Phân lập, định danh chủng vi khuẩn có trong nem chua việt nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ~~~~~***~~~~~ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH CHỦNG VI KHUẨN CÓ TRONG NEM CHUA VIỆT NAM Hà Nội, tháng 09 năm 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC ~~~~~***~~~~~ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH CHỦNG VI KHUẨN CÓ TRONG NEM CHUA VIỆT NAM Sinh viên thực : Đỗ Thị Phƣơng Mã sinh viên : 637063 Lớp : K63CNSHA Giảng viên hƣớng dẫn : TS Bùi Thị Thu Hƣơng TS Nguyễn Sỹ Lê Thanh Hà Nội, tháng 09 năm 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan báo cáo thời gian qua Những số liệu kết nghiên cứu trung thực, hoàn toàn đƣợc thực Phịng cơng nghệ sinh học enzyme- Viện Cơng nghệ sinh học- Viện hàn lâm Khoa học Công nghệ , khơng chép nguồn khác Ngồi ra, báo cáo có sử dụng số nguồn tài liệu tham khảo đƣợc trích dẫn nguồn thích rõ ràng Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm với lời cam đoan trên! Hà Nội, ngày 30 tháng năm 2022 Sinh viên thực Đỗ Thị Phƣơng i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp này, nỗ lực thân, tơi cịn nhận đƣợc quan tâm giúp đỡ nhiều tập thể cá nhân Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tri ân sâu sắc tới TS Nguyễn Sỹ Lê Thanh- Viện công nghệ sinh học- Viện hàn lâm Khoa học Công nghệ TS Bùi Thị Thu Hƣơng - Bộ môn Sinh học - Khoa Công nghệ Sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam tạo điều kiện cho tơi, hƣớng dẫn tận tình, chu đáo giúp tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Bên cạnh đó, tơi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ qu báu, nhiệt tình tập thể cán thuộc phịng Công nghệ sinh học Enzyme, nơi tiến hành khóa luận tốt nghiệp Cuối cùng, tơi gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô Bộ môn Sinh học - Khoa Công nghệ Sinh học - Học viện Nơng nghiệp Việt Nam có kiến đóng góp để tơi hồn thành khóa luận cách hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 30 tháng năm 2022 Sinh viên thực Đỗ Thị Phƣơng ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu, nội dung nghiên cứu Mục tiêu Nội dung nghiên cứu PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Nem chua 2.2 Tổng quan sinh vật có nem chua 2.3 Chủng Lactobacillus có nem chua 2.3 Chủng Bacillus nem chua 2.4 Định danh vi sinh vật 13 2.4.1 Định danh vi sinh vật theo phƣơng pháp truyền thống 13 2.4.2 Định danh vi sinh vật dựa vào vật liệu di truyền 14 PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 15 3.1 Vật liệu 15 3.2 Hóa chất 15 3.2.1 Môi trƣờng nuôi cấy 15 3.2.2 Dung dịch đệm 16 3.3 Thiết bị thí nghiệm 16 3.4 Phân lập chủng vi sinh vật có nem chua 17 iii 3.5 Đánh giá khả kháng khuẩn gây bệnh vi khuẩn phân lập đƣợc 18 3.6 Phƣơng pháp sinh học phân tử 19 3.6.1 Tách chiết DNA tổng số 19 3.6.2 Khuếch đại phân đoạn 16S rRNA PCR 20 3.6.3 Điện di gel agarose 21 3.6.4 Giải trình tự DNA 21 3.7 Tách chiết hoạt chất thứ cấp dung môi phân cực 22 3.8 Sắc k mỏng (TLC) 22 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 4.1 Phân lập vi khuẩn t mẫu nem chua 24 4.2 Kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn 27 4.2 Định danh chủng vi khuẩn 28 4.3 Kiểm tra hoạt chất t dịch nuôi cấy ngoại bào chủng phân lập 31 4.3.1 Khả kháng khuẩn t dịch chủng phân lập đƣợc với nhiệt enzym phân giải protein 31 4.3.2 Tách chiết hoạt chất thứ cấp dung môi phân cực 33 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 5.1 KẾT LUẬN 35 5.2 KIẾN NGHỊ 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 PHỤ LỤC 38 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Danh sách dung dịch đệm đƣợc sử dụng 16 Bảng 3.2: Các thiết bị đƣợc sử dụng 17 Bảng 3.3 Thành phần phản ứng PCR 20 Bảng 4.1 Hình thái khuẩn lạc phân lập đƣợc t nem chua 24 Bảng 4.2 Hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn nghiên cứu 25 Bảng 4.3 Hoạt tính kháng khuẩn chủng 10, 22a, 28 27 v DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Khuẩn lạc Latobaciillus plantarum mơi trƣờng MRS Hình 2.2: Vi khuẩn Bacillus lincheniformis nhóm khuẩn lạc 11 Hình 4.1 Đĩa chủng vi khuẩn 26 Hình 4.2: Hoạt tính chủng 10, 22a, 28 kháng chủng gây bệnh 28 Hình 4.3: Hình ảnh điện di gel agarose 0,8% 29 Hình 4.4: Trình tự nucleotide chủng 10 30 Hình 4.5: Cây phân loại chủng 10 chủng vi khuẩn ngân hàng 30 Hình 4.6: Đĩa thử hoạt tính kháng S aureus 31 Hình 4.7: Sắc ký mỏng (TLC) dịch cô quay chủng 28 33 Hình 4.8: Hoạt tính kháng S aureus dịch cô quay chủng 28 34 vi CÁC CHỮ VIẾT TẮT LAB : vi khuẩn axit lactic MRS : De Man- Rogosa- Sharpe CFS : Cell Free Supernatant (phần không tế bào) MT : Môi trƣờng VK : vi khuẩn VSV : vi sinh vật NCBI : National Center for Biotechnology Information- Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia PCR : Polymerase Chain Rcaction- Phản ứng chuỗi polymerase Rrna : Ribosomal ribonucleic acid CFU : Colony Forming Unit- đơn vị hình thành khuẩn lạc Cs : Cộng vii PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Vi sinh vật tự nhiên phong phú đa dạng, chúng xung quanh chúng ta: đất, nƣớc, khơng khí, thực phẩm ta ăn hàng ngày Chúng gây cho ta nhiều bất lợi khôn lƣờng nhƣ bệnh tả, bệnh cúm, đại dịch Covid, bệnh liên quan vấn đề thực phẩm Bên cạnh vi sinh vật đem lại cho ta nguồn lợi ích vơ to lớn biết, hiểu chúng biết sử dụng chúng vào t ng mục đích giúp cho sống ngƣời tốt đẹp T xƣa đến nay, ngƣời biết sử dụng hoạt tính có lợi vi sinh vật để phục vụ cho đời sống nhƣ tạo loại rƣợu qu , thuốc chữa bệnh t vi sinh vật, hay ăn nhƣ dƣa chua, sữa chua hay nem chua Hiện có nhiều chất có hoạt tính sinh học khác đƣợc tổng hợp t vi sinh vật để đƣa vào sản xuất mức độ công nghiệp nhằm phục vụ cho nghiên cứu, công- nông nghiệp, y học đời sống ngƣời Các chủng vi khuẩn nhƣ Bacillus, Lactobacillus,… đƣợc sử dụng chế phẩm sinh học để phục vụ cho ngành sản xuất nhƣ thực phẩm, công nghệ dệt, thuộc da, y học, thức ăn chăn nuôi, nuôi trồng thủy sản, phế thải hữu làm môi trƣờng nuôi trồng thủy sản…là nhờ khả sinh enzyme mà vi khuẩn sinh (Ngân, 2022) Nem chua Việt Nam ăn thơm ngon, tiếng, ngồi cịn loại thực phẩm dinh dƣỡng phổ biến quốc gia Châu Á, đặc biệt Việt Nam Bản chất lên men nem chua q trình chuyển hóa đƣờng thành axit lactic nhờ hoạt động vi khuẩn lactic bao gồm Lactobacillus, Pediococcus Microccocus, đóng vai trị quan trọng nhóm vi khuẩn Lactobacillus (L D Nguyen, 2002) Xuất phát t thực tế chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài “Phân A B C D Hình 4.1 Đĩa chủng vi khuẩn A: 22a; B: 28;C:10,:D: 10 Kết hình thái khuẩn lạc đặc tính cho thấy, chủng 10 giống với hình thái chủng Bacillus, chủng 22a 28 có đặc điểm hình thái tƣơng đồng với chủng Lactobacillus 26 4.2 Kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn Một đặc điểm vi khuẩn phân lập đƣợc có khả kháng vi khuẩn gây bệnh Kết hoạt tính kháng khuẩn chủng vi khuẩn 10, 22a, 28 đƣợc thể bảng 4.3 Chủng 10, 22a, 28 có khả kháng S aureus Đối với vi khuẩn gây bệnh Candida, Bacillus subtilis, E coli chủng 10 có khả kháng lại chủng khơng có khả kháng Candida Điều chứng tỏ chủng phân lập đƣợc có hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh số chủng gây bệnh định Đặc biệt chủng 10 có đặc tính kháng lại chủng gây bệnh đồng thời có khả kháng lại chủng gây bệnh loại (bảng 4.3, hình 4.2) Bảng 4.3 Hoạt tính kháng khuẩn chủng 10, 22a, 28 Kí hiệu chủng Vùng ức chế sinh trƣởng Staphylococcus aureus Bacillus subtilis Candida E.coli 10 +++ + - + 22a + - - - 28 + - - - Chú thích: ((–) = 0, (+) = – mm, (++) = 2,1 – mm, (+++) = lớn mm 27 A B C D Hình 4.2: Hoạt tính chủng 10, 22a, 28 kháng chủng gây ệnh Candida (A); Bacillus subtilis (B); S aureus C, D).ĐC- Cloramphenicol 0.4%, 10 dịch CFS chủng 10, 22a dịch CFS chủng 22a, 28 dịch CFS chủng 28 4.2 Định danh chủng vi khuẩn Sau thử hoạt tính kháng khuẩn chủng vi khuẩn phân lập dƣợc , nhận thấy chủng 10 có khả kháng khuẩn mạnh thể hoạt tính rõ rêt , nên chúng tơi định giải trình tự gen chủng 10 28 Sản phẩm DNA tổng số tách chiết t chủng 10 đƣợc điện di kiểm tra gel 0,8% agarose Kết hình 4.3 cho thấy DNA tƣơng đối sạch, không bị gãy, đủ điều kiện chất lƣợng cho nghiên cứu nhân dòng đọc trình tự A B C Hình 4.3: Hình ảnh điện di gel agarose 0,8% A: Sản phẩm tách chiết DNA chủng 10; B sản phẩm PCR chủng 10; C: Sản phẩm tinh PCR chủng 10 Phản ứng PCR đƣợc tiến hành với cặp mồi 9F 926R, sau điện di kiểm tra gel 0,8% agarose kết hình 4.3, sản phẩm thu đƣợc có kết khoảng 1000 bp (Hình 4.3) Sản phẩm PCR tinh sau đƣợc giải trình tự, kết thể hình 4.4 Trình tự chủng 10 >1st_BASE_4574131_10_9F AATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTG AGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACC GGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGAT GGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCC GACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCA GCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAA 29 GGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTA CCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGT AGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCT GATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGA AGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTG GCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGG ATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCC CCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAA CTCAAGAAAATTTGACGGGA Hình 4.4: Trình tự nuc eotide chủng 10 So sánh trình tự đoạn gen 16S rRNA chủng 10 với trình tự 16S rRNA chủng đƣợc công bố GenBank cho thấy, chủng 10 có độ tƣơng đồng 94,9% với chủng Bacillus Sp có mã số tƣơng ứng MH234003.1, MK660033.1, FJ893859.1, MN893859., MW751890.1, JF411319.1, HM480486.1, MT677937.1, ON961696.1 (Hình 4.5) Hình 4.5: Cây phân oại chủng 10 chủng vi khuẩn ngân hàng NCBI MN893859.1: Bacterium, JF411319.1: Bacillus tequilensis, HM480486.1: Bacillus subtilis, MK660033.1: Bacillus sp, MT677937.1 Bacillus subtilis, MH234003.1 Bacillus sp, MW579530.1: Bacillus sp, FJ863112.1 Uncultured Bacillus sp, MW751890.1: Bacillus subtilis, ON961696.1: Bacillus tequilensis, NR075019.1 Lactobacilus 30 T kết ta thấy chủng 10 có độ tƣơng đồng 94,9% với MH234003.1 Và chủng 10 lại nằm nhánh khác với chủng Lactobacillus, nên ta kết luận chủng thuộc lồi Bacillus sp 4.3 Kiểm tra hoạt chất t dịch nuôi cấy ngoại chủng phân ập 4.3.1 Khả kháng khuẩn t dịch chủng phân ập đƣợc với nhiệt enzym phân giải protein Enzyme phân hủy protein Proteinase K đƣợc bổ sung vào mẫu vi khuẩn có hoạt tính kháng nhƣ trình bày phần phƣơng pháp 28 28t 28k A B Hình 4.6: Đĩa thử hoạt tính kháng S aureus Chủng 10 (A) 28 (B) sau xử lý nhiệt enzyme proteinase K ĐC Cloramphenicol 0.4% , 10, 28 - dịch CFS tế bào, 10to , 28t- dịch CFS luộc 100 , 10to+K, 28k - dịch CFS luộc 100 proteinase K Kết cho thấy mẫu 10 bền với nhiệt nhƣng lại bị phân hủy có góp mặt enzyme proteinase K chứng tỏ sản chủng 10 mang chất peptide Trên mẫu 28 ổn định có tác dụng nhiệt độ enzyme proteinase K chứng tỏ mẫu 28 sinh hợp chất thứ cấp 31 Trên Thế Giới có nghiên cứu chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học biết t B subtilis ứng dụng tiềm nhƣ tác nhân kiểm soát mầm bệnh thực vật, thuốc chất hoạt động bề mặt sinh học B subtilis tiếng với việc sản xuất lipopeptit theo chu kỳ thể hoạt động kháng khuẩn chất hoạt động bề mặt mạnh, chẳng hạn nhƣ chất tạo bọt, iturins Fengycins Một số macrolit có nguồn gốc polyketide nhƣ peptit không chứa nguyên tử bosome, dihydroisocoumarins lipopeptide mạch thẳng có đặc tính kháng khuẩn đƣợc báo cáo, chứng tỏ kho vũ khí sinh tổng hợp vi khuẩn Những nỗ lực đầy hứa hẹn việc áp dụng B subtilis chủng sản phẩm tự nhiên chúng lĩnh vực nông nghiệp y học đƣợc tiến hành Tuy nhiên, sẵn có quy mơ công nghiệp hợp chất bị hạn chế suất lên men thấp khả tiếp cận thông qua tổng hợp đầy thách thức, đòi hỏi phát triển chủng biến đổi gen quy trình canh tác tối ƣu hóa Các loài Bacillus đƣợc phân lập t thân rễ lồi thực vật khác nhau, hoa cẩm chƣớng, bơng, nghệ chuối bang Tamil Nadu Ấn Độ Tiềm chúng việc kiểm soát phát triển sợi nấm Sclerotinia sclerotiorum đƣợc đánh giá ống nghiệm kỹ thuật kép phân vùng B amyloliquefaciens chủng VB7 có nhiều hiệu việc ức chế phát triển sợi nấm (ức chế kiểm soát mức 45%) sản xuất xơ cứng (100%) PCR phát gen AMP cho thấy B amyloliquefaciens(VB7) có tối đa 10 gen sinh tổng hợp kháng sinh đa dạng, cụ thể ituD, ipa14, bacA, bacD, bamC, sfP, spaC, spaS, alba albF, dẫn đến sản sinh kháng sinh iturin, bacilysin, bacillomycin, Surftin, subtilin subtilosin Hơn nữa, chất chuyển hóa t chủng B amyloliquefaciens VB2 VB7, liên quan đến việc ức chế S sclerotiorum, đƣợc xác định phenol axit béo phƣơng pháp sắc ký khí khối phổ (GC- 32 MS) Phân phối huyền phù vi khuẩn chủng Bacillus hữu hiệu nhúng rễ đƣợc tìm thấy có triển vọng việc quản lý bệnh thối thân hoa cẩm chƣớng trồng trọt 4.3.2 Tách chiết hoạt chất thứ cấp ằng dung môi phân cực Chủng 28 đƣợc ni bình tam giác 1000 ml chứa 250 ml môi trƣờng MT2 37oC, lắc 200 rpm, 24 giờ, dịch nuôi cấy đƣợc ly tâm 12000 rpm 10 phút 4oC Hình 4.7: Sắc ký mỏng (TLC) dịch cô quay chủng 28 Tủa tế bào đƣợc chiết dung môi ethyl acetate (1:1 v/v), thu pha dung môi, loại dung môi máy cô quay chân không 50 oC Cặn quay đƣợc hịa trở lại DMSO (1/10 v/v), cặn cô quay tan DMSO đƣợc chạy sắc k (TLC) hệ dung môi Ethyl acetate : Toluen (6:4), dƣới đèn UV 256nm xơng ione (Hình 4.7) Kết cho thấy chạy TLC chủng 28 hệ dung mội Ethyl acetate: toluen (6:4) xuất vệt chƣa rõ ràng chƣa tách lớp, cần chọn hệ dung môi phù hợp khác Dịch chiết sau tách chiết dung môi Ethyl acetated, cô đuổi dung mơi hịa lại DMSO đƣợc đƣợc thử hoạt tính kháng khuẩn, kết hình 33 4.8 cho thấy vòng kháng khuẩn rõ nét, thể khả kháng mạnh chủng gây bệnh S aureus Hình 4.8: Hoạt tính kháng S aureus dịch cô quay chủng 28 Ghi chú: ĐC: Cloramphenicol 0.4%, 28:dịch cô quay chủng 28 + DMSO Chủng chúng tơi tiến hành đọc trình tự gene 16S rDNA chờ kết đọc trình tự 34 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Đã phân lập đƣợc 30 chủng vi khuẩn có nem chua với nhiều hình thái, đặc điểm khác Chọn lọc đƣợc 03 chủng có hoạt tính kháng chủng gây bệnh Staphylococcus aureus Đánh giá đƣợc khả biến tính nhiệt, hoạt động chủng có tham gia Proteinase K Đã định tên loài thị gene 16S rRNA đặt tên Bacillus sp 10 Trình tự đoạn gene 16S rRNA có độ tƣơng đồng 94,9% với lồi Bacillus sp có mã số MH234003.1 5.2 KIẾN NGHỊ Sàng lọc vi khuẩn nhiều kỹ thuật khác Thử hoạt tính chủng phân lập đƣợc đối tƣợng gây bệnh khác Chọn hệ dung môi chiết khác với nhiều nồng độ khác tách chiết đƣợc hợp chấp mong muốn 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Nguyễn Đức Lƣợng, N T T D (2003) "Công nghệ sinh học môi trƣờng " NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh.: tập Thảo, T Đ., et al (2019) “Nghiên cứu khả xử lý nƣớc thải sinh hoạt cơng nghệ bùn hoạt tính có bổ sung chế phẩm sinh học Bacillus Sp” ,Tạp chí khoa học & Công nghệ: Đáng T (2019) Probiotics sức khỏe Nhà xuất Y học 65-66 Fadda S., López, C., Vignolo (2010) Vai trò vi khuẩn axit lactic trình ủ lên men thịt: Các peptit đƣợc tạo nhƣ dấu ấn sinh học cảm quan vệ sinh Khoa học thịt (86): 66-79 G Melgar-Lalanne Y R., H Hernández-Sánchez (2012) Lactobacliilus plantarum: Một tổng quan với nhấn mạnh đặc tính sinh hóa lành mạnh Nova Nhà xuất khoa học Lactobacillus: Phân loại, sử dụng nghĩa sức khỏe H Jurado-Gámez C R., J Martínez (2013) Đánh giá in vivo Lactobacillus plantarum thay cho việc sử dụng kháng sinh heo ạp chí MVZ Córdoba Huot E., Meghrous, J., Barrena-Gonzalez, C., Petitdemange (1996) Bacteriocin J46, loại vi khuẩn đƣợc sản xuất Lactococcus lactis subsp.cremoris J46: Phân lập xác định đặc điểm protein gen Anaerobe 2(137-145) J.C Goldstein K L T., D.M Citron (2015) Lactobacillus Loài: Độ phức tạp phân loại tính nhạy cảm gây tranh cãi Bệnh truyền nhiễm lâm sàng Leroy F., Verluyten, J., de Vuyst (2006) uôi cấy khởi động thịt chức để cải thiện q trình lên men xúc xích Int J Microbiol thực phẩm 106(270285) Nes I v J (2004) Khám phá tiềm kháng khuẩn LAB gen Curr Opin Công nghệ sinh học 15(100-104) Ngân P T T (2022) Chuyên đề kỹ thuật :" Ứng dụng đặc điểm sinh bào tử Bacillus Sp để tăng hiệu xử l nƣớc sản xuất chế phẩm vi sinh phục vụ đời sống NTTS VIBO Co, LTD Trách nghiệm tẳng 18 Nguyen D., Cnockaert, M., van Hoorde, K., de Brandt, E., Snauwaert, I., Snauwaert, C., de Vuyst, L., Le, BT, and Vandamme (2013) Lactobacillus porcinae sp nov., tách biệt với Nem chua truyền thống Việt Nam Int J Syst Evol Vi sinh.(1754-1759): 63 36 Tài iệu tiếng Anh L D Nguyen (2002) Traditional Fermented Foods In: Microbiology Technology (Vol 3)(Science and Technology Publishing House, Ho Chi Minh city) Konuray G & Erginkaya Z (2018) Potential Use of Bacillus coagulans in the Food Industry Foods 7(6) Niku-Paavola M.-L., Laitila A., Mattila-Sandholm T & Haikara A (1999) New types of antimicrobial compounds produced by Lactobacillus plantarum Journal of Applied Microbiology 86(1): 29-35 Earl AM, Losick R, Kolter R Ecology and genomics of Bacillus subtilis Trends Microbiol 2008 Jun;16(6):269-75 Piggot PJ, Hilbert DW Sporulation of Bacillus subtilis Curr Opin Microbiol 2004 Dec;7(6):579-86 Muras A, Romero M, Mayer C, Otero A Biotechnological applications of Bacillus licheniformis Crit Rev Biotechnol 2021 Jun;41(4):609-627 Arenas M, Pereira F, Oliveira M, Pinto N, Lopes AM, Gomes V, Carracedo A, Amorim A Forensic genetics and genomics: Much more than just a human affair PLoS Genet 2017 Sep 21;13(9):e1006960 Talamantes-Becerra B, Carling J, Kennedy K, Gahan ME, Georges A Identification of bacterial isolates from a public hospital in Australia using complexity-reduced genotyping J Microbiol Methods 2019 May;160:1119 37 PHỤ LỤC AATACATGCA AGTCGAGCGG ACAGATGGGA GCTTGCTCCC TGATGTTAGC 51 GGCGGACGGG TGAGTAACAC GTGGGTAACC TGCCTGTAAG ACTGGGATAA 101 CTCCGGGAAA CCGGGGCTAA TACCGGATGG TTGTTTGAAC CGCATGGTTC 151 AAACATAAAA GGTGGCTTCG GCTACCACTT ACAGATGGAC CCGCGGCGCA 201 TTAGCTAGTT GGTGAGGTAA CGGCTCACCA AGGCAACGAT GCGTAGCCGA 251 CCTGAGAGGG TGATCGGCCA CACTGGGACT GAGACACGGC CCAGACTCCT 301 ACGGGAGGCA GCAGTAGGGA ATCTTCCGCA ATGGACGAAA GTCTGACGGA 351 GCAACGCCGC GTGAGTGATG AAGGTTTTCG GATCGTAAAG CTCTGTTGTT 401 AGGGAAGAAC AAGTACCGTT CGAATAGGGC GGTACCTTGA CGGTACCTAA 451 CCAGAAAGCC ACGGCTAACT ACGTGCCAGC AGCCGCGGTA ATACGTAGGT 501 GGCAAGCGTT GTCCGGAATT ATTGGGCGTA AAGGGCTCGC AGGCGGTTTC 551 TTAAGTCTGA TGTGAAAGCC CCCGGCTCAA CCGGGGAGGG TCATTGGAAA 601 CTGGGGAACT TGAGTGCAGA AGAGGAGAGT GGAATTCCAC GTGTAGCGGT 651 GAAATGCGTA GAGATGTGGA GGAACACCAG TGGCGAAGGC GACTCTCTGG 701 TCTGTAACTG ACGCTGAGGA GCGAAAGCGT GGGGAGCGAA CAGGATTAGA 751 TACCCTGGTA GTCCACGCCG TAAACGATGA GTGCTAAGTG TTAGGGGGTT 801 TCCGCCCCTT AGTGCTGCAG CTAACGCATT AAGCACTCCG CCTGGGGAGT 851 ACGGTCGCAA GACTGAAACT CAAGAAAATT TGACGGGA 38 39 40