phosphotransferase đường (PTS) Tế bào vi khuẩn bị phosphoryl hóa sử dụng phosphoenolpyruvate (PEP) làm thể cho phosphate: PEP + Đường (ngoại bào) → Pyruvate + Đường + P (nội bào) + PET phức tạp, vi khuẩn B.subtilis PTS tạo thành enzym (EI EII) protein ổn định nhiệt có phân tử lượng thấp (HPr) HPr Enzym EI tồn tế bào chất Enzym EII có nhiều biến hóa cấu trúc, thường hợp thành tiểu đơn vị (subunits) hay vùng kết cấu (domains), EIIA (trước gọi EIII) protein tế bào chất hòa tan, EIIB protein ưa nước (hydrophilic), EIIC protein kỵ nước nằm màng tế bào, hai loại sau thường kết hợp lại với + Trong trình vận chuyển, tác dụng EI HPr phosphate cao từ PEP chuyển đến enzym EII với giúp đỡ Enzym I HPr Sau EII đưa phân tử đường qua màng vào tế bào phosphoryl hóa EII vận chuyển chuyên hóa loại đường hệ thống PTS khác có EII khác nhau, EI HPr giống hệ thống PTS 38 Hình : Chuyển vị nhóm Vi khuẩn Bacillus có hai hệ thống Đường phân (Glycolyse) PTS Nhiều carbohydrate vận chuyển hệ thống Ngoài vai trò dùng để vận chuyển, protein PTS quan cảm thụ hóa học - cảm thụ khí trình hóa hướng động IV Kết luận: Vi khuẩn Bacillus subtilis vi khuẩn có khả sản xuất protease với hoạt tính cao phân lập từ tự nhiên có khả thủy phân protein từ phế liệu thủy sản Nguồn protease từ vi sinh vật vi khuẩn Bacillus subtilis hướng nghiên cứu có nhiều triển vọng có khả ứng dụng cao loại vi sinh vật có khả sản xuất protease có hoạt tính cao nhiều ưu ... thái: -B.subtilis vi khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, Gram dương, kích thước 0. 5- 0.8 x 1. 8- 3.0µ, đứng thành chuỗi ngắn đơn lẻ, di động 8- 12 lông 8 -Sinh bào tử nhỏ vi khuẩn nằm tế bào, kích thước 0. 8-. .. điểm - iều kiện phát triển : hiếu khí, nhiệt độ tối ưu: 370C nuôi cấy: - Điều kiện oxi: B subtilis vi khuẩn hiếu khí có khả phát triển môi trường thiếu oxi - Độ Ph: thích hợp Ph= 7. 0- 7.4 - Môi... phóng xạ 1.2.4 Đặc điểm sinh hóa: - Lên men không sinh hơi: loại đường glucose, maltose, manitol, saccarose, xylose, arabinose - Indol (-) , nitrat (-) , VP (+), H2S (-) , NH3 (+), catalase(+) , amylase