Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn acetic chịu nhiệt từ hạt ca cao lên men

Vi khuẩn acetic có vai trò quan trọng trong quá trình lên men acid acetic nhằm sản xuất nhiều sản phẩm có ích trong công nghiệp và đời sống. Nghiên cứu nhằm mục đích phân lập và tuyển chọn vi khuẩn acetic có khả năng chịu nhiệt và lên men acid từ ca cao. Các chủng vi khuẩn phân lập được đánh giá khả năng sinh acid và chịu nhiệt đến 43°C. Các chủng tuyển chọn được định danh đến mức độ loài bằng kỹ thuật sinh học phân tử. Kết quả đã phân lập được 16 chủng vi khuẩn acetic (AAB) từ 7 mẫu hạt ca cao lên men ở Bến Tre và Tiền Giang. Sơ tuyển được 10 chủng có đường kính vùng sáng trong khoảng 19-23 mm sau 48 giờ ủ ở 37°C trên môi trường bromocresol green ethanol agar. Kết quả cho thấy cả 10 chủng phân lập đều có khả năng phát triển ở nhiệt độ 43°C trên môi trường YPGD chứa 4% (v/v) ethanol. Tuyển chọn được 3 chủng AAB chịu nhiệt có khả năng lên men acid tốt là BT1H, BT2B1 và TG1D1 với nồng độ acid acetic đạt được sau 5 ngày lên men ở 37°C lần lượt là 4,45; 3,95 và 3,85% (w/v). Chủng BT2B1 được định danh là Acetobacter pasteurianus, chủng BT1H và TG1D1 được xác định là Acetobacter tropicalis.

Khoa học Kỹ thuật Công nghệ Phân lập tuyển chọn vi khuẩn acetic chịu nhiệt từ hạt ca cao lên men Huỳnh Xuân Phong1, Nguyễn Minh Tiến1, Nguyễn Ngọc Thạnh1, Toshiharu Yakushi2, Kazunobu Matsushita2, Ngô Thị Phương Dung1, Bùi Hoàng Đăng Long1* Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ Khoa Nông nghiệp, Đại học Yamaguchi, Nhật Bản Ngày nhận 23/8/2019; ngày chuyển phản biện 26/8/2019; ngày nhận phản biện 26/9/2019; ngày chấp nhận đăng 1/11/2019 Tóm tắt: Vi khuẩn acetic có vai trò quan trọng q trình lên men acid acetic nhằm sản xuất nhiều sản phẩm có ích cơng nghiệp đời sống Nghiên cứu nhằm mục đích phân lập tuyển chọn vi khuẩn acetic có khả chịu nhiệt lên men acid từ ca cao Các chủng vi khuẩn phân lập đánh giá khả sinh acid chịu nhiệt đến 43°C Các chủng tuyển chọn định danh đến mức độ loài kỹ thuật sinh học phân tử Kết phân lập 16 chủng vi khuẩn acetic (AAB) từ mẫu hạt ca cao lên men Bến Tre Tiền Giang Sơ tuyển 10 chủng có đường kính vùng sáng khoảng 19-23 mm sau 48 ủ 37°C môi trường bromocresol green ethanol agar Kết cho thấy 10 chủng phân lập có khả phát triển nhiệt độ 43°C môi trường YPGD chứa 4% (v/v) ethanol Tuyển chọn chủng AAB chịu nhiệt có khả lên men acid tốt BT1H, BT2B1 TG1D1 với nồng độ acid acetic đạt sau ngày lên men 37°C 4,45; 3,95 3,85% (w/v) Chủng BT2B1 định danh Acetobacter pasteurianus, chủng BT1H TG1D1 xác định Acetobacter tropicalis Từ khóa: Acetobacter pasteurianus, Acetobacter tropicalis, phân lập, tuyển chọn vi khuẩn acetic chịu nhiệt Chỉ số phân loại: 2.8 Đặt vấn đề Acid acetic nguyên liệu sử dụng phổ biến cho ngành công nghiệp thực phẩm sản xuất giấm, rau muối chua, công nghiệp nhuộm, in, chế biến mủ cao su, công nghiệp tổng hợp hữu Từ hàng kỷ trước, lên men acid acetic hay gọi lên men giấm biết trình lên men tự nhiên từ dịch chứa ethanol nhóm vi khuẩn lên men acid acetic quan trọng gọi chung vi khuẩn acid acetic (acetic acid bacteria - AAB) [1] Các vi khuẩn lên men acid acetic phát Acetobacter aceti (Beijerinck năm 1898) Gluconobacter suboxydans (Kluyver de Leeuw năm 1924) gọi chung nhóm vi khuẩn acid acetic (AAB) [2] Hiện nay, nhà khoa học phân loại nhóm AAB thuộc họ Acetobacteraceae với 10 giống: Acetobacter, Gluconobacter, Acidomonas, Gluconacetobacter, Asaia, Kozakia, Swaminathania, Saccharibacter, Neoasaia Granulibacter [3, 4] Trong đó, Acetobacter Gluconobacter sử dụng lên men acid acetic phổ biến chúng có khả oxy hóa rượu tạo acid acetic với nồng độ cao Trong năm gần đây, việc gia tăng nhiệt độ toàn cầu dẫn đến số thách thức nghiêm trọng việc lên men với quy mơ cơng nghiệp hệ thống làm lạnh lớn tiêu tốn nhiều lượng để giữ nhiệt độ tối ưu Nhiệt độ thích hợp cho trình lên men acid acetic khoảng 30oC q trình lên men ln giữ ổn định để đảm bảo trình lên men tối ưu Nhiệt độ gia tăng thêm khoảng 2-3oC nguyên nhân gây bất lợi không cho mức độ lên men mà ảnh hưởng đến hiệu lên men [2, 5] Vì vậy, việc phân lập tuyển chọn dòng vi khuẩn chịu nhiệt lên men acid acetic thu hút nhiều quan tâm nhà khoa học [2, 6-8] Qua tiến tới quy trình sản xuất giấm sản phẩm lên men từ AAB quy mô công nghiệp, mang lại hiệu kinh tế cao cho nhà sản xuất giảm giá thành cho người tiêu dùng Bên cạnh đó, việc phân lập định danh dòng AAB góp phần làm phong phú thêm nguồn đa dạng sinh học, đặc biệt nguồn vi sinh vật Q trình lên men ca cao có tham gia nấm men, sau vi khuẩn nhiệt độ thùng ủ thay đổi trình ủ, có tham gia vi khuẩn acetic chuyển hóa rượu thành acid acetic [9] Sản phẩm ca cao lên men tốt nhiệt độ cao, đến 40-45oC [10] *Tác giả liên hệ: bhdlong@ctu.edu.vn 62(3) 3.2020 54 Khoa học Kỹ thuật Công nghệ Isolation and selection of thermotolerant acetic acid bacteria from fermented cocoa beans Xuan Phong Huynh1, Minh Tien Nguyen1, Ngoc Thanh Nguyen1, Toshiharu Yakushi2, Kazunobu Matsushita2, Thi Phuong Dung Ngo1, Hoang Dang Long Bui1* Biotechnology Research and Development Institute, Can Tho University Faculty of Agriculture, Yamaguchi University, Japan Received 23 August 2019; accepted November 2019 Abstract: Acetic acid bacteria (AAB) play an important role in the acetic acid fermentation in order to manufacture many useful products The aim of this study was to isolate and select the thermotolerant acetic acid bacteria from fermented cocoa beans with high acid production Acid acetic bacterial isolates were evaluated the acid production capacity and thermotolerant ability up to 43°C The selected isolates were identified at species level using molecular techniques As the result, 16 strains of AAB were isolated from samples of fermented cocoa beans collected from Ben Tre and Tien Giang provinces Ten isolates had high acid-producing yeild with the diameter of yellow zone (19-23 mm) after 48 hours at 37°C on the bromocresol green ethanol agar medium These 10 isolates could also grow at 43°C on the YPGD agar medium (added with 4.0% (v/v) of ethanol) Three thermotolerant isolates including BT1H, BT2B1, and TG1D1 were selected due to their good performances during fermentation with the concentrations of total acid produced at 4.45, 3.95, and 3.85% (w/v) respectively after days of fermentation at 37°C The isolate BT2B1 was identified as Acetobacter pasteurianus while BT1H and TG1D1 were Acetobacter tropicalis Keywords: Acetobacter pasteurianus, Acetobacter tropicalis, isolation, selection of thermotolerant acetic acid bacteria Classification number: 2.8 62(3) 3.2020 Vấn đề ấm lên toàn cầu ảnh hưởng lớn đến trình chuyển hóa sinh học, đặc biệt lên men acid acetic vi khuẩn acid acetic nhạy cảm với nhiệt độ (tối ưu 30oC [2]) Từ cho thấy trình lên men ca cao nhiệt độ cao nguồn tiềm để phân lập loài vi khuẩn acetic chịu nhiệt Nghiên cứu nhằm phân lập, tuyển chọn xác định hình thái, đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt phân lập từ ca cao lên men Vật liệu phương pháp nghiên cứu Nguyên vật liệu hóa chất Mẫu hạt ca cao lên men thời điểm 2-4 ngày trình lên men thu từ tỉnh Bến Tre, Tiền Giang trữ nhiệt độ 2-8oC Môi trường YPGD (yeast extract g/l, peptone g/l, glycerol g/l, D-glucose g/l) môi trường PM (5 g/l D-glucose, 20 g/l glycerol, 10 g/l yeast extract, 10 g/l peptone, 10% (v/v) dịch trích khoai tây) [8] Mơi trường bromocresol green ethanol agar (ethanol 0,2%, yeast extract 0,3%, bromocresol green 0,01%) [8] Các hóa chất khác: CaCO3, ethanol, phenolphthalein, NaOH… Merck (Đức) HiMedia Laboratories (Ấn Độ) Phương pháp nghiên cứu Phân lập xác định đặc điểm hình thái sinh hóa vi khuẩn acetic: Cân g mẫu cho vào bình tam giác có sẵn 50 ml nước cất vơ trùng pha lỗng mẫu nồng độ 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 10-5 Sau đó, cấy trải mơi trường YPGD agar có bổ sung 4% (v/v) ethanol, 2% (w/v) agar 0,5% (w/v) CaCO3 Ủ hiếu khí 37oC 24-48 [2] Quan sát lựa chọn khuẩn lạc tạo vòng halo môi trường AAB Khuẩn lạc AAB tạo vòng sáng xung quanh vi khuẩn tạo acid acetic hòa tan CaCO3 làm màu trắng đục CaCO3 Tiếp theo, cấy chuyển nhiều lần để thu chủng AAB với tế bào đồng Quan sát hình dạng, đo kích thước tế bào khuẩn lạc Thực nhuộm Gram, thử nghiệm catalase oxidase Khảo sát khả sinh acid acetic chủng vi khuẩn acetic: Tăng sinh chủng AAB ống nghiệm chứa môi trường YPGD 24 37oC điều kiện hiếu khí Nhỏ giọt dung dịch nuôi cấy lên đĩa môi trường thạch màu xanh chứa bromocresol green ethanol agar (ethanol 0,2%, yeast extract 0,3%, bromocresol green 0,01%) ủ hiếu khí 37oC 24 Đo so sánh vòng màu vàng sinh xung quanh AAB sau 24 48 [8, 11] Thử nghiệm thực lần để lấy giá trị trung bình chủng có khả sinh acid tốt lựa chọn để thử khả chịu nhiệt 55 Khoa học Kỹ thuật Công nghệ Đánh giá khả chịu nhiệt chủng AAB: Cấy chuyển chủng AAB tuyển chọn vào môi trường YPGD chứa 4% (v/v) ethanol Ủ hiếu khí mức nhiệt độ 35, 37, 39, 41 43oC Theo dõi đánh giá phát triển chủng AAB sau ngày sau: phát triển mạnh (đường cấy đậm liên tục), phát triển trung bình (đường cấy nhạt liên tục, đậm đứt quãng), phát triển yếu (đường cấy nhạt đứt quãng) [8, 11] Bảng Ký hiệu chủng phân lập đặc tính 16 chủng AAB Nguồn phân lập Xã An Khánh, Châu Thành, Bến Tre Xã Phú Mỹ, Châu Thành, Bến Tre Tuyển chọn chủng AAB chịu nhiệt có khả sinh acid cao: Mục đích nhằm tuyển chọn chủng AAB lên men mạnh có khả phát triển tốt nhiệt độ cao Nuôi ủ chủng AAB ống nghiệm chứa ml môi trường YPGD 48 giờ, lắc 150 vòng/phút 30oC Rút ml dịch tăng sinh cho vào 99 ml môi trường YPGD (bổ sung 4% (v/v) ethanol) ủ lắc 35, 37 39oC [11, 12] Xác định hàm lượng acid sinh ngày ngày phương pháp chuẩn độ sử dụng NaOH 0,1 N So sánh tuyển chọn chủng AAB có khả lên men acid tốt Định danh chủng AAB chịu nhiệt tuyển chọn: Các chủng AAB tuyển chọn ly trích DNA định danh với cặp mồi để khuếch đại trình tự vùng bảo tồn 16S rDNA nhóm α-Proteobacteria: 27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) 1525R (5’-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3’) [8] Sản phẩm PCR giải trình tự sử dụng hệ thống giải trình tự ABI PRISM 3100 (Applied Biosystems, USA) Dựa trình tự 16S rDNA để phân tích so sánh với trình tự chủng vi khuẩn ngân hàng liệu NCBI Kết thảo luận Phân lập tuyển chọn chủng AAB Mười sáu chủng AAB phân lập từ mẫu hạt ca cao lên men Bến Tre Tiền Giang Các khuẩn lạc AAB tạo vòng halo mơi trường YPGD agar bổ sung 4% (v/v) ethanol 0,5% CaCO3 (hình 1) Kết nhuộm Gram, thử nghiệm oxidase, catalase chủng vi khuẩn phân lập tổng hợp bảng Hình Khuẩn lạc môi trường YPGD agar (bổ sung 0,5% CaCO3) 62(3) 3.2020 Xã Hội Xuân, Cai Lậy, Tiền Giang Phường 10, TP Mỹ Tho, Tiền Giang STT 10 11 12 13 14 15 16 Chủng BT1G BT1H BT1K1 BT2G BT2A2 BT2E BT2F BT2B2 BT2K BT2B1 BT2H BT2C2 BT2A1 TG1C2 TG1D1 TG2B Nhuộm Gram Gram âm Gram âm Gram âm Gram âm Gram âm Gram âm Gram âm Gram âm Gram âm Gram âm Gram âm Gram âm Gram âm Gram âm Gram âm Gram âm Oxidase - Catalase + + + + + + + + + + + + + + + + Tất 16 chủng AAB cho kết Gram âm tế bào có màu đỏ sau nhuộm với thuốc nhuộm safaranin Tất 16 chủng AAB cho kết oxidase âm tính (thuốc thử khơng bị oxy hóa thành màu xanh dương indolphenol) [13] Tất 16 chủng AAB cho kết dương tính có enzyme catalase, thủy phân H2O2 thành H2O O2 Từ kết nhuộm Gram, thử nghiệm oxidase catalase thu cho thấy chủng phân lập phù hợp với đặc điểm điển hình AAB [14] Khả sinh acid acetic chủng AAB phân lập Khả sinh acid chủng AAB đánh giá đường kính vòng sáng màu vàng xung quanh khuẩn lạc Kết cho thấy kích thước vòng sáng 16 chủng AAB thời điểm 24 khơng có khác biệt mặt thống kê (bảng 2) Tuy nhiên, kích thước vòng sáng 16 chủng AAB thời điểm 48 có khác biệt ý nghĩa mặt thống kê Trong đó, 10 chủng AAB sơ tuyển với kích thước vòng sáng từ 19 mm trở lên thời điểm 48 đánh giá có khả sinh acid mạnh chủng lại Do đó, 10 chủng sơ tuyển để đánh giá khả chịu nhiệt Bảng Khả sinh acid acetic 16 chủng AAB STT Chủng 10 11 12 13 14 15 16 BT1G BT1H BT1K1 BT2A1 BT2A2 BT2B1 BT2B2 BT2C2 BT2E BT2F BT2G BT2H BT2K TG1C2 TG1D1 TG2B Kích thước vòng sáng (mm) Sau 24 giờ 9,33cde 9,0bcd 8,0ab 9,33cde 10,0de 10,0de 8,67bc 8,67bc 10,0de 8,0ab 8,0ab 7,33a 11,33f 10,33ef 11,33f 9,67cde Sau 48 giờ 17,0abc 19,33d 16,33ab 19,33d 21,0e 21,0e 17,33bc 17,67c 21,0e 19,0d 16,0a 16,0a 21,67e 19,0d 23,0f 19,33d Giá trị bảng giá trị trung bình lần lặp lại Các giá trị trung bình cột theo sau có mẫu tự giống thể khác biệt khơng có ý nhĩa thống kê mức độ tin cậy 95% 56 Khoa học Kỹ thuật Công nghệ Khả chịu nhiệt chủng AAB Mười chủng AAB sơ tuyển cấy vào mơi trường YPGD có bổ sung 4% (v/v) ethanol ủ mức nhiệt độ 37, 39, 41 43°C Kết thử nghiệm khả chịu nhiệt cho thấy, phát triển khuẩn lạc môi trường YPGD có bổ sung 4% (v/v) ethanol 10 chủng AAB khơng có khác biệt sau 48 72 (bảng 3) Sau 48 ủ, tất chủng phát triển 37, 39, 41 43°C (hình 2) Ở 37°C, tất 10 chủng phát triển mạnh; 39°C có chủng phát triển mạnh, chủng (BT2F, BT2K BT2A1) phát triển trung bình; 41°C chủng BT1H phát triển mạnh, chủng lại phát triển trung bình; 43°C có chủng phát triển trung bình, chủng phát triển yếu So với nghiên cứu gần Huỳnh Thị Hoàng Anh [12], chủng B2-3 phát triển tốt 37°C, chủng B3-2 phát triển tốt 37 39°C hai chủng không phát triển 43°C sau 48 ủ Từ cho thấy, 10 chủng AAB sơ tuyển nghiên cứu có khả chịu nhiệt cao so với chủng B2-3 B3-2 Bảng Kết thử nghiệm khả chịu nhiệt 37, 39, 41 43°C STT Chủng 10 BT1H BT2A2 BT2E BT2F BT2K BT2B1 BT2A1 TG1C2 TG1D1 TG2B Sau 48 37oC 39oC +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++ +++ ++ +++ +++ +++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ 41oC +++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ 43oC ++ + + + ++ ++ ++ + + ++ Sau 72 37oC 39oC +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++ +++ ++ +++ +++ +++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ 41oC +++ ++ ++ ++ ++ + ++ ++ ++ ++ 43oC ++ + + + ++ + ++ + + ++ Ghi chú: (+) phát triển yếu, (++) phát triển trung bình, (+++) phát triển mạnh Hình Sự phát triển AAB 37, 39, 41 43°C (môi trường YPGD, 48 giờ) Tuyển chọn chủng AAB chịu nhiệt có khả sinh acid tốt Biểu đồ hàm lượng acid 10 chủng AAB 35°C cho thấy khả sinh acid chủng tương đối nhau, tăng dần từ ngày đến ngày có khuynh hướng giảm sau (hình 3) Tất 10 chủng tăng ngày đầu lên men, đáng ý chủng TG2B đạt hàm lượng acid cao mức 3,60% (w/v) ngày lên men, chủng lại đạt giá trị acid cao Trong đó, chủng BT2A1 có lượng acid đạt cao 62(3) 3.2020 ngày với hàm lượng acid 3,65% (w/v) chủng BT2E đạt hàm lượng acid cao ngày lên men thứ (đạt 3,45% (w/v)) Hình Hàm lượng acid acetic 10 chủng AAB 35°C Hàm lượng acid sinh chủng BT1H, BT2A2, BT2F, TG1C2 TG2B tăng từ ngày đến ngày (lần lượt 3,15; 3,45; 3,30; 3,15 3,60% (w/v)) giảm sau hàm lượng acid ngày thứ trì mức 3,0% (w/v) (trong khoảng 3,0-3,15% (w/v)) Ba chủng BT2B1, BT2E TG1D1 tăng từ ngày đến ngày (lần lượt 3,20; 3,45 3,25% (w/v)) giảm sau đó, hàm lượng acid ngày khoảng 2,852,95% (w/v) Nồng độ acid acetic có giảm số lồi AAB khơng có khả oxy hóa ethanol thành acid acetic mà tiếp tục oxy hóa acid acetic thành nước CO2 [8] Chủng BT2A1 có giá trị hàm lượng acid cực đại với 3,65% (w/v) ngày thứ cao so với giá trị hàm lượng acid cực đại chủng lại So với hàm lượng acid chủng tuyển chọn từ nghiên cứu Huỳnh Thị Hồng Anh [12] B2-3 (4,44%) B3-2 (5,08%) hàm lượng acid chủng BT2A1 ngày thứ thấp nhiều cao chủng C2 (3,56%) NH2 (3,44%) tuyển chọn từ nghiên cứu Nguyễn Thị Ngọc Giao [15] Kết từ biểu đồ hình cho thấy, hầu hết 10 chủng AAB có khả sinh acid tương đồng 37°C Cụ thể, hàm lượng acid tăng theo thời gian lên men đạt giá trị cực đại khoảng đến ngày lên men Chủng BT1H, BT2B1, BT2F, TG1D1 TG2B có hàm lượng acid đạt cao ngày 4,45; 3,95; 3,60; 3,85 3,30% (w/v) Hàm lượng acid chủng BT2A1 tối đa đạt vào ngày lên men thứ 3, đạt mức 3,45% (w/v), sau giảm trì mức 3,40% (w/v) vào ngày lên men thứ Bốn chủng BT2A2, BT2E, BT2K TG1C2 có hàm lượng acid đạt cao vào ngày lên men thứ (lần lượt 3,70; 3,45; 3,55 3,15% (w/v)) Hàm lượng acid chủng giảm nhẹ ngày lên men thứ 5, đạt mức 3,60; 3,15; 3,35 3,10% (w/v) 57 Khoa học Kỹ thuật Cơng nghệ Hình Hàm lượng acid acetic 10 chủng AAB 37°C Kết cho thấy chủng BT1H, BT2B1 TG1D1 có hàm lượng acid ngày đạt cao nhất, 4,45; 3,75 3,85% (w/v), cao so với giá trị hàm lượng acid chủng lại ngày (chỉ khoảng 3,30-3,70% (w/v)) So với chủng B2-3 B3-2 tuyển chọn từ nghiên cứu Huỳnh Thị Hoàng Anh [12], chủng BT1H với 4,45% (w/v) ngày tương đồng với chủng B2-3 (4,44%) lại thấp chủng B3-2 (5,08%); chủng BT2B1 TG1D1 có hàm lượng acid ngày thấp chủng B2-3 B3-2 Tuy nhiên, hàm lượng acid ngày chủng BT1H, BT2B1 TG1D1 cao nhiều so với chủng C2 (3,56%) NH2 (3,44%) theo nghiên cứu Nguyễn Thị Ngọc Dao [15] Hàm lượng acid 10 chủng AAB 39°C ngày lên men ổn định thấp so với lên men 35 37°C (hình 5) Cụ thể, hàm lượng acid chủng AAB có tăng q trình lên men đạt 3,0% (w/v) sau ngày lên men (2,20-2,95%) Riêng chủng BT1H có khả trì khả sinh aicd tốt nhất, đạt 3,3% (w/v) vào ngày lên men thứ trì đến ngày lên men thứ Tuy hai chủng BT2B1 TG1D1 đạt hàm lượng acid tối đa 2,85% (ngày 3) 2,95% (ngày 5) cho thấy khả chịu nhiệt sinh acid tốt so với chủng lại Như vậy, chủng BT1H, BT2B1, TG1D1 (ở 37°C) BT2A1 (ở 35°C) chủng có khả lên men tốt với hàm lượng acid ngày thứ 4,45; 3,95; 3,85 3,65% (w/v) Từ kết trên, nghiên cứu tuyển chọn chủng có khả sinh acid nhiệt độ 37°C tốt BT1H, BT2B1 TG1D1 khả sinh acid 39°C Hàm lượng acid chủng tuyển chọn cao so với chủng C2 (3,56%) NH2 (3,44%) 37°C [15] Kết cho thấy, chủng phân lập từ ca cao lên men có khả chịu nhiệt tốt trì khả lên men tốt nhiệt độ cao thân chủng có nguồn gốc từ q trình lên men ca cao nhiệt độ cao (40-45°C, chí lên đến 50°C) [10] Từ cho thấy tiềm khai thác ứng dụng chủng AAB chịu nhiệt trình lên men acid acetic mà không chịu tác động lớn nhiệt độ khối lên men gia tăng nên giảm chi phí làm mát, giảm chi phí vận hành hệ thống lên men Định danh chủng AAB tuyển chọn Ba chủng BT1H, BT2B1 TG1D1 có khả lên men tốt 37°C trì khả lên men tốt 39°C định danh kỹ thuật sinh học phân tử thông qua kỹ thuật khuếch đại giải trình tự gen vùng bảo tồn 16S rDNA nhóm α-Proteobacteria Kết so sánh mức độ tương đồng trình tự DNA ba chủng BT1H, BT2B1 TG1D1 với trình tự chủng vi khuẩn acetic ngân hàng gene NCBI cho thấy, chủng BT2B1 định danh Acetobacter pasteurianus, chủng BT1H TG1D1 xác định Acetobacter tropicalis với mức độ tương đồng so sánh BLAST sở liệu NCBI đạt 98,7-99,8% Cây phân loài hình (sử dụng chương trình MEGA với số bootstrap 1.000) chủng phân lập cho thấy mối quan hệ di truyền gần so với loài định danh chi Acetobacter A tropicalis TG1D1 99 71 A tropicalis NBRC 16470 A tropicalis BT1H A senegalensis CWBI-B418 56 A orientalis NBRC 16606 A pasteurianus BT2B1 100 A pasterianus IFO 3283 A aceti DSM 3508 G oxydans NBRC 14819 0.005 Hình Cây phân lồi di truyền chủng AAB chịu nhiệt tuyển chọn Hình Hàm lượng acid acetic 10 chủng AAB 39°C 62(3) 3.2020 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc tế bào số đặc điểm sinh hóa chủng phân lập BT1H, BT2B1 TG1D1 trình bày bảng Các đặc điểm phù hợp với mô tả loài A pasteurianus A tropicalis tài liệu phân loại vi khuẩn Bergey [14] Hai 58 Khoa học Kỹ thuật Cơng nghệ lồi phân lập đánh giá lồi có khả chịu nhiệt lên men acid acetic tốt nhiệt độ 37°C [2, 15, 16] Bảng Đặc điểm hình thái sinh hóa chủng AAB chịu nhiệt tuyển chọn STT Chủng Khuẩn lạc sau 48 Tế bào Đặc điểm sinh hóa Hình dạng Đường kính (mm) Hình dạng Kích thước (µm) Gram Oxidase Catalase BT1H Tròn, trơn, mơ, bìa 2,0-2,5 ngun, trắng ngà Que ngắn 0,5-0,7 x 1,8-2,4 – – + BT2B1 Tròn, trơn, mơ, bìa 2,0-2,5 ngun, trắng đục Que ngắn 0,4-0,6 x 1,8-2,2 – – + TG1D1 Tròn, trơn, mơ, bìa 2,0-2,5 nguyên, trắng ngà Que ngắn 0,4-0,7 x 1,8-2,4 – – + Kết luận Nghiên cứu phân lập 16 chủng AAB từ mẫu hạt ca cao lên men thu từ Bến Tre Tiền Giang Sơ tuyển 10 chủng AAB BT1H, BT2A1, BT2A2, BT2B1, BT2E, BT2F, BT2K, TG1C2, TG1D1 TG2B có đường kính vòng sáng từ 19 mm trở lên sau 48 ủ 37°C Tất 10 chủng AAB sơ tuyển có khả chịu nhiệt 43°C Kết tuyển chọn chủng AAB chịu nhiệt có khả lên men acid acetic tốt 37°C BT1H, BT2B1 TG1D1 thuộc giống Acetobacter với nồng độ acid acetic đạt ngày lên men thứ khoảng 3,85-4,45% (w/v) LỜI CẢM ƠN Nhóm tác giả xin cảm ơn hỗ trợ kinh phí từ Chương trình Cơng nghệ sinh học tiên tiến Trường Đại học Cần Thơ Chương trình CCP (Core-to-Core Program, 2014-2019) TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Lương Đức Phẩm (1998), Công nghệ vi sinh vật, Nhà xuất Nông nghiệp [2] A Saeki, G Theeragool, K Matsushita, H Toyama, N Lotong, O Adachi (1997), “Development of thermotolerant acetic acid bacteria useful for Vinegar Fermentation at higher temperatures”, Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 61(1), pp.138-145 [3] Y Jojima, Y Mihara, S Suzuki, K Yokozeki, S Yamanaka, and R Fudou (2004), “Saccharibacter floricola gen nov., sp nov., a novel osmophilic acetic acid bacterium isolated from pollen”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 54(6), pp.22632267 [4] D.E Greenberg, S.F Porcella, F Stock, A Wong, P.S Conville, P.R Murray, S.M Holland, and A.M Zelazny (2006), “Granulibacter bethesdensis gen nov., sp nov., a distinctive pathogenic acetic acid 62(3) 3.2020 bacterium in the family Acetobacteraceae”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 56(11), pp.2609-2616 [5] S Ohmori, H Masai, K Arima and T Beppu (1980), “Isolation and identification of acetic acid bacteria for submerged acetic acid fermentation at high temperature”, Agricultural and Biological Chemistry, 44(12), pp.2901-2906 [6] D Moonmangmee, O Adachi, Y Ano, E Shinagawa, H Toyama, G Theeragool, N Lotong, and K Matsushita (2000), “Isolation and characterization of thermotolerant Gluconobacter strains catalyzing oxidative fermentation at higher temperatures”, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 64(11), pp.2306-2315 [7] B Ndoye, S Lebecque, R Dubois-Dauphin, L Tounkara, A.T Guiro, C Kere, B Diarawa, and P Thonart (2006), “Thermoresistant properties of acetic acid bacteria isolated from tropical products of SubSaharan Africa and destined to industrial vinegar”, Enzyme and Microbial Technology, 39(4), pp.916-923 [8] W Kanchanarach, G Theeragool, T Yakushi, H Toyama, A Adachi, K Matsushita (2010), “Characterization of thermotolerant Acetobacter pasteurianus strains and quinoprotein alcohol dehydrogenases”, Applied Microbial and Biotechnology, 85(3), pp.741-751 [9] R.F Schwan, and A.E Wheals (2004), “The microbiology of cocoa fermentation and its role in chocolate quality”, Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 44(4), pp.205-221 [10] Vương Thanh Tùng Hà Thanh Toàn (2006), “Khảo sát ảnh hưởng trình ủ lên men đến chất lượng hạt ca cao”, Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ, 5, tr.149-157 [11] Huỳnh Xuân Phong, Nguyễn Mỹ Vi, Nguyễn Ngọc Thạnh, Bùi Hoàng Đăng Long, Toshiharu Yakushi, Kazunobu Matsushita, Ngô Thị Phương Dung (2017), “Tuyển chọn vi khuẩn acetic chịu nhiệt ứng dụng lên men acid acetic”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, 20(9B), tr.44-49 [12] Huỳnh Thị Hoàng Anh (2014), Phân lập tuyển chọn vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt từ ca cao, Luận văn đại học ngành Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ [13] Trần Linh Thước (2003), Phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm, Nhà xuất Giáo dục [14] M Sievers and J Swings (2005), “Genus I Acetobacter”, Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, 2, pp.51-54 [15] Nguyễn Thị Ngọc Giao (2014), Phân lập tuyển chọn vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt từ trái cây, Luận văn đại học ngành Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ [16] W Kanchanarach, G Theeragool, T Inoue, T Yakushi, O Adachi, K Matsushita (2010), “Acetic acid fermentation of Acetobacter pasteurianus: Relationship between acetic acid resistance and pellicle polysaccharide formation”, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 74(8), pp.1591-1597 59 ... chủng phân lập từ ca cao lên men có khả chịu nhiệt tốt trì khả lên men tốt nhiệt độ cao thân chủng có nguồn gốc từ q trình lên men ca cao nhiệt độ cao (40-45°C, chí lên đến 50°C) [10] Từ cho... đặc biệt lên men acid acetic vi khuẩn acid acetic nhạy cảm với nhiệt độ (tối ưu 30oC [2]) Từ cho thấy trình lên men ca cao nhiệt độ cao nguồn tiềm để phân lập loài vi khuẩn acetic chịu nhiệt Nghiên... nhằm phân lập, tuyển chọn xác định hình thái, đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt phân lập từ ca cao lên men Vật liệu phương pháp nghiên cứu Nguyên vật liệu hóa chất Mẫu hạt ca