báo cáo thực hành phát triển sản phẩm sinh học

BÀI 1: TẠO MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY NẤM TRICHODERMA 1.1 Đặt vấn đề Hiện nay nước ta đang đối mặt với một số thực trạng về ô nhiễm môi trường, phá hoại do loài nấm, cỏ dại, sâu bệnh gây ra và

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

PHÁT TRIỂN SẢN PHẨM SINH HỌC

Sinh viên thực hiện : NGUYỄN ĐÔNG THIÊN

Mã số sinh viên : 20126363

TP Hồ Chí Minh, tháng 4 năm 2023

MỤC LỤC

MỤC LỤC 2

DANH SÁCH HÌNH ẢNH 3

BÀI 1: TẠO MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY NẤM TRICHODERMA 4

1.1 Đặt vấn đề 4

1.2 Tổng quan về nấm Trichoderma 4

1.2.1 Phân loại 5

1.2.2 Đặc điểm hình thái 5

1.2.3 Đặc điểm sinh hóa 6

1.2.4 Ứng dụng của nấm Trichoderma 6

1.3 Các bước tiến hành 7

1.3.1 Phối trộn môi trường nuôi cấy 7

1.3.2 Bổ sung chủng gốc nấm Trichoderma vào bịch môi trường nuôi cấy 9

1.4 Kết quả 10

BÀI 2: KIỂM TRA MẬT ĐỘ VI KHUẨN 11

2.1 Nguyên tắc 11

2.2 Vật liệu và thiết bị 11

2.3 Các bước tiến hành 11

2.4 Kết quả 13

DANH SÁCH HÌNH ẢNH

Hình 1 Nấm Trichoderma trên các đĩa môi trường. …5

Hình 2 Các chế phẩm sinh học từ Trichoderma …7

Hình 3 Phối trộn đều các nguyên liệu …7

Hình 4 Cân 400g hỗn hợp và đóng gói môi trường …8

Hình 5 Hấp khử trùng môi các bịch môi trường meo gạo …8

Hình 6 Bình dung dịch gốc trước và sau khi pha loãng …9

Hình 7 Các bịch môi trường ngay sau khi thêm dịch gốc …9

Hình 8 Các bịch môi trường ngay sau khi thêm dịch và khi thêm dịch sau 1 tuần …10

Hình 9 Bịch môi trường sau khi ủ 1 tuần …10

Hình 10 Pha dung dịch huyền phù 10 và tiến hành lắc trong 15 phút0 …11

Hình 11 Pha loãng tới các nồng độ thích hợp …12

Hình 12 Hút dịch pha loãng vào đĩa và tiến hành cấy trang …12

Hình 13 Đĩa thạch ở nồng độ 10 sau 3 ngày ủ (lặp lại 3 lần)-3 …13

Hình 14 Đĩa thạch ở nồng độ 10 sau 3 ngày ủ (lặp lại 3 lần)-4 …14

Hình 15 Đĩa thạch ở nồng độ 10 sau 3 ngày ủ (lặp lại 3 lần)-5 …14

BÀI 1: TẠO MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY NẤM TRICHODERMA 1.1 Đặt vấn đề

Hiện nay nước ta đang đối mặt với một số thực trạng về ô nhiễm môi trường, phá hoại do loài nấm, cỏ dại, sâu bệnh gây ra và dễ bị ngộ độc bởi việc dùng nhiều các hợp chất hóa học để bón cho cây với mục đích tăng năng suất cũng như phòng trừ vi nấm, sâu bệnh hại, … Trước giờ, người ta thường sử dụng thuốc bảo vệ thực vật để xử lý sâu bệnh, nấm hại… Tuy nhiên, việc sử dụng nhiều thuốc kháng nấm có thể đem lại nhiều tác hại vì những hóa chất này vốn rất độc hại và nguy hiểm, gây ung thư và nhiều bệnh khác cho người Trước hiện trạng này, việc nghiên cứu các chế phẩm sinh học phòng trừ nấm, sâu bệnh hại là điều hết sức cần thiết và cấp bách

Ngày nay, nền nông nghiệp hiện đại đang ngày càng chú trọng hơn trong việc sử dụng những sản phẩm từ sinh học và với lợi thế thân thiện với môi trường, ít tác dụng phụ, đem lại hiệu quả nhanh chóng giúp chúng đang dần trở thành xu thế của tương lai Một số tác nhân đang được chú ý là nấm kí sinh có khả năng đối kháng với một số vi nấm gây hại cho cây trồng điển hình như nấm Trichoderma Chúng có khả năng đối kháng mạnh với các loại nấm bệnh như: Rhizoctonia, Fusarium, … gây bệnh trên cây lúa, bắp, tiêu Đặc biệt, đây là vi nấm hoại sinh có khả năng sản sinh ra cá loại enzyme ngoại bào nên các chế phẩm enzyme từ loài nấm này được sử dụng trực tiếp hoặc phối hợp với các thuốc diệt cỏ để bảo vệ cây trái tránh bị thối rửa, vừa cải thiện hiệu quả sử dụng thuốc diệt nấm và vừa hiệu quả trong vấn đề bảo vệ môi trường

Từ đó, có thể ứng dụng chế phẩm sinh học từ nấm Trichoderma trong nông nghiệp

để tiêu diệt các tác nhân gây bệnh này giúp giải quyết mọi thách thức một cách bền vững

và thân thiện với môi trường

1.2 Tổng quan về nấm Trichoderma

Nấm Trichoderma là một loại nấm sống ở vùng rễ cây được chế thành sản phẩm vi sinh, có đặc tính sinh sản vô tính bằng những đính bào tử Conidia Chúng là một trong

những nhóm vi nấm gây nhiều khó khăn cho việc định danh, phân loại Nấm

Trichoderma gồm 5 nhóm: Pachybasium, Longibrachiatum, Trichoderma, Saturnisporum và Hypocreanum Trichoderma là nấm được tìm thấy nhiều ở trong tự

nhiên bao gồm trong đất, cây trồng, nơi có nhiều dinh dưỡng, chất hữu cơ, … Đây là nấm hoại sinh, tức là tự lấy chất dinh dưỡng từ xác động, thực vật và có khả năng ký sinh đối kháng với nhiều loại chất kháng khuẩn, nấm hại gây bệnh cây trồng Nấm này có thể tồn tại ở điều kiện lý tưởng khoảng 1 năm rưỡi nhưng có thể bị tiêu diệt bởi ánh nắng quá gắt

1.2.1 Phân loại

Giới: Fungi

Ngành: Ascomycota

Lớp: Euascomycetes

Bộ: Hypocreales

Họ: Hypoceaceae

Chi: Trichoderma

Hình 1 Nấm Trichoderma trên các đĩa môi trường.

1.2.2 Đặc điểm hình thái

nhánh nhiều, cành bào tử rất nhiều và không màu, đính ở đỉnh của cành bào tử Bào tử đính của Trichoderma là một khối tròn mọc lên ở đầu cuối của cuống sinh bào tử, mang các bào tử trần bên trong không có vách ngăn, không màu, liên kết nhau thành chùm nhỏ nhờ chất nhầy 3 Bào tử nấm thường có dạng hình trứng, oval hay elip tùy theo từng loài, đơn bào và có màu xanh đặc trưng, một số ít có màu trắng, màu vàng hay xanh xám Cuống bào tử là một nhóm sợi nấm bện vào nhau, có kích thước từ 1 – 7 µm, có hình đệm rất rắn chắc chắn

1.2.3 Đặc điểm sinh hóa

Tốc độ phát triển của loài nấm này tương đối nhanh và thành thục trong khoảng 5 – 7 ngày, chúng có thể đạt đường kính từ 2 - 9 cm sau khoảng 4 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ

lạc khác nhau và đây được xem là một trong những đặc điểm để nhận dạng và phân biệt

màu trắng, sau một thời gian sẽ chuyển sang màu xanh đậm hoặc xanh vàng khi có bào tử xuất hiện Bên cạnh đó, một số loài Trichoderma còn tạo ra mùi đặc trưng như

Trichoderma viride tạo mùi dừa Hầu hết các loài Trichoderma không có giai đoạn sinh

sản hữu tính và phương pháp sinh sản vô tính được di truyền cho thế hệ sau bằng nhiều

tốt trên các loại đất giàu dinh dưỡng hoặc trên tàn dư thực vật Do đó, chúng có khả năng

sử dụng nguồn hỗn hợp carbon (đường đơn và đường đa, hỗn hợp polysaccharide, amino acid) và nitrogen Đa số các dòng nấm này phát triển trong đất với độ pH từ 2,5 – 9,5 và phát triển tốt ở pH 4,5 – 6,5 Nhiệt độ có thể phát triển tối ưu của nấm thường là 25 –

30 C.o

1.2.4 Ứng dụng của nấm Trichoderma

Các loài nấm Trichoderma được sử dụng phổ biến trong nông nghiệp và sản xuất bia, rượu, enzyme, xơ sợi, dược phẩm và sản phẩm thủy sản Chúng cũng có tác dụng làm sạch đất và kiểm soát sâu bệnh hại Bên cạnh đó, nhiều gen có nguồn gốc từ Trichoderma có tiềm năng ứng dụng to lớn trong công nghệ chuyển gen để sản xuất ra cây trồng có khả năng kháng bệnh Tuy nhiên, hiện nay chưa có gen nào đưa ra thương mại hoá, nhưng các gen này và các gen từ nhiều loại vi khuẩn có lợi khác được xem là nguồn nguyên liệu cơ bản để sản xuất ra cây trồng có khả năng kháng bệnh Đặc biệt,

nấm Trichoderma còn được ứng dụng để làm chế phẩm sinh học và được sử dụng rộng

các loài nấm gây thối rễ, làm “thuốc kháng sinh” cho cây trồng, giúp rễ cây luôn chắc khỏe và tăng cường hệ vi sinh vật có ích trong đất canh tác, …

Hình 2 Các chế phẩm sinh học từ Trichoderma.

1.3 Các bước tiến hành

1.3.1 Phối trộn môi trường nuôi cấy

Bước 1: Chuẩn bị nguyên liệu bao gồm: 10 kg gạo tấm, 150 g trấu, 100 g nitơ, 650 mL

nước

Bước 2: Trộn đều hỗn hợp hai nguyên liệu gạo tấm và trấu, hòa tan 100g Nitơ vào trong

650 mL nước Sau đó, đổ dung dịch vừa pha vào hỗn hợp trên và trộn đều

Hình 3 Phối trộn đều các nguyên liệu.

Bước 3: Đóng gói môi trường vừa trộn bằng cách sử dụng các bịch nilon PP và cho mỗi

bịch 400g hỗn hợp vào, tạo miệng bịch và sử dụng nút bông gòn để đậy kín miệng bịch Sau đó, ghi rõ thông tin (nhóm, ngày, đối tượng thực hiện)

Hình 4 Cân 400g hỗn hợp và đóng gói môi trường.

Bước 4: Hấp khử trùng bịch môi trường ở 121 Co

Hình 5 Hấp khử trùng môi các bịch môi trường meo gạo.

1.3.2 Bổ sung chủng gốc nấm Trichoderma vào bịch môi trường nuôi cấy

Chủng nấm gốc được có trong các các bình Erlen thể tích 1000 mL chứa khoảng

550 – 580 mL dịch lỏng

Bước 1: Đổ 40 ml dịch gốc từ vào bịch môi trường nuôi cấy nấm (hạn chế để dịch chạm

miệng bịch để tránh trường hợp nhiễm)

Hình 6 Bình dung dịch gốc trước và sau khi pha loãng.

Bước 2: Sau khi đổ ta tiến hành trộ đều bịch để dịch gốc phủ đều lên giá thể Để từ đó

nấm phát triển một cách đồng đều

Hình 7 Các bịch môi trường ngay sau khi thêm dịch gốc.

Đem các bịch môi trường đã bổ sung chủng gốc ủ ở nhiệt độ phòng Sau 1 tuần quan sát hiện tượng

1.4 Kết quả

Hình 8 Các bịch môi trường ngay sau khi thêm dịch và khi thêm dịch sau 1 tuần.

Hình 9 Bịch môi trường sau khi ủ 1 tuần.

Quan sát các bịch giống nấm sau khi ủ ở nhiệt độ phòng, thấy bào tử nấm Trichoderma có khả năng tăng sinh, phát triển rất tốt trên môi trường dinh dưỡng gồm gạo tấm, trấu và nito hòa tan Chúng bao phủ một màu xanh đặc trưng của nấm trên bề mặt môi trường

BÀI 2: KIỂM TRA MẬT ĐỘ VI KHUẨN 2.1 Nguyên tắc

nước cất vô trùng Pha loãng xuống nồng độ thích hợp rồi tiến hành cấy trãi dịch pha loãng trên môi trường PDA Đếm khuẩn lạc và tính mật độ vi khuẩn sau 3 ngày

2.2 Vật liệu và thiết bị

- Chế phẩm sinh học Bacillus thuringiensis

- Môi trường nuôi cấy PDA

- Nước cất vô trùng hoặc nước muối sinh lý

- Đèn cồn, tủ cấy và một số dụng cụ tại phòng thí nghiệm

2.3 Các bước tiến hành

Bước 1: Tiến hành khử trùng, lau sạch tủ cấy bằng cồn 70o

Bước 2: Chuẩn bị dịch huyền phù 10 Hút 10 mL dịch chế phẩm sinh học cho vào 900

mL nước muối sinh lý Lắc trong vòng từ 10 – 15 phút

Hình 10 Pha dung dịch huyền phù 10 và tiến hành lắc trong 15 phút.0

Bước 3: Pha loãng tới nồng độ thích hợp Chuẩn bị các ống có chứa 9 mL nước muối

loãng xuống nồng độ 10 Pha loãng tương tự tới nồng độ 10 , 10 , 10 -1 -3 -4 -5

Hình 11 Pha loãng tới các nồng độ thích hợp.

Bước 4: Cấy trãi dịch pha loãng trên môi trường PDA Hút 200 µL dịch pha loãng ở các

cấy trang dịch cho đến khi môi trường thạch khô, không còn vết nước

Hình 12 Hút dịch pha loãng vào đĩa và tiến hành cấy trang.

Bước 5: Tiến hành đếm khuẩn lạc và tính mật độ vi sinh vật sau 3 ngày cấy trang bằng

công thức:

n 1.V f 1+…+¿ V fi

Trong đó:

A: số tế bào trong 1 ml mẫu (CFU/ml)

N: tổng số tế bào đếm trên các đĩa đã chọn

ni: số lượng đĩa cấy ở độ pha loãng thứ i

V: thể tích dịch mẫu cấy vào mỗi đĩa (ml)

fi: độ pha loãng thứ i

-Lưu ý: số khuẩn lạc trên đĩa phải trong khoảng từ 25 – 250 thì mới có ý nghĩa.

2.4 Kết quả

Hình 13 Đĩa thạch ở nồng độ 10 sau 3 ngày ủ (lặp lại 3 lần).-3

Hình 14 Đĩa thạch ở nồng độ 10 sau 3 ngày ủ (lặp lại 3 lần).

Hình 15 Đĩa thạch ở nồng độ 10 sau 3 ngày ủ (lặp lại 3 lần).-5

Qua kết quả 9 đĩa môi trường ở 3 nồng độ khác nhau, ta nhận thấy kết quả rằng không có khuẩn lạc của chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis Đa phần chỉ có sự xuất hiện của nấm nhiễm trong không khí như nấm mốc, trichoderma…Vì thế ta không thể tính toán được mật độ khuẩn lạc

Một số nguyên nhân có thể dẫn đến kết quả như trên là: thao tác kỹ thuật chưa tốt, môi trường nuôi cấy không chính xác, nước muối sinh lý nồng độ cao hơn ghi nhận hoặc

do dịch gốc có vấn đề về hạn sử dụng hay bị tạp nhiễm do được sử dụng bởi nhiều nhóm sinh viên trước