Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu xác định được chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh bacteriocin, định hướng ứng dụng như chất bổ sung trong thức ăn nuôi trồng thủy sản nhằm thay thế việc sử dụng chất kháng sinh như hiện nay.
Vietnam J Agri Sci 2022, Vol 20, No 3: 370-380 Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2022, 20(3): 370-380 www.vnua.edu.vn PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ĐỊNH DANH CHỦNG VI KHUẨN Enterococcus faecium HN1 CÓ KHẢ NĂNG SINH BACTERIOCIN Phạm Hồng Hiển1, Dương Văn Hoàn2, Trần Thị Đào2, Phạm Thị Dung2, Nguyễn Thị Thu2, Phạm Thị Thu Trang2, Nguyễn Xuân Cảnh2* Ban Khoa học Hợp tác quốc tế, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam * Tác giả liên hệ: nxcanh@vnua.edu.vn Ngày nhận bài: 14.06.2021 Ngày chấp nhận đăng: 16.02.2021 TÓM TẮT Nghiên cứu thực với mục tiêu xác định chủng vi khuẩn lactic có khả sinh bacteriocin, định hướng ứng dụng chất bổ sung thức ăn nuôi trồng thủy sản nhằm thay việc sử dụng chất kháng sinh Trên môi trường MRS, phương pháp cấy trải kết hợp với quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc, 16 chủng vi khuẩn lactic phân lập từ 18 mẫu ruột cá thu thập địa điểm khác Trong 08 chủng có khả sinh bacteriocin thể hoạt tính kháng khuẩn với 02 chủng vi khuẩn kiểm định (Salmonella sp Escherichia coli) Trong số đó, chủng HN1 phân lập từ mẫu ruột cá rô phi thu thập Hà Nội có khả sinh bacteriocin mạnh thể hoạt tính kháng khuẩn mạnh đồng thời với vi khuẩn Salmonella sp Escherichia coli với đường kính vịng kháng khuẩn 16mm 15mm Mơi trường MRS có bổ sung glucose cao nấm men với tỉ lệ 3%, chủng HN1 có khả sinh trưởng sinh bacteriocin cao Kết hợp đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hố phân tích trình tự gen mã hóa vùng 16S rRNA, chủng HN1 xác định Enterococcus faecium HN1 Từ khoá: Bacteriocin, Enterococcus, thuỷ sản Isolation, Selection and Identification of Strain of Enterococcus faecium HN1 Capable of Producing Bacteriocin ABSTRACT This study was carried out to identify lactic bacteria producing bacteriocin potentially as supplement in the aquaculture feeds to replace the antibiotics Combining methods of spreading and observing morphological characteristics of the colony on MRS medium, 16 strains of lactic acid bacteria were isolated from 18 fish gut samples collected at different locations Among these, strains were able to produce bacteriocin showing antibacterial activity against Salmonella sp and Escherichia coli The strain HN1 isolated from Tilapia gut samples collected in Hanoi had the most vital bacteriocin - producing ability and exhibited strong antibacterial activity simultaneously against Salmonella sp and Escherichia coli with antibacterial ring diameters of 16mm and 15mm, respectively On MRS medium supplemented with 3% glucose as a carbon source and 3% yeast extract as a nitrogen source, the strain HN1 was able to grow and produce the highest amount of bacteriocin The combination of morphological, physiological, biochemical characteristics and analysis of molecular biological sequences has identified the strain HN1 as Enterococcus faecium Keywords: Aquaculture, bacteriocin, Enterococcus ĐẶT VẤN ĐỀ Nuôi trồng thûy sân ngành sõn xuỗt thc phốm phỏt trin nhanh nhỗt trờn th gii vi tc tởng trỵng trung bỡnh hng nởm 8,8% 370 (Sahoo & cs., 2014) Ở Việt Nam, sõn lỵng nuụi trng thỷy sõn thỏng ổu nởm 2021 ỵc tớnh ọt 2.104,8 nghỡn tỗn, tởng 4,1% so vi cựng k nởm trỵc (quý II/2021 ọt 1.164,5 nghỡn tỗn, tởng 4,9%), ũ cỏ ọt 1.456,7 nghỡn tỗn, Phạm Hồng Hiển, Dương Văn Hoàn, Trần Thị Đào, Phạm Thị Dung, Nguyễn Thị Thu, Phạm Thị Thu Trang, Nguyễn Xuõn Cnh tởng 1,7%, tụm ọt 392,9 nghỡn tỗn, tởng 10,7% Sõn lỵng cỏ tra nởm 2021 ọt 705,1 nghỡn tỗn, tởng 1,0% so vi cựng k nởm trỵc, sõn lỵng tụm th chõn trớng ọt 254,6 nghỡn tỗn, tởng 15,4%, sõn lỵng tụm sỳ ọt 113,1 nghỡn tỗn, tởng 1,9% so vĆi kì nëm 2020 (Tổng cýc Thống kê, 2021) Để đâm bâo ngành nuôi trồng thûy sân phỏt trin bn vng thỡ vỗn quõn lý dch bnh nuụi trng thỷy sõn cổn ỵc kim soỏt chặt chẽ Hiện số bệnh vi khuèn gây thiệt häi nghiêm trọng đối vĆi nghề nuôi cá nhỵ bnh nhim trựng mỏu cỏ (bnh Vibriosis), bnh tríng (bệnh columnaris), bệnh liên cỉu, tý huyết trùng, bnh lao cỏ v bnh nhim trựng ỵng rut (Toranzo & cs., 2005; Mohanty & Sahoo, 2007; Noga, 2010) Việc s dýng khỏng sinh ỵc xem l phỵng phỏp iu trð phổ biến có hiệu q ni trồng thỷy sõn Tuy nhiờn, vic lọm dýng chỗt khỏng sinh dén tĆi tình träng kháng thuốc cûa mỉm bệnh ni trồng thûy sân đồng thąi gây mỗt an ton thc phốm v õnh hỵng ln ti chỗt lỵng nụng sõn Do vờy vic nghiờn cu bin phỏp phũng bnh, họn ch s dýng chỗt khỏng sinh nuụi trng thỷy sõn õm bõo nởng suỗt v chỗt lỵng nụng sõn hin ang l vỗn ỵc nhiu nh khoa hc quan tõm Bacteriocin cú bõn chỗt l cỏc phõn t protein ỵc tng hp ribosom cûa vi khuèn, có khâ nëng kháng läi tác nhân gây bệnh vi khuèn să täo thnh cỏc kờnh lm thay i tớnh thỗm cỷa mng tế bào Một số lội bacteriocin cịn có khâ nëng phồn giõi DNA, RNA v tỗn cụng vo lp peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào (Rattanachaikunsopon & cs., 2010) Bacteriocin khụng ỵc coi l mt nhúm khỏng sinh chúng thể phổ kháng khuèn chống läi chûng cûa lồi có quan hệ họ hàng gỉn; kháng sinh phát huy tác dýng Āc chế đối vĆi nhiều loäi vi sinh vêt gây bệnh, câ hột tính cûa kháng sinh bð hän chế, nú khụng cho thỗy bỗt k tỏc dýng ỵu tiờn đối vĆi lồi có họ hàng gỉn (Zacharof & Lovitt, 2012) Việc sàng lọc chûng vi sinh vờt cú khõ nởng sinh bacteriocin ó ỵc tin hnh nhiều nëm toàn giĆi Các chûng vi khuốn cú khõ nởng sinh bacteriocin ó ỵc tỡm thỗy nhỵ Lactobacillus helveticus PJ4 ỵc phõn lờp t h vi sinh vờt ỵng rut cỷa chut cú khõ nởng sinh bacteriocin PJ4 kháng läi Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa (Jena & cs., 2013) Chûng Enterococcus faecium CJNU 2524 có khâ nëng kiểm sốt mỉm bệnh gây bći Listeria monocytogenes (Yang & Moon, 2021) Chỷng Bacillus sp BV1 ỵc phõn lờp t nỵc sụng cú khõ nởng sinh bacteriocin khỏng läi vi khuèn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh tôm thẻ chõn trớng (Phọm Minh Tuỗn & cs., 2018) Tuy vic sàng lọc chûng vi sinh vêt có khâ nëng sinh bacteriocin ỵc thc hin trờn cỏc i tỵng khỏc nhau, nhỵng nghiờn cu tuyn chn chỷng vi khuốn phõn lêp tÿ ruột cá có khâ nëng kiểm sốt nguồn bệnh thuỷ sân cịn hän chế Chính vêy nghiên cu ny ỵc thc hin vi mong mun phỏt hin, xác đðnh chûng vi khuèn có khâ nëng sinh bacteriocin t ỵng rut cỏ nh hỵng ng dýng ngành nuôi trồng thuỷ sân PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thu thp mu Mộu vờt ỵc thu thờp theo Sahoo & cs (2015): Cỏc mộu rut cỏ ỵc thu thêp tÿ chợ täi số khu văc ć H Ni, Ngh An, Hõi Phũng v Hõi Dỵng sau ũ ỵc bõo quõn ỏ lọnh v vờn chuyn nhanh phịng thí nghiệm Sau mang phịng thớ nghim, cỏc mộu rut cỏ ny ỵc x lý riờng bit v sọch bờn ngoi bỡng nỵc mui sinh lý Natriclorid 0,9% lỗy phổn vờt chỗt bờn Quỏ trỡnh thu mộu v x lý mộu ỵc thăc tÿ tháng 08/2020 đến tháng 11/2020 Các chûng vi sinh vờt kim nh gm chỷng Salmonella sp ỵc phân lêp tÿ méu cá rô phi bð bệnh thu thờp t4ọi Hõi Phũng v Escherichia coli ỵc phõn lờp tÿ méu cá lëng bð bệnh thu thêp täi Nghệ An, ỵc bõo quõn, lỵu tr tọi phũng thớ nghim Bộ môn Công nghệ vi sinh, Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam 371 Phân lập, tuyển chọn định danh chủng vi khuẩn Enterococcus faecium HN1 có khả sinh bacteriocin 2.2 Phân lập vi khun lactic Phỵng phỏp ỵc thc hin theo Sahoo & cs (2015) Một gram méu ruột cá qua xā lý, ỵc cớt thnh cỏc mõnh nhú ci s vụ trựng v ỵc nghin mn giõi phúng vi sinh vờt bờn rut, mộu ó nghin mn ỵc chuyển vào bình tam giác bổ sung 99ml dung dðch nỵc mui sinh lý vụ trựng, lớc vi tc 160 vủng/phỳt 30 phỳt, sau ũ lớng ỵc pha loóng 10-2 Dung dch mộu ỵc pha loóng ti pha loóng 10-5 Lỗy 100àl dung dch mộu cỏc pha loóng 10-3, 10-4, 10-5 cỗy trõi trờn ùa mụi trỵng MRS (g/l: Glucose 20,0; cao tht 10,0; cao nỗm men 5,0; peptone 10,0; tween 80 1ml, triamonium citrate 2,0; K2HPO4.3H2O 2,0; CH3COONa 5,0; MgSO4.7H2O 0,58; MnSO4.4H2O 0,28; CaCO3 5,0; agar 15,0; pH = 6,5 ± 0,2), nuôi ć 37C 48 gią điều kiện hiếu khí Tÿ méu phân lêp chọn khuèn lọc c trỵng cho vi khuốn lactic Cỏc dọng khuốn läc tríng đýc, khơng màu, bą láng, lồi, bìa ngun hoc chia thựy, kớch thỵc nhú, cú khõ nởng phồn giõi CaCO3 ỵc cỗy chuyn sang mụi trỵng MRS lm thuổn Cỏc chỷng phõn lờp sau ũ ỵc nhum Gram để quan sát đặc điểm hình thái tế bào (Barrow & Feltham 1993) 2.3 Khảo sát khả kháng vi sinh vật kiểm định chủng vi khuẩn phõn lp c Phỵng phỏp ỵc thc hin theo Hernandez & cs (2005) Cỏc chỷng vi khuốn phõn lờp ỵc nuụi cỗy 5ml mụi trỵng MRS lúng 30C 48 gi Sau ũ, 1ml dch nuụi cỗy ỵc ly tâm ć 4C vĆi tốc độ 10.000 vòng/phút 10 phút, thu phỉn dðch phía điều chỵnh pH 6,5 bìng NaOH để lội bó tác dýng cûa axit lactic Một trëm micro-lít dðch ỵc nhú vo cỏc ging thọch trờn ùa petri ó cỗy vi khuốn kim nh trỵc ũ ỵc nuụi ng nghim cha 3ml mụi trỵng LB lúng 30C 24 gi ùa thọch sau ũ ỵc t 4C gi ri ỵc chuyn vo tỷ nuụi 30C quan sát kết quâ sau 12 gią nuôi cỗy Hoọt tớnh khỏng khuốn cỷa cỏc chỷng phõn lờp ỵc th hin qua vũng khỏng khuốn xuỗt hin quanh ging thọch v 372 ỵc xỏc nh bỡng hiu s gia ỵng kớnh vũng khỏng khuốn v ỵng kớnh ging thọch D = D d (D: ỵng kớnh vũng khỏng khuốn (mm), d: ỵng kớnh ging thọch (mm)) 2.4 Sàng lọc chủng vi khuẩn có khả sinh bacteriocin 2.4.1 Phng phỏp x lý nhit Phỵng phỏp ỵc thăc theo Ogunbanwo & cs (2003), Rajaram & cs (2010): Cỏc chỷng vi khuốn ó ỵc xỏc nh cú khõ nởng khỏng vi sinh vờt kim nh ỵc nuụi cỗy v x lý dch sau nuụi cỗy theo phỵng phỏp mụ tõ mýc 2.3 v ỵc x lý ć nhiệt độ 40C, 60C, 80C, 100C, 30 phút 121C 15 phút sau đò xác đðnh khõ nởng khỏng vi sinh vờt kim nh nhỵ phỵng pháp mơ tâ phía 2.4.2 Xử lý enzyme phõn gii protein Thớ nghim ỵc thc hin theo Marwa & cs (2015) Cỏc chỷng vi khuốn ó ỵc xỏc đðnh có khâ nëng kháng vi sinh vêt kiểm đðnh ỵc nuụi cỗy v x lý dch sau nuụi cỗy theo phỵng phỏp mụ tõ mýc 2.3 sau ũ ỵc x lý vi proteinase K (Bio Basic): Hai trởm micro-lớt dch ỵc ỷ vi 10àl proteinase K nng 10 mg/ml, ć 37C gią, sau đò đun nịng ć 100C phút để lội bó tỏc ng cũn lọi cỷa proteinase K Mộu ỵc kim tra hoọt tớnh khỏng khuốn bỡng phỵng phỏp khuch tỏn trờn ùa thọch nhỵ ó mụ tõ phớa trờn Cỏc giếng thäch khâ nëng kháng khuèn cho thỗy chỗt khỏng khuốn cú th cú bõn chỗt l protein nờn ó b phõn giõi bi proteinase K; ngỵc lọi vũng khỏng khuốn xuỗt hin quanh ging thọch cho thỗy chỗt khỏng khuốn khụng phõi l protein 2.5 Kho sát ảnh hưởng thành phần môi trường nuôi cấy lên khả sản xuất bacteriocin chủng vi khun Thớ nghim ỵc thc hin theo Nguyn Vởn Thnh & Nguyễn Ngọc Trai (2012) Chûng vi khuèn có khâ nởng sinh bacteriocin mọnh nhỗt ỵc nuụi cỗy mụi trỵng MRS lúng cú b sung Glucose vi hm lỵng 1, 2, 3% w/v, cao nỗm men vi hm lỵng 1, 2, 3% w/v, NaCl Phạm Hồng Hiển, Dương Văn Hoàn, Trần Thị Đào, Phạm Thị Dung, Nguyễn Thị Thu, Phm Th Thu Trang, Nguyn Xuõn Cnh vi hm lỵng 1, 2, 3% w/v ỵc dựng khõo sỏt õnh hỵng cỷa thnh phổn mụi trỵng nuụi cỗy lờn s hỡnh thnh bacteriocin Hoọt tớnh bacteriocin ỵc xỏc nh bỡng phỵng phỏp khuch tỏn trờn ùa thọch 2.6 nh danh chủng vi khuẩn DNA cûa chûng vi khuèn tuyển chọn ỵc tỏch chit theo phỵng phỏp mụ tõ bi Masoomi & cs (2016) Gen mã hóa cho vùng 16S rRNA cỷa chỷng ỵc tuyn chn ỵc nhõn lờn bỡng k thuêt PCR vĆi cặp mồi 27F (5’-AGAGTTTGA TCMTGGCTCAG-3’) 1492R (5- TACGG YTACCTTGTTACGACTT-3) Sõn phốm PCR ỵc giõi trỡnh t bỡng phỵng phỏp Sanger cõi tin Mc tỵng ng trình tă gen mã hóa 16S rRNA cûa chûng nghiờn cu ỵc so sỏnh vi cỏc chỷng ó cụng bố Genbank sā dýng công cý tra cĀu Blast Sā dýng phæn mềm MEGAX để xây dăng cåy xác đðnh mối quan hệ di truyền, vĆi độ tin cêy ỵc tớnh bỡng thuờt toỏn Bootstrap vi 1.000 lổn lp läi Dăa vào phân loäi giá trð Bootstrap để xác đðnh mối quan hệ di truyền cûa chûng nghiên cĀu Bảng Đặc điểm hình thái chủng phân lập Ký hiệu chủng HN1 Nguồn gốc phân lập Cá rơ phi - Hà Nội Đặc điểm hình thái Khuẩn lạc tròn nhỏ, màu trắng sữa, bề mặt lồi Cầu khuẩn, Gram + HN2 Cá trắm - Hà Nội HN3 Cá trắm - Hà Nội Khuẩn lạc tròn, màu trắng đục, bóng, lồi Hình que ngắn, Gram + Khuẩn lạc trịn nhỏ, bề mặt trơn bóng Trực khuẩn, Gram + NA1 Cá diêu hồng - Nghệ An Khuẩn lạc tròn màu trắng đục, bề mặt lồi Trực khuẩn, Gram + NA1.1 Cá diêu hồng - Nghệ An Khuẩn lạc tròn nhỏ, màu trắng ngà, viền nhăn Cầu khuẩn, Gram + NA1.3 Cá diêu hồng - Nghệ An Khuẩn lạc tròn nhỏ, màu trắng đục, dẹt Cầu khuẩn, Gram + NA2 Cá diêu hồng - Nghệ An NA3 Cá diêu hồng - Nghệ An Khuẩn lạc tròn, màu trắng sữa, bề mặt lồi Cầu khuẩn, Gram + Khuẩn lạc tròn, màu trắng sữa, bề mặt lồi Cầu khuẩn, Gram + HP1.1 Cá lăng - Hải Phòng Khuẩn lạc tròn, bề mặt nhơ, màu trắng ngà, có chấm tâm Trực khuẩn, Gram + HP1.2 Cá lăng - Hải Phòng Khuẩn lạc tròn nhỏ, màu trắng đục, bề mặt lồi Trực khuẩn, Gram + HP1.3 Cá lăng - Hải Phòng HP2.1 Cá trắm - Hải Phòng Khuẩn lạc tròn nhỏ, màu trắng trong, bề mặt lồi Cầu khuẩn, Gram + Khuẩn lạc tròn, nhỏ, màu trắng đục, bề mặt lồi Trực khuẩn, Gram + HP2.2 Cá trắm - Hải Phòng Khuẩn lạc tròn, bề mặt trơn, màu trắng đục Trực khuẩn, Gram + HP2.3 Cá trắm - Hải Phòng Khuẩn lạc nhỏ, màu trắng sữa, bề mặt trơn Trực khuẩn, Gram + HP2.4 Cá trắm - Hải Phòng HD1 Cá rơ phi - Hải Dương Khuẩn lạc trịn nhỏ, bề mặt lồi, bóng Trực khuẩn, Gram + Khuẩn lạc trịn, màu trắng trong, dẹt Cầu khuẩn, Gram + 373 Phân lập, tuyển chọn định danh chủng vi khuẩn Enterococcus faecium HN1 có khả sinh bacteriocin KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập vi khuẩn lactic Tÿ 18 méu ruột cá khác bao gồm cá lëng, cỏ trớm, cỏ diờu hng, cỏ rụ phi ỵc thu thờp t cỏc a phỵng khỏc nhỵ H Ni, Hõi Phũng, Hõi Dỵng, Ngh An trờn mụi trỵng MRS có bổ sung 0,5% CaCO3, 16 chûng vi khn cị c im hỡnh thỏi khuốn lọc c trỵng cỷa vi khuốn lactic ó ỵc phõn lờp Tỗt cõ cỏc chỷng có khn läc trịn, bóng, bìa ngun bìa viền, có màu tríng, tríng sĂa tríng đýc có khâ nëng phån giâi CaCO3 theo mô tâ cûa Kandler & Weiss (1986) (Bâng 1) Mặt khác, chûng phân lờp ỵc u l vi khuốn Gram dỵng vi 07 chûng cæu khuèn 09 chûng trăc khuèn Cỏc Escherichia coli chỷng vi khuốn ny ỵc chn sā dýng cho nghiên cĀu 3.2 Khảo sát khả kháng vi sinh vật kiểm định cỏc chng phõn lp Cỏc chỷng phõn lờp ỵc kim tra khõ nởng c ch sinh trỵng i vi hai chûng vi sinh vêt kiểm đðnh Salmonella sp Escherichia coli bỡng phỵng phỏp khuch tỏn trờn ùa thọch Trong tổng số 16 chûng phân lêp, chûng vi khuèn có khâ nëng đối kháng vĆi hai chûng vi khn kiểm đðnh (Hình 1) Trong đị chûng HN1 cho thỗy khõ nởng khỏng mọnh ng thi vi cõ hai chỷng vi khuốn kim nh vi ỵng kớnh vũng khỏng khuốn lổn lỵt l 16mm (Salmonella sp.) v 15mm (Escherichia coli) (Hình 2) Salmonella sp Hình Hoạt tính kháng khuẩn 09 chủng phân lập Hình Đường kính vòng kháng khuẩn 09 chủng phân lập 374 Phạm Hồng Hiển, Dương Văn Hoàn, Trần Thị Đào, Phạm Thị Dung, Nguyễn Thị Thu, Phạm Thị Thu Trang, Nguyễn Xuân Cảnh Kết quâ phù hợp vĆi kết quâ nghiên cu cỷa nhiu tỏc giõ ó ỵc cụng b trỵc ồy Nghiờn cu cỷa Wakil & Osamwonyi (2012) cho thỗy Lactobacillus brevis có khâ nëng kháng Escherichia coli Salmonella spp vi ỵng kớnh vũng khỏng khuốn lổn lỵt l 10 ± 0,1mm ± 0,1mm; chûng Lactobacillus plantarum cú khõ nởng khỏng Salmonella spp vi ỵng kớnh vũng kháng khuèn 10 ± 0,1mm Nwafor (2014) công bố rìng lồi vi khn lactic: Lactobacillus acidophilus, Lactococcus lactis, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei, Leuconotoc sp., Streptococcus thermophilus, Streptococcus cremoris, Streptococcus pyogenes thể khâ nëng kháng vi khuốn Escherichia coli vi ỵng kớnh vũng khỏng khuốn dao động tÿ ± 0,05mm đến ± 0,25mm, cú khõ nởng khuốn khỏng Salmonella typhi vi ỵng kớnh vòng kháng khuèn dao động tÿ ± 0,2mm đến 10 ± 0,02mm Do vêy, 09 chûng phân lêp ỵc tuyn chn sng lc chỷng vi khuốn cú khâ nëng sinh bacteriocin 3.3 Sàng lọc chủng vi khun cú kh nng sinh bacteriocin Bacteriocin ỵc xỏc nhv phõn loọi da trờn cỗu trỳc hoỏ hc, lỵng phân tā, tính nhäy câm vĆi enzyme, cĄ chế diệt khn, khâ nëng chðu nhiệt, hột tính kháng khn (Kkonienë & cs., 2017) Trong đò, xác đðnh khâ nëng chðu nhit v tớnh nhọy cõm vi enzyme l cỏc phỵng phỏp hiu quõ nhỗt giỳp xỏc nh bacteriocin 3.3.1 X lớ nhit Dch nuụi cỗy cỷa 09 chỷng vi khuốn tuyn chn ỵc x lý cỏc mc nhit khỏc kim tra bõn chỗt cỷa chỗt khỏng khn có phâi protein hay khơng Thí nghiệm cho thỗy chỗt khỏng khuốn ỵc sinh bi 09 chûng tuyển chọn bền nhiệt khoâng nhiệt t 40C n 80C, tr chỷng NA2 b mỗt hột tính hồn tồn xā lý ć nhiệt độ 60C v 80C Hoọt tớnh khỏng khuốn b mỗt hon ton x lý dch nuụi cỗy 09 chỷng tuyn chọn ć 100C 30 phút 121C 15 phút, trÿ chûng HP2.1 vén khâ nëng kháng khuèn sau xā lý dðch nuôi ć 100C 30 phỳt (Hỡnh 3) Cỏc nghiờn cu trỵc ũ u chợ rỡng chỗt khỏng khuốn sinh b mỗt hoọt tớnh nhit cao cú bõn chỗt l bacteriocin Marwa & cs (2015) cho thỗy chỗt khỏng khuốn sinh bći vi khuèn Lactobacillus acidophilus DSM 20079 có bân chỗt l bacteriocin qua thớ nghim xỏc nh bn nhit cỷa chỗt khỏng khuốn Nởm 2011, Castro & cs cỹng ó chợ rỡng bacteriocin ỵc sinh t chûng vi khuèn lactic bền nhiệt ć nhiệt độ 70C 15 phút, 85C 30 phút, 100C 15 phỳt Nhỵ vờy, chỗt khỏng khuốn ỵc sinh bći 08 chûng vi khuèn bao gồm HP1.1, HP2.1, HP2.2, NA1.1, NA1.3, NA3, HN1, HN2 có bân chỗt l protein v cú th l bacteiocin v ỵc sā dýng nghiên cĀu 3.3.2 Xử lí bng enzyme phõn gii protein Chỗt khỏng khuốn cỷa 08 chỷng vi khuốn tuyn chn ỵc x lý vi proteinase K tip týc xỏc nh bõn chỗt cỷa chỗt khỏng khuốn Kt quõ cho thỗy cỏc mộu sau ỷ vi proteinase K u b mỗt hoọt tớnh khỏng khuèn vĆi chûng Salmonella sp Escherichia coli (Hình 4) Marwa & cs (2015) ó kt luờn rỡng chỗt khỏng khuốn ỵc sinh bi chỷng Lactobacillus acidophilus DSM 20079 cú bõn chỗt l protein Do ũ, chỗt khỏng khuốn ny ỵc x lý vi proteinase K ó b mỗt hon ton hoọt tớnh khỏng khuốn vi Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis Escherichia coli Nghiên cĀu cûa Zendo & cs (2005) cỹng chợ rỡng chỗt khỏng khuốn sinh bi Enterococcus mundtii QU2 cú bõn chỗt l protein nờn b mỗt hon ton hoọt tớnh khỏng khuốn sau ỵc x lớ vi proteinase K T cỏc kt quõ nghiờn cu ó ỵc cụng b kt hp vi kt quõ ỵc th hin hỡnh cú th kt luờn rỡng chỗt khỏng khuốn ỵc sinh bi 08 chỷng vi khuốn tuyn chn cú bõn chỗt l protein v cú th l bacteriocin Nhỵ vờy, nghiờn cu ny, 08 chỷng tuyn chn sinh chỗt kháng khuèn bền ć nhiệt độ cao, bð phân giâi bći proteinase K, thể hột tính kháng khn vĆi Salmonella sp 375 Phân lập, tuyển chọn định danh chủng vi khuẩn Enterococcus faecium HN1 có khả sinh bacteriocin Escherichia coli theo cĄ chế täo cỏc hp chỗt tỵng t nhỵ bacteriocin Trong ũ, chûng HN1 có khâ nëng sinh bacteriocin thể hột tính kháng khn mänh đồng thąi vĆi câ hai chỷng vi khuốn kim nh ỵc tuyn chn thc nghiên cĀu 3.4 Ảnh hưởng thành phần môi trường nuôi cấy đến khả sinh bacteriocin ca chng HN1 Chỷng vi khuốn HN1 ỵc nui cỗy mụi trỵng MRS cú thay i nng cỏc theo tỵ lệ khác nhìm xác đðnh điều ni cỗy thớch hp nhỗt cho chỷng HN1 tng hp bacteriocin trờn chỗt kin sinh Kt quõ thớ nghim cho thỗy thnh phổn mụi trỵng nuụi cỗy cú õnh hỵng rỗt lĆn đến hột tính bacteriocin cûa chûng HN1 (Hình 5) Hột tính kháng vi khn kiểm đðnh cûa bacteriocin sinh bi chỷng HN1 nuụi mụi trỵng MRS có bổ sung 3% glucose tëng 20% đối vĆi Salmonella sp 50% đối vĆi Escherichia coli so vĆi nuụi mụi trỵng cú b sung 1% glucose Tỵng t nhỵ vờy, nuụi mụi trỵng cú b sung 3% yeast extract, hột tính kháng khn cûa bacteriocin tëng 50% đối vĆi Salmonella sp 16,7% đối vi Escherichia coli vi nuụi mụi trỵng cú bổ sung 1% yeast extract Điều giâi thích việc bổ sung glucose yeast extract cung cỗp ngun acid amin cỹng nhỵ ngun nit chûng HN1 tëng khâ nëng tổng hợp bacteriocin gây Āc chế să phát triển cûa vi sinh vêt kiểm đðnh Tuy nhiờn, mụi trỵng b sung NaCl cũn lọi việc bổ sung thêm NaCl chỵ làm giâm khơng tëng hột tính cûa bacteriocin Nghiên cĀu cûa Ogunbanwo & cs (2003) cỹng cho thỗy, b sung glucose, yeast extract vo mụi trỵng nuụi cỗy lm tởng hoọt tớnh khỏng khuốn cỷa bacteriocin ỵc sinh bi chỷng Lactobacillus brevis OG1; bổ sung NaCl vào môi trỵng lọi lm giõm hoọt tớnh khỏng khuốn cỷa bacteriocin 3.5 Định danh chủng vi khuẩn Đặc điểm hình thái, tế bào nhĂng tiêu chí quan trọng góp phỉn việc phân lội, xác đðnh vi sinh vêt Trong nghiên cĀu này, chûng HN1 cò đặc điểm hình thái khn läc trđn đều, bề mặt lồi, cú mu trớng sa, kớch thỵc nhú (Hỡnh 6A) Kt quâ quan sát đặc điểm hình thái tế bào bìng kính hiển vi quang học cị độ phịng đäi 1000x cho thỗy, chỷng HN1 l vi khuốn Gram dỵng, hỡnh cổu (Hỡnh 6B) nh danh bỡng phỵng phỏp sinh học phân tā, độn gen mã hóa vùng 16S rRNA cỷa chỷng HN1 ỵc khuch ọi bỡng cp mi cp mi 27F v 1492R Kt quõ in di cho thỗy chợ cú vọch bởng DNA nhỗt cũ kớch thỵc khoõng 1.500bp phự hp vi kớch thỵc lý thuyt cú th ọt ỵc nhõn bỡng oọn mi ny (Hình 7) Hình Ảnh hưởng nhiệt độ đến chất kháng khuẩn sinh 09 chủng tuyển chọn 376 Phạm Hồng Hiển, Dương Văn Hoàn, Trần Thị Đào, Phạm Thị Dung, Nguyễn Thị Thu, Phạm Thị Thu Trang, Nguyễn Xuân Cảnh Hình Ảnh hưởng proteinase K đến chất kháng khuẩn sinh 08 chủng tuyển chọn Ghi chú: G: Glucose; Y: Yeast extract; N: NaCl Hình Ảnh hưởng mơi trường ni cấy đến khả sinh bacteriocin chủng HN1 (A) (B) Hình Hình thái khuẩn lạc (A), hình thái tế bào (B) chủng HN1 377 Phân lập, tuyển chọn định danh chủng vi khuẩn Enterococcus faecium HN1 có khả sinh bacteriocin Chûng vi khn HN1 nìm nhánh vĆi chûng Enterococcus faecium DSM 20477 vĆi giá trð Bootstap 95% (Hình 8) Kết quâ so sánh trỡnh t cho thỗy, chỷng HN1 cú mc tỵng đồng vĆi chûng Enterococcus faecium DSM 20477 99,91% Xét v giỏ tr tin cờy v mc tỵng HN1 Marker đồng chûng HN1 vĆi chûng Enterococcus faecium DSM 20477 giống Chính vêy, kết hợp đặc điểm sinh học sinh học phân tā kết luên chûng HN1 có quan hệ họ hàng gổn gỹi vi Enterococcus faecium v ỵc t tờn l Enterococcus faecium HN1 ĐC - 1.500bp Hình Sản phẩm PCR đoạn gen mã hóa vùng 16S rRNA chủng HN1 Enterococcus saigonensis VE80 Enterococcus hirae HN1 Enterococcus faecium DSM 20477 Enterococcus villorum NBRC 100699 Enterococcus avium ATCC 14025 Enterococcus malodoratus ATCC 43197 Enterococcus plantarum CCM 7889 Enterococcus sulfureus NBRC 100680 Enterococcus camelliae NBRC 101868 Enterococcus saccharolyticus subsp Taiwanensis 812 Hình Cây phân loại chủng HN1 378 Phạm Hồng Hiển, Dương Văn Hoàn, Trần Thị Đào, Phạm Thị Dung, Nguyễn Thị Thu, Phạm Thị Thu Trang, Nguyễn Xuân Cảnh Cỏc nghiờn cu trỵc ũ u chợ rỡng vi khuèn Enterococcus faecium sā dýng để bổ sung vào chế phèm probiotic, số ỵc thỵng hoỏ cho thỗy an ton v hiệu quâ Nghiên cĀu cûa Qiao & cs (2020) c im cỷa enterocin TJUQ1, mt loọi bacteriocin ỵc sõn xuỗt bi vi khuốn Enterococcus faecium TJUQ1 cú khõ nởng khỏng khuốn rng giỳp khỏng lọi cỏc mổm bnh nhỵ Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli Salmonella enterica Nghiên cĀu cüng chỵ rìng enterocin TJUQ1 làm tëng độ dén điện ngội bào, kích hột giâi phóng vêt liu hỗp thý tia cc tớm, ATP v LDH, v thêm chí gây phân giâi thành phỉn t bo cỷa Listeria monocytogenes CMCC 1595 cho thỗy enterocin TJUQ1 l mt chỗt bõo quõn tim nởng cho ngnh công nghiệp thăc phèm Nghiên cĀu cûa Sonsa & cs (2015) đặc điểm cûa bacteriocin sinh bći Enterococcus faecium CN-25 cho thỗy chỷng vi khuốn ny s hu đồng thąi câ gen enterocin A B có phổ kháng khuèn cao ć pH 2, nồng độ Āc chế tối thiểu vĆi vi khuèn Listeria monocytogenes TISTR 1327 2,38 µg/ml, an tồn đối vĆi sân phèm cá lên men Hanchi & cs (2018) báo cáo rìng vi khuốn thuc chi Enterococcus cú khõ nởng sõn xuỗt bacteriocin sā dýng để bổ sung vào sõn phốm nhỵ chỗt bõo quõn t nhiờn, ch phốm sinh học, thĀc ën chën nuôi lăa chọn giúp thay thuốc kháng sinh Các tác giâ cüng cơng bố chế phèm sinh học Cernivet® FortiFlora® có chĀa Enterococcus faecium SF-68 Do vêy, chûng Enterococcus faecium HN1 nghiên cĀu có tiềm nëng vic sõn xuỗt bacteriocin, cổn cú thờm cỏc nghiờn cu sâu hĄn để bổ sung vào chế phèm sinh học phýc vý ngành nuôi trồng thuỷ sân KẾT LUẬN Trong nghiên cĀu này, tÿ 18 mộu rut cỏ ỵc thu thờp cỏc a im khỏc nhau, 16 chỷng vi khuốn lactic ó ỵc phõn lờp ỵc Trong ũ, 09 chỷng vi khuốn ỵc xỏc đðnh có khâ nëng sinh bacteriocin kháng läi câ hai chûng vi sinh vêt kiểm đðnh Chûng vi khuèn HN1 thể khâ nëng sinh bacteriocin khâ nëng kháng vi sinh vêt kiểm đðnh (Salmonella sp Escherichia coli) tt nhỗt ó ỵc xỏc nh l Enterococcus faecium HN1 ng thi, nghiờn cu cỹng ó xỏc nh ỵc iu kin mụi trỵng nuụi cỗy thớch hp chỷng Enterococcus faecium HN1 sinh bacteriocin tt nhỗt l mụi trỵng MRS lúng cú b sung glucose v cao nỗm men vi tợ l 3% LI CM N Nghiờn cu ỵc thc hin dỵi s h tr kinh phớ cỷa ti cỗp Hc vin nụng nghip Vit Nam mó s T2021-12-20VB TÀI LIỆU THAM KHẢO Barrow G.I & Feltham R.K.A (1993) Cowan and Steel‘s manual for the indentification of medical bacteria, 3rd edn Cambridge Univesity Press, Cambridge 262 Castro M.P., Palavecino N.Z., Herman C., Garro O.A & Campos C.A (2011) Lactic acid bacteria isolated from artisanal dry sausages: Characterization of antibacterial compounds and study of the factors affecting bacteriocin production Meat Science 87: 321-329 Hanchi H., Mottawea W., Sebei K & Hammami R (2018) The genus Enterococcus: Between probiotic potential and safety concerns an update Frontiers in Microbiology 9: 1791 Hernandez D., Cardell E & Zarate V (2005) Antimicrobial activity of lactic acid bacteria isolated from Tenerife cheese: initial characterization of plantaricin TF711, a bacteriocin-like substance produced by Lactobacillus plantarum TF711 Journal of Applied Microbiology 99: 77-84 Jena P.K., Trivedi D., Chaudhary H., Sahoo T.K & Seshadri S (2013) Bacteriocin PJ4 active against enteric pathogen produced by Lactobacillus helveticus PJ4 isolated from gut microflora of Wistar Rat (Rattus norvegicus): partial purification and characterization of bacteriocin Applied Biochemistry and Biotechnology 169: 2088-2100 Kandler O & Weiss N (1986) Regular, non-sporing gram-positive rods In Sneath H.A., Mair N.S., Sharpe M.E & Holt J.G (Eds.) Bergey’s manual of systematic bacteriology, Williams and Wilkins, Baltimore pp 1208-1234 379 Phân lập, tuyển chọn định danh chủng vi khuẩn Enterococcus faecium HN1 có khả sinh bacteriocin Kaðkonienë V., Stankevièius M., Survilienë B K., Naujokaitytë G., Ðernienë L., Mulkytë K., Malakauskas M & Maruðka A (2017) Current state of purification, isolation and analysis of bacteriocins produced by lactic acid bacteria Applied Microbiology and Biotechnology 101: 1323-1335 Marwa A.S., Hamdi M.A, Ekbal M.I.A., Adham M.A & Sobhy A.El.S (2015) Effect of pH, heat treatments and proteinase K enzyme on the activity of Lactobacillus acidophilus bacteriocin Benha Veterinary Medical Journal 28(1): 210-215 Masoomi A.F., Jabbari L., Khayam N.R & Aalami A (2016) A simple and rapid system for DNA and RNA isolation from diverse plants using handmade kit Protocol Exchange Mohanty B.R & Sahoo P.K (2007) Edwardsiellosis in fish: A brief review Journal of Biosciences 32: 1331-1344 Nguyễn Văn Thành & Nguyễn Ngọc Trai (2012) Phân lập tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus sp Có khả ức chế vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ đốm đỏ cá tra Tạp chí khoa học, Trường Đại học Cần Thơ 23a: 224-234 Noga E.J (2010) Fish Disease: Diagnosis and Treatment, Second Edition Wiley-Blackwell: Ames, IA pp 13-48, 143-147, 375-420 Nwafor O.E (2014) Isolation and identification of lactic acid bacterial (LAB) from yoghurt and antibacterial activity against some clinical isolates International Journal of Food Nutrition and Safety 5(1): 31-38 Ogunbanwo S.T., Sanni A.I & Onilude A.A (2003) Influence of cultureal conditions on the production of bacteriocin by Lactobacillus brevis OG1 African Journal of Biotechnology 2(7): 179-184 Phạm Minh Tuấn, Nguyễn Thị Hồng Phấn & Trần Anh Thư (2018) Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sinh bacteriocin kháng Vibrio parahaemolyticus gây bệnh tơm Tạp chí Khoa học cơng nghệ Thực phẩm 15(1): 46-56 Qiao X., Du R., Wang Y., Han Y & Zhou Z (2020) Purification, characterization and mode of action of enterocin, a novel bacteriocin produced by Enterococcus faecium TJUQ1 International Journal of Biological Macromolecules 14(1): 151-159 Rajaram G., Manivasagan P., Thilagavathi B & Saravanakumar A (2010) Purification and 380 characterization of a bacteriocin produced by Lactobacillus lactis isolated from marine environment Advanced Journal of Food Science and Technology 2(2): 138-144 Rattanachaikunsopon P & Phumkhachorn P (2010) Lactic acid bacteria: their antimicrobial compounds and their uses in food production Annals of Biological Research 1(4): 218-228 Sahoo T.K., Jena P.K., Nagar N., Patel A.K & Seshadri S (2015) In vitro evaluation of probiotic properties of lactic acid bacteria from the gut of Labeo rohita and Catla catla Probiotics and Antimicrobial Proteins 7(2): 126-136 Sahoo T.K., Jena P.K., Patel A.K & Seshadri S (2014) Bacteriocins and their applications for the treatment of bacterial diseases in aquaculture: a review Aquaculture Research 47(4): 1013-1027 Sonsa A.N., Rodthong S., Chikindas M.L & Yongsawatdigul J (2015) Characterization of bacteriocin produced by Enterococcus faecium CN-25 isolated from traditionally Thai fermented fish roe, Food Control 54: 308-316 Tổng cục thống kê (2021) Thông cáo báo chí tình hình kinh tế - xã hội quý II tháng đầu năm 2021 Truy cập từ https://www.gso.gov.vn/du-lieuva-so-lieu-thong-ke/2021/06/thong-cao-bao-chive-tinh-hinh-kinh-te-xa-hoi-quy-ii-va-6-thang-daunam-2021 ngày 04/08/2021 Toranzo A.E., Magarinos B & Romalde J.L (2005) A review of the main bacterial fish diseases in mariculture systems Aquaculture 246: 37-61 Wakil S.M & Osamwonyi U.O (2012) Isolation and screening of antimicro-bial producing lactic acid bacteria from fermenting millet gruel International Research Journal of Microbiology 3(2): 72-79 Yang J.M & Moon G.S (2021) Partial characterization of an anti-listerial bacteriocin from Enterococcus faecium CJNU 2524 Food Science of Animal Resources 41(1): 164-171 Zacharof M.P & Lovitt R.W (2012) Bacteriocins produced by lactic acid bacteria: A review article APCBEE Procedia 2: 50-56 Zendo T., Eungruttanagorn N., Fujioka S., Tashiro Y., Nomura K., Sera Y., Kobayashi G., Nakayama J., Ishizaki A & Sonomoto K (2005) Identification and production of a bacteriocin from Enterococcus mundtii QU isolated from soybean Journal of Applied Microbiology 99: 1181-1190 ... Công nghệ vi sinh, Khoa Công nghệ sinh học, Học vi? ??n Nông nghiệp Vi? ??t Nam 371 Phân lập, tuyển chọn định danh chủng vi khuẩn Enterococcus faecium HN1 có khả sinh bacteriocin 2.2 Phân lập vi khun... thái tế bào (B) chủng HN1 377 Phân lập, tuyển chọn định danh chủng vi khuẩn Enterococcus faecium HN1 có khả sinh bacteriocin Chûng vi khn HN1 nìm nhánh vĆi chûng Enterococcus faecium DSM 20477... Dương Khuẩn lạc trịn nhỏ, bề mặt lồi, bóng Trực khuẩn, Gram + Khuẩn lạc trịn, màu trắng trong, dẹt Cầu khuẩn, Gram + 373 Phân lập, tuyển chọn định danh chủng vi khuẩn Enterococcus faecium HN1 có khả