Đặc Điểm kiểu gen và kiểu hình của bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh do thiếu 21 hydroxylase tại bệnh viện nhi trung Ương

ĐẶC ĐIỂM KIỂU GEN VÀ KIỂU HÌNH CỦA BỆNH NHÂN TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN BẨM SINH DO THIẾU 21-HYDROXYLASE TẠI BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

DƯƠNG THỊ HỒNG VÂN

ĐẶC ĐIỂM KIỂU GEN VÀ KIỂU HÌNH CỦA BỆNH NHÂN TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN BẨM SINH DO THIẾU 21-HYDROXYLASE TẠI BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƯƠNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2023

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

DƯƠNG THỊ HỒNG VÂN

ĐẶC ĐIỂM KIỂU GEN VÀ KIỂU HÌNH CỦA BỆNH NHÂN TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN BẨM SINH DO THIẾU 21 -

HYDROXYLASE TẠI BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƯƠNG

CHUYÊN NGÀNH: NHI KHOA MÃ SỐ: 8720106.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS VŨ CHÍ DŨNG

HÀ NỘI - 2023

Để hoàn thành được luận văn này em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới Phó Giáo sư, Tiến sĩ Vũ Chí Dũng cùng các thầy cô và các anh chị đồng nghiệp của Trung tâm Nội tiết, Chuyển hoá, Di tuyền và Liệu pháp phân tử và phòng Hợp tác quốc tế Bệnh viện Nhi Trung ương đã tận tuỵ dạy dỗ, hướng dẫn, tạo điều kiện và động viên em trong thời gian học tập và thực hiện nghiên cứu đầu tiên này

Em xin cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội, các thầy cô Bộ môn Nhi, các cán bộ và nhân viên Phòng quản lý Đào tạo Sau Đại học đã đặc biệt quan tâm và hỗ trợ cho em hoàn thành khoá học

Em xin cảm ơn Ban Giám độc Bệnh viện Nhi Trung ương, cùng các đồng nghiệp từ trung tâm/phòng em đang công tác, và khoa Di truyền Sinh học phân tử đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho em hoàn thành luận văn này

Đặc biệt cảm ơn 209 gia đình bệnh nhi đã hợp tác và tham gia nghiên cứu của tôi, cung cấp cho tôi những thông tin đầy đủ nhất và góp phần lớn nhất cho sự thành công của luận văn

Cuối cùng, em xin được bày tỏ biết ơn sâu sắc tới gia đình gồm bố mẹ, anh chị em, bạn bè vì những hy sinh, những người luôn bên cạnh và động viên tôi trong suốt quá trình làm việc và nghiên cứu

Tôi là DƯƠNG THỊ HỒNG VÂN, học viên cao học khóa 1, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, chuyên ngành Nhi khoa, xin cam đoan:

1 Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của Thầy PGS.BS Vũ Chí Dũng

2 Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được công bố tại Việt Nam

3 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này

Hà Nội, ngày 30 tháng 01 năm 2023

Người viết cam đoan ký và ghi rõ họ tên

1.2.1 Chương trình SLSS trên thế giới 20

1.2.2 Phương pháp sàng lọc sơ sinh 22

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Đối tượng nghiên cứu 24

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn: 24

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ: 24

2.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu: 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 25

2.2.1 Thiết kế và chọn mẫu nghiên cứu 25

2.2.2 Chỉ số nghiên cứu và phương pháp thu thập số liệu 25

2.3 Xử lý số liệu thống kê 30

2.4 Đạo đức nghiên cứu 30

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32

3.2.Kết quả nghiên cứu mục tiêu 1 33

3.2.1 Kiểu hình của trẻ mắc tăng sản thượng thận bẩm sinh 33

3.2.2 Kiểu gen của trẻ TSTTBS 34

3.2.3 Mối tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình 38

3.3.Kết quả nghiên cứu mục tiêu 2 41

Viết tắt Tiếng Anh/Tiếng Việt

17-OHP 17-hydroxyprogesterone 21-OH 21-hydroxylase

ACTH Adrenocorticotropic Hormone/Hormon hướng thượng thận

CAH/TSTTBS Congenital adrenal hyperplasia/Tăng sản thượng thận bẩm sinh

cDNA Complementary DNA/DNA bổ sung

CRH Corticotropin-releasing hormone/Hormon giải phóng corticotropin

DNA Deoxyribonucleic acid

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

SW/MM Salt wasting/Mất muối

WHO World Health Organization/Tổ chức y tế thế giới

Bảng 1.1: Khuyến cáo điều trị duy trì cho bệnh nhân nhi mắc TSTTBS thể thiếu

21-OH kiểu hình mất muối [2] 17

Bảng 3.1: Đặc điểm chung của nhóm nghiên cứu 32

Bảng 3.2: Triệu chứng lâm sàng 33

Bảng 3.3: Các xét nghiệm tại thời điểm chẩn đoán 34

Bảng 3.4: Các đột biến gen CYP21A2 của trẻ mắc TSTTBS 35

Bảng 3.5: Kiểu gen và kiểu hình của 98 bệnh nhân thiếu 21-OH 36

Bảng 3.6: Tỷ lệ dự báo kiểu hình dựa vào kiểu gen 38

Bảng 3.7: Kiểu gen và kiểu hình của các bệnh nhân có kiểu gen thuộc nhóm D và những kiểu gen có một dị hợp tử 39

Bảng 3.8: Kiểu gen không phù hợp với kiểu hình 40

Bảng 3.9: Kết quả SLSS ở nhóm nghiên cứu trẻ mắc TSTTBS 42

Bảng 3.10: Đặc điểm nhân khẩu của nhóm trẻ có kết quả xét nghiệm SLSS nguy cơ cao 43

Bảng 3.11: So sánh đặc điểm chung của 2 nhóm nghiên cứu 43

Bảng 3.12: Các xét nghiệm tại thời điểm chẩn đoán của trẻ TSTTBS thể

MM 44

Bảng 3.13: Phân bố tình trạng suy thượng thận theo giới, so sánh theo nhóm SLSS và không được SLSS 45

Bảng 3.14: Mức độ mất muối cấp ở những trẻ suy thượng thận cấp 45

Biểu đồ 3.1: Phân bố các dạng đột biến 36

Hình 1.1: Sơ đồ tổng hợp các hormon của tuyến vỏ thượng thận 4

Hình 1.2: Sơ đồ chuyển hoá hormon khi thiếu enzym 21-OH 6

Hình 1.3: Sơ đồ quy luật di truyền gen lặn nằm trên NST thường 6

vực HLA loại III [8] 8Hình 1.5: Đột biến ở gen CYP21A2 gây ra sự thiếu hụt 21-OH [13] 9Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu 25Hình 3.1: Mức độ nam hóa bộ phận sinh dục ngoài (theo Prader) của trẻ nữ theo kiểu hình 34

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) là một nhóm các bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường, đặc trưng bởi sự thiếu hụt một trong số các enzyme cần thiết cho quá trình tổng hợp các hormon tuyến vỏ thượng thận, như cortisol và aldosterol TSTTBS gồm nhiều thể khác nhau, trong đó thiếu hụt enzym 21-hydroxylase (21-OH) là thể hay gặp nhất, chiếm hơn 95% các trường hợp TSTTBS [1]

Tần suất mắc bệnh chung trên thế giới là từ 1/14.000 – 1/18.000 trẻ sơ sinh sống Ngày nay, nhờ vào chương trình sàng lọc sơ sinh (SLSS) nên bệnh TSTTBS ngày càng được phát hiện sớm hơn, từ đó làm giảm tần suất các cơn suy thượng thận cấp và giảm tỉ lệ tử vong do trẻ được điều trị sớm vì tránh được tình trạng mất muối nặng, còn ở trẻ gái được điều trị và xác định được nguyên nhân mơ hồ giới tính sớm [2]

Tại Việt Nam, chương trình sàng lọc bệnh TSTTBS ở trẻ sơ sinh lần đầu tiên được triển khai tại Bệnh viện Từ Dũ, thành phố Hồ Chí Minh vào năm 2005 bằng phương pháp định lượng nồng độ 17-OHP trong giọt máu thấm khô Tại Bệnh viện Nhi Trung ương chương trình sàng lọc bệnh TSTTBS được thực hiện vào năm 2019 cho thấy sàng lọc 27024 trẻ sơ sinh thì phát hiện được ba trẻ mắc bệnh, như vậy sơ bộ tỷ lệ mới mắc là 1:9008 trẻ đẻ sống [3]

Chương trình sàng lọc TSTTBS đầy đủ bao gồm nhiều bước Để trẻ được chẩn đoán xác định bệnh TSTTBS sớm cần có sự liên kết chặt chẽ giữa gia đình với các cơ sở y tế thực hiện SLSS và cơ sở y tế có đủ năng lực xét nghiệm khẳng định chẩn đoán Tuy nhiên quy trình liên kết này vẫn đang là một vấn đề tồn tại trong chương trình sàng lọc TSTTBS hiện nay Điều này dẫn đến hậu quả là hầu hết trẻ nhập viện đã có các biểu hiện của suy thượng thận nặng, mất nước, mất muối nặng và nguy cơ tử vong cao [3] Tại Việt Nam chưa có nghiên cứu nào đánh giá lâm sàng và hoá sinh của các bệnh nhân nhập viện mà được phát hiện bệnh TSTTBS qua SLSS cũng như vai trò xét nghiệm phân tử trong

dự báo kiểu hình ở những trẻ đó Vì vậy, việc hoàn thiện chương trình SLSS mang tính cấp thiết, để có cái nhìn tổng thể về các biểu hiện lâm sàng, những bất thường hoá sinh và biến đổi gen ở trẻ TSTTBS cho các bác sĩ và giúp ích

vào quá trình điều trị sớm cho bệnh nhân, chúng tôi thực hiện đề tài: “Đặc điểm kiểu gen và kiểu hình của bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh do thiếu 21-hydroxylase tại Bệnh viện Nhi Trung ương” với các mục tiêu sau:

1 Mô tả đột biến gen CYP21A2, kiểu gen và liên quan kiểu gen và kiểu

hình của bệnh nhân TSTTBS thiếu 21-hydroxylase

2 Nhận xét mức độ nặng kiểu hình của các bệnh nhân thiếu 21-hydroxylase phát hiện qua SLSS và không qua SLSS

TSTTBS bao gồm 7 bệnh di truyền lặn NST thường do đột biến gen sản xuất các enzym tham gia vào quá trình tổng hợp cortisol bao gồm 21-hydroxylase (21-OH), 11B-hydroxylase (11BOH), 17a-hydroxylase (17OH; 17, 20-lyase), 3ß-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 (3BHSD2), protein điều hòa tổng hợp steroid (StAR), enzym nhánh bên P450 cholesterol (SCC), và enzym P450 oxidoreductase (POR) [5]

Sự kích thích sản xuất cortisol do điều hòa ACTH của tuyến yên và tăng cường sản xuất theo nhánh tắt không bị thiếu enzym dẫn tới tăng bất thường các hormon khác dẫn tới các biểu hiện đa dạng trên lâm sàng Sự thiếu hụt cortisol sẽ dẫn tới cơn suy thượng thận cấp khi cơ thể bị stress, sốt trong khi thiếu hụt aldosteron dẫn tới triệu chứng mất muối nước Sự tăng sản xuất các androgen là nguyên nhân phát triển bộ phận sinh dục ngoài giống nam ở nữ và dậy thì sớm ở nam giới mắc bệnh

Quá trình tạo steroid ở vỏ thượng thận diễn ra ở 3 lớp: zona glomerulosa ngoài cùng (sinh tổng hợp mineralocorticoid), zona fasciculata (sinh tổng hợp glucocorticoid) và zona lưới trong cùng (sinh tổng hợp tiền chất steroid giới tính) Bắt đầu chuyển hoá từ cholesterol thành các hormone steroid hoạt tính, các đồng yếu tố và các protein hỗ trợ Từng quá trình chuyển hoá sẽ xảy ra ở lớp vỏ thượng thận tương ứng với từng vùng của vỏ thượng thận Các đột biến

đã được mô tả trong hầu hết các gen mã hóa các protein tham gia chuyển hoá (Hình 1.1) [1] [6]

TSTTBS thiếu hụt enzym 21-hydroxylase (21-OH) là thể TSTTBS phổ biến nhất chiếm khoẳng 90-99% 21-OH là enzym P450 (CYP21, P450 21) để chuyển hoá progesteron và 17-hydroxyprogesteron (17-OHP) ra 11-desoxycorticosteron (DOC) và 11-deoxycortisol là các tiền chất để tổng hợp ra aldosteron và cortisol Khi hai hormon này đều bị thiếu hụt sẽ hình thành thể mất muối nặng trên lâm sàng [3]

Hình 1.1: Sơ đồ tổng hợp các hormon của tuyến vỏ thượng thận [3]

Cơ chế rối loạn tổng hợp các hormon vỏ thượng thận khi thiếu enzym 21-OH làm giảm hormon cortisol, aldosteron và tăng testosteron Các protein phụ cần thiết cho hoạt động của enzym cytochrome P450 được hiển thị bên cạnh mỗi enzym như sau: POR, P450 oxyoreductase, yêu cầu có enzyme CYP trong mạng lưới nội chất; FDXR/FDX1, ferredoxin reductase và ferredoxin,

yêu cầu có các enzym CYP của ty thể Cytochrome B5 (CYP5A) yêu cầu có hoạt động đầy đủ enzyme 17, 20-lyase của CYP17A1

Các bước bị ảnh hưởng bởi thiếu 21-OH, bao gồm cả steroid được tăng tiết trong trường hợp này, được biểu thị bằng các đường màu đỏ và chữ màu

đỏ Những khung hình màu khác có những ý nghĩa sau: màu xám - các bước

đầu tiên của quá trình tổng hợp steroid chung cho tất cả các vùng của vỏ thượng thận; màu da cam - các bước trong zona glomerulosa dẫn đến sản xuất aldosteron; màu xanh lam - các bước trong zona fasciculata dẫn đến sản xuất cortisol; màu đỏ - các bước trong zona reticularis và các mô ngoài thượng thận dẫn đến tổng hợp nội tiết tố nam; màu tím - “cửa sau” hoặc con đường thay thế từ 17-OHP đến dihydrotestosterone (để rõ ràng, con đường chuyển hoá từ progesterone không được hiển thị); màu xanh lá cây - chuyển hoá dẫn đến 11-oxoandrogen [1]

Tóm lại, khi không có hoạt tính 21-OH của P450C21, sẽ có ba con đường dẫn đến bài tiết androgen: 1) Con đường từ cholesterol đến DHEA vẫn còn nguyên vẹn Mặc dù nhiều DHEA bị bất hoạt thành DHEA sulfate, nhưng việc tăng sản xuất DHEA sẽ dẫn đến một số DHEA được chuyển đổi thành testosterone và dihydrotestosterone (DHT) 2) Mặc dù lượng tối thiểu 17-OHP được chuyển đổi thành androstenedione trong tuyến thượng thận bình thường, số lượng lớn 17-OHP được tạo ra trong TSTTBS cho phép một số 17-OHP được chuyển đổi thành androstenedione và sau đó là testosterone 3) Con đường chuyển hoá phụ phụ thuộc vào sự giảm 5 và 3 của 17-OHP thành 17OH-allopregnanolone Steroid này dễ dàng được chuyển hoá thành androstanediol, sau đó có thể bị oxy hóa thành DHT bằng 3 -HSD enzym [7]

Hình 1.2 Sơ đồ chuyển hoá hormon khi thiếu enzym 21-OH [7] 1.1.2 Di truyền

TSTTBS là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường Bệnh chỉ xảy ra ở người mang đồng hợp tử hoặc dị hợp tử kép gen lặn (minh họa là: rr) Nếu một người mang 1 gen bình thường (minh họa là: R) và 1 gen đột biến (r) gọi là dị hợp tử Trong mỗi cá thể đều được di truyền 1 allele từ bố và 1 allele từ mẹ, do vậy ở cá thể mang gen gây bệnh dạng đồng hợp tử (rr) thì bố mẹ là hai dị hợp tử (Rr) bắt buộc Trường hợp đột biến mới xảy ra rất hiếm gặp

Hình 1.3 Sơ đồ quy luật di truyền gen lặn nằm trên NST thường [3]

Đặc điểm của bệnh di truyền theo quy luật lặn là bệnh xảy ra không liên tục qua các thế hệ Thường gặp xuất hiện bệnh trong cùng một thế hệ Tỷ lệ nam và nữ bị bệnh là như nhau [3]

Theo quy luật Mendel có thể theo dõi được khả năng mắc bệnh như sau: − Nếu cha mẹ là hai dị hợp tử (Rr x Rr) thì khả năng con bị bệnh (rr)

là 25%, con dị hợp tử (Rr) mang gen lặn là 50%, con bình thường hoàn toàn (RR) là 25% Trong quần thể trường hợp này hay gặp nhất − Nếu cha (hoặc mẹ) là người bình thường (RR) kết hôn với người mang gen dị hợp tử (Rr) thì khả năng sinh ra con bình thường (RR) là 50%, con bị dị hợp tử (Rr) là 50%

− Nếu cha (hoặc mẹ) là người bình thường kết hôn với người bị bệnh (rr) thì khả năng sinh con mang gen dị hợp tử (Rr) là 100%

1.1.3 Đột biến CYP21A2

Gen mã hoá để tổng hợp 21-OH – CYP21A2, là một gen phức tạp nằm

gần vùng HLA (human leucocyte antigen – kháng thể nguyên bạch cầu người)

trên nhiễm sắc thể số 6, song song với gen giả, CYP21A1P, có độ tương đồng 98% với gen hoạt động, nhưng không hoạt động do một số đột biến CYP21A2 và CYP21A1P cùng một số gen khác nằm ở cùng Class III tạo thành cấu trúc

dạng hai phân tử (bimodular) RCCX-RCCX Các thay đổi cấu trúc của gen

CYP21A2 do sự rối loạn của nhân đôi, mất đoạn và sắp xếp lại gen trong nhiễm

sắc thể 6p21.3 gây nên không tổng hợp được enzym OH, hoặc enzym OH được tổng hợp không có hoạt tính dẫn đến bệnh lý trên lâm sàng

21-Hình 1.4 Sơ đồ của mô-đun RCCX nằm trên nhánh ngắn của NST 6 trong khu vực HLA loại III [8]

Sao chép song song ảnh hưởng đến gen CYP21 và C4 Ở người, chỉ có CYP21A2 tạo ra protein chức năng, trong khi đó, CYP21A1P là một gen giả

tương đồng bao gồm một số đột biến điểm bất hoạt có thể được một gen nhỏ

chuyển sang gen hoạt động Cả C4A và C4B đều hoạt động Tenascin, cũng

được sao chép, được mã hóa trong chuỗi bổ sung Phần dưới cùng của hình ảnh hiển thị các đột biến lặp lại được nhóm theo cách chúng ảnh hưởng đến chức năng của enzimatic: nghiêm trọng (đỏ), nghiêm trọng vừa phải (xanh lá cây) hoặc nhẹ (xanh dương) Các đột biến tái phát trong tất cả các quần thể được khoanh tròn Các mũi tên “Fragment A”, “FragmentB” và “FragmentC” đại

diện cho các bộ khuếch đại cụ thể cho khuếch đại CYP21A2

Do đó, kiểu gen của CYP21A2 yêu cầu các phân tích cẩn thận để đảm

bảo PCR đặc hiệu cho gen với khả năng tránh bỏ sót alelle và định nghĩa chính xác về thể khảm gen, giả gen và sao chép gen [6], [8]

Các đột biến ở gen CYP21A2 gây bệnh TSTTBS chia thành 3 nhóm: nhóm do hiện tượng hoán vị nhỏ của giả gen CY21A1P sang gen chức năng

CYP21A2; nhóm do các đột biến tự phát sinh tại gen chức năng CYP21A2 và

nhóm do đơn vị RCCX ở dạng kết hợp (chimeric RCCX module) bao gồm:

dạng kết hợp của CYP21A1P/CYP21A2 và các gen TNXA/TNXB

Ngày nay người ta đã xác định được hơn 200 đột biến khác nhau, tuy nhiên chỉ có một số đột biến cho hơn 90% các allele được mô tả [9] Bốn nhóm kiểu gen dựa trên mức độ nặng của allele nhẹ hơn ở bệnh nhân dị hợp tử: null, splice I2, p.I172N và p.V281L Các nhóm null và splice I2 liên quan đến kiểu hình mất muối (SW – salt wasting), p.I172N với nam hoá đơn thuần (SV – simple virilization) và p.V281L với CAH không điển hình (NC – non-classical) p.P30L dẫn đến một kiểu hình giữa SV và NC, nhưng trong nghiên cứu đó được định nghĩa là không cổ điển [10], [11], [12]

Hình 1.5 Đột biến ở gen CYP21A2 gây ra sự thiếu hụt 21-OH [13]

Có nhiều nghiên cứu mô tả mối tương quan chặt chẽ giữa kiểu gen - kiểu hình của TSTTBS thiếu 21-OH, và kiểu hình cũng liên quan chặt chẽ với hoạt độ enzym đó Các đột biến gây thiếu 21-OH là tiêu chuẩn chính để dự báo mức độ nặng của bệnh

Theo nghiên cứu của Vũ Chí Dũng (2017) trên bệnh nhân Việt Nam,

phát hiện được 99% (202/204) bệnh nhân có đột biến gen CYP21A2 Trong

nhóm các đột biến phổ biến bao gồm: các đột biến xóa đoạn lớn của gen (34,5%); và các đột biến điểm khác nhau trong đó 13 đột biến phổ biến có nguồn gốc từ giả gen (tổng cộng là 58,9%) với tỷ lệ gặp cao nhất bao gồm: I2g (28,6%); p.R356W (12,3%); p.I172N (10,6%) Ngoài ra tác giả phát hiện được

6 đột biến mới (2%) chưa từng được báo cáo ở gen CYP21A2 [14]

Mức độ nặng của bệnh có mối tương quan với đột biến allele gen

CYP21A2 TSTTBS thiếu 21-OH thể cổ điển thường do 2 allele đột biến nặng

và thể không cổ điển là thường do hai allele đột biến nhẹ hoặc kết hợp một allele đột biến nặng và một allele đột biến nhẹ [12], [15] Tuy nhiên, trong nghiên cứu lớn nhất ở châu Âu được báo cáo cho đến nay thực hiện tại Áo và

Đức, Stefan Riedl và cộng sự cho thấy việc dự đoán kiểu hình CYP21A2 được

kết luận hợp lý ở những kiểu gen nặng, nhưng không đáng tin cậy ở những kiểu gen yếu hơn [16]

1.1.4 Chấn đoán

1.1.4.1 Biểu hiện lâm sàng của TSTTBS thiếu 21-OH

Tuỳ vào mức độ thiếu hụt hoạt độ enzym, bệnh nhân sẽ biểu hiện mức độ nặng như ngay từ thời kỳ bào thai là nam hóa ở thai nhi gái và dẫn đến hậu quả mơ hồ giới tính sau sinh; mức độ mất muối, mất nước nặng và dẫn đến tử vong, thường ở thời điểm tuần thứ hai và thứ ba sau sinh Đặc biệt đối với trẻ gái, nếu không được chẩn đoán sớm và điều trị kịp thời sẽ có các hậu quả nghiêm trọng, như nam hóa tiến triển, biểu hiện các dấu hiệu cường androgen, không dậy thì, thiểu kinh, vô kinh và vô sinh Đối với trẻ trai, các biểu hiện dậy thì sớm thường xuất hiện sau 2 tuổi, lúc đầu là dậy thì sớm ngoại vi, sau có thể tiến triển thành dậy thì sớm trung ương và hậu quả vô sinh

Do giảm hormon cortisol, aldosteron và tăng hormon testosteron nên triệu chứng lâm sàng đặc trưng của bệnh gồm hai nhóm triệu chứng:

- Suy thượng thận cấp: mất nước, rối loạn điện giải, trong trường hợp nặng dẫn đến sốc, tử vong

- Bất thường bộ phận sinh dục: dậy thì sớm giả ở trẻ nam như mọc lông mu, rậm lông, mọc trứng cá, sớm trước tuổi, dương vật to và dài hơn so với tuổi, nhưng thể tích tinh hoàn vẫn tương đương so với tuổi Nam hoá ở trẻ nữ: âm vật phì đại theo 5 type của Prader (Phụ lục 2), sạm da, ngoại hình nam, nói giọng ồm, thiểu năng sinh dục nữ Ở trẻ nam và trẻ nữ đều tăng phát triển cơ thể: lớn nhanh, cốt hoá sớm các đầu xương dài nên về sau trẻ bị lùn [3]

Trên lâm sàng bệnh TSTTBS được phân chia ra những kiểu hình như sau: - Thể cổ điển: bao gồm thể mất muối (MM) (salt wasting - SW) và thể

nam hóa đơn thuần (NHĐT) (simple virilizing - SV)

- Thể không cổ điển (KCĐ) (non classic) – thể khởỉ phát muộn

Thể cổ điển mất muối chiếm 75% các ca mắc thể cổ điển Enzym 21-OH trong thể mất muối không có hoặc có ít, nên nồng độ cortisol và aldosteron thấp dù nồng độ ACTH và hoạt tính Renin luôn tăng cao Dưới tác dụng của ACTH, tổng hợp các tiền chất trước chỗ tắc tăng dẫn đến tăng tổng hợp androgen Thiếu hụt hoàn toàn hoạt độ enzym gây nguy hiểm đến tính mạng và tử vong do mất nước, hạ Natri máu (thể mất muối) và các trẻ gái mắc thể nặng thiếu 21-OH có biểu hiện nam hóa bộ phận sinh dục ngoài từ thời kỳ bào thai và được phát hiện sau sinh, đây là hậu quả của mức androgen cao từ trong thai kỳ Các triệu chứng đặc trưng bao gồm: âm vật phì đại, hai môi lớn dính liền với nhau và có nếp nhăn, niệu đạo và âm đạo riêng rẽ nhưng đổ vào xoang niệu dục chung, cơ quan sinh dục bên trong của nữ bình thường bao gồm tử cung, vòi trứng, buồng trứng; không có cấu trúc của ống Wolff Trẻ trai mắc thể cổ điển không có triệu chứng khi sinh ngoại trừ sạm da kín đáo và dương vật có thể có kích thước lớn hơn Do vậy, tuổi chẩn đoán ở trẻ trai thể cổ điển mất muối khác nhau tùy theo mức độ nặng của thiếu hụt aldosteron Các trẻ trai mắc thể cổ điển mất muối thường

xuất hiện triệu chứng từ 7-14 ngày sau sinh với các biểu hiện nôn, sụt cân, li bì, mất nước, hạ Natri, tăng Kali huyết thanh và có thể có sốc Các trẻ gái mắc thể cổ điển mất muối nếu không được điều trị sớm sau sinh có thể xuất hiện các triệu chứng suy thượng thận cấp, mất muối trong giai đoạn sơ sinh Tuy nhiên, mơ hồ giới tính phát hiện khi sinh là lý do giúp chẩn đoán và điều trị sớm hơn [3], [12]

Ở thể nam hoá đơn thuần, enzym 21-OH thiếu không hoàn toàn nên sự tăng ACTH đủ làm cho nồng độ cortisol trở về bình thường Nhưng do ACTH tăng tối đa và không có dự trữ cortisol ở vỏ thượng thận nên trong trường hợp có stress bệnh nhân không có khả năng bài tiết cortisol để chống lại Tuy nhiên, vỏ thượng thận vẫn đáp ứng được với hoạt tính renin tăng bằng tăng bài tiết aldosteron, nhờ vậy bệnh nhân không có rối loạn cân bằng nước điện giải mà chỉ có biểu hiện nam hóa đơn thuần Biểu hiện lâm sàng là hội chứng nam hoá do tác dụng của hormon sinh dục nam lên biệt hoá bộ phận sinh dục ngoài theo hướng nam trong thời kỳ bào thai và phát triển các đặc tính sinh dục phụ nam trong thời kỳ dậy thì Các trẻ trai mắc thể cổ điển nam hóa đơn thuần lúc mới sinh thường không có biểu hiện gì đặc biệt, dấu hiệu dậy thì sớm bắt đầu ở khoảng từ 2 đến 4 tuổi Như vậy, các thể nhẹ hơn biểu hiện với mức độ khác nhau của tăng hormon sinh dục nam sau năm đầu sau sinh [9] Tăng androgen ngay từ khi đứa trẻ còn nằm trong tử cung làm thay đổi bộ phận sinh dục ngoài (giả lưỡng tính) nhiều hay ít ngay từ khi đẻ: âm vật phì đại với nhiều mức độ khác nhau, có khi to như dương vật, hai môi lớn dính nhau, nhăn trông giống bìu, đôi khi lỗ niệu đạo ngay ở dưới âm vật, khi đó dễ chẩn đoán nhầm với tật lỗ đái thấp Nhưng trong mọi trường hợp, tử cung vẫn bình thường, không có tinh hoàn và nhiễm sắc thể giới tính vẫn là XX Sau khi sinh, nếu không được điều trị, biểu hiện nam hóa ngày càng rõ Tăng tiết androgen làm trẻ lớn nhanh và tuổi xương trưởng thành sớm so với tuổi thực, sự cốt hóa đầu xương sớm sẽ làm trẻ ngừng lớn và đạt chiều cao cuối cùng thấp (140-150 cm) khi trưởng

thành Trẻ thường có kiểu hình nam: vai rộng, hông hẹp, cơ bắp phát triển, rậm lông, mọc râu kiểu đàn ông, tuyến vú phát triển kém, rối loạn kinh nguyệt có thể gây vô sinh sau này [9].

Sự bài tiết aldosterone cần thiết cho cân bằng nội môi điện giải bình thường thấp hơn 100 lần so với tốc độ sản xuất cortisol, điều đó nghĩa là những bệnh nhân thuộc thể TSTTBS không điển hình thường không biểu hiện các cơn mất muối, trái ngược với thể cổ điển

Đối với thể không cổ điển, thể khởi phát muộn, thường được chẩn đoán muộn ở thời thơ ấu, thiếu niên, hoặc thậm trí tuổi trưởng thành Những biểu hiện tuỳ thuộc vào tuổi và giới và là hậu quả của cường androgen Ví dụ, ở những trẻ dưới 10 tuổi là dậy thì sớm ở trẻ nam, nổi mụn trứng cá nặng, rậm lông, rụng tóc, giọng ồm, mọc lông mu sớm, dương vật to; ở trẻ gái có biểu hiện âm vật phì đại, rối loạn kinh nguyệt hoặc vô kinh nguyên phát sẽ gặp ở trẻ gái Ở thanh thiếu niên và người lớn, các triệu chứng biểu hiện điển hình là mụn trứng cá, rậm lông, thiểu kinh hoặc vô sinh Các triệu chứng kín đáo ở bệnh nhân nam thậm chí không có triệu chứng hoặc chỉ có nhiều trứng cá và/hoặc khó khăn về sinh sản [9], [17]

1.1.4.2 Xét nghiệm cận lâm sàng:

- Với trẻ mất muối các xét nghiệm cận lâm sàng rất điển hình với thiếu hụt cortisol và aldosteron bao gồm: hạ natri máu, tăng Kali máu (Na+ huyết thanh < 130 mmol/l hoặc 130-135 mmol/l kết hợp với K+ > 5,5 mmol/l), toan chuyển hoá, hạ đường huyết, thường xuất hiện vào tuần 1-2, nhưng có khi muộn hơn, hoặc sớm hơn vào ngày thứ 5 sau sinh

- Nồng độ 17-OHP thường tăng cao sau sinh 2-3 ngày đầu Cao vào buổi sáng và giảm vào ban đêm

- Nồng độ Cortisol thường thấp với thể mất muối - Nồng độ Renin trong máu tăng cao

- Nồng độ Aldosteron máu thấp

- Nồng độ Progesteron >1,1nmol/l - Nồng độ Testosteron máu >1nmol/l

- Ngày nay định lượng nồng độ 17-OHP được xem là tiêu chuẩn vàng để xác định chẩn đoán TSTTBS

- Trẻ trai: dậy thì sớm giả, tăng sớm chiều cao và tuổi xương

- Cả hai giới: có biểu hiện mất muối những 4 tuần đầu sau sinh: mất nước, hạ Natri và Clo, tăng Kali huyết thanh, giảm Carbon dioxide (CO2), tăng Natri niệu

- Tăng 17-OHP huyết thanh vào lúc sáng sớm (< 8h sáng) o Trẻ sơ sinh ≥ 3nmol/ml (bình thường < 3 nmol/ml) o Sau tuổi sơ sinh: ≥ 6nmol/ml [11]

Tiêu chuẩn để phân loại kiểu hình dựa trên các triệu chứng lâm sàng và xét nghiệm sinh hoá:

- Bộ phận sinh dục nữ được đánh giá theo mức độ của Prader (bao gồm cả ở thể MM hoặc NHĐT);

- Thể cổ điển MM (hoạt độ 21-OH còn <2%) các biểu hiện nổi bật là sụt cân hoặc chậm tăng cân sau đẻ, nôn, dấu hiệu mất nước thậm chí sốc giảm thể tích; Na+ huyết thanh < 130 mmol/l hoặc 130-135 mmol/l kết hợp với K+> 5,5 mmol/l, hoặc bất kỳ khi nào xét nghiệm thấy hoạt độ Renin huyết thanh tăng bất thường [19]

SLSS được coi là phương pháp hữu ích để chẩn đoán sớm thể cổ điển của TSTTBS Nhưng việc nhận định kết quả dương tính dựa vào định lượng 17-OHP đơn thuần ở trẻ sơ sinh chưa có triệu chứng có thể gặp nhiều khó khăn

Hơn nữa, trẻ sơ sinh đẻ non khỏe mạnh cũng có nồng độ các hormon cao hơn bình thường, và có khoảng 1-1,2% có dương tính giả Để cải thiện giá trị dự báo dương tính của xét nghiệm sàng lọc, hiện nay phương pháp sàng lọc bước thai là sử dụng sắc ký lỏng phổ khối kép (tandem mass spectrometry - TMS) và phân tích phân tử đã được đề xuất ở những trường hợp có kết quả sàng lọc sơ sinh dương tính [20]

Các cơ sở cho bác sĩ lâm sàng chỉ định thực hiện phân tích gen CYP21A2

[21]:

● Cho cả hai giới:

− Nồng độ 17-OHP tăng cao được phát hiện bằng sàng lọc TSTTBS − Mất muối và rối loạn tăng trưởng

− Dậy thì sớm

− Tăng trưởng ở thời thơ ấu, giảm chiều cao khi trưởng thành

− Tăng nồng độ androgen (testosterone), 17-OHP và 21- deoxycortisol (nền và sau thử nghiệm kích thích ACTH)

− Bệnh nhân chuyển đổi giới tính hoặc chuyển đổi giới tính trước khi phẫu thuật chuyển đổi giới tính

− Ở các cặp vợ chồng trước khi làm thụ tinh nhân tạo và sử dụng các phương pháp khác hỗ trợ sinh sản

− Chẩn đoán trước sinh ở thai phụ có nguy cơ − Tăng sản tuyến thượng thận (có u)

● Dành cho nam

− Tăng kích thước tinh hoàn phản ánh sự phát triển của tuyến thượng thận trong mô tinh hoàn (TARTs-u tuyến thượng thận tinh hoàn)

1.1.4.4 Chẩn đoán phân biệt

TSTTBS cần được chẩn đoán phân biệt với mơ hồ giới tính bệnh di truyền lưỡng giới Sự hình thành giới tính cần được đánh giá toàn thể, như tình trạng giải phẫu tuyến sinh dục qua siêu âm (tổ chức tử cung, buồng trứng, tinh hoàn, niệu đạo, âm đạo), bộ phận sinh dục ngoài, xác định NST X và Y, test hormon sinh dục, và đặc biệt các khối u tuyến thượng thận và sinh dục gây nam hoá và dậy thì sớm

1.1.5 Điều trị

Các mục tiêu điều trị TSTTBS thiếu 21-OH là ngăn ngừa cơn suy thượng thận cấp, tối ưu hóa sự tăng trưởng (đảm bảo được chiều cao trung bình cuối cùng bình thường), phát triển giới tính (tránh nam hoá ở trẻ gái và dậy thì sớm ở trẻ trai) và hỗ trợ chức năng sinh sản Điều này được thực hiện bằng cách sử dụng hormon thay thế glucocorticoid (GC) và mineralocorticoid (MC) với liều lượng đủ để cần bằng hormone giải phóng corticotropin (CRH) và hormone hướng vỏ thượng thận (ACTH)

Liều hydrocortisone ban đầu cho trẻ mới được chẩn đoán thể mất muối phải được điều chỉnh tùy thuộc vào tình trạng lâm sàng Nếu trẻ tăng Kali và giảm Natri, điều trị nên bắt đầu ngay lập tức Điều quan trọng là không nên điều trị quá mức để tránh tình trạng suy thượng thận xảy ra trong thời kỳ sơ sinh [10]

Ở trẻ em, GC được lựa chọn là hydrocortisone, vì thời gian bán hủy ngắn nên giảm thiểu được các tác dụng phụ bất lợi điển hình của các GC tác dụng lâu hơn, mạnh hơn, đặc biệt là ức chế tăng trưởng Thử nghiệm lâm sàng cho thấy tác dụng ức chế tăng trưởng ước tính của prednisolone mạnh hơn ∼15 lần so với hydrocortisole, còn dexamethasone có thể mạnh hơn đến 70-80 lần [22], [23]

Bảng 1.1: Khuyến cáo điều trị duy trì cho bệnh nhân nhi mắc TSTTBS thể

thiếu 21-OH kiểu hình mất muối [2]

Thuốc Tổng liều trong ngày Lần chia liều trong ngày

GCs: hydrocortisone viên 10–15 mg/m2 3 lần/ngày MCs: fludrocortisone viên 0.05–0.2 mg 1-2 lần/ngày Bổ sung muối NaCl 1–2 g (17–34 mEq/d)

− Sốc – truyền tĩnh mạch một liều dung dịch muối đẳn trương (0,9%), 20 mL/kg trong 1 giờ Nếu vẫn còn sốc, lặp lại đến tổng cộng 60 ml/kg trong vòng 2 giờ

− Hạ đường huyết – truyền tĩnh mạch liều khởi đầu 0,5-1g/kg dextrose (liều duy nhất tối đa 25g) Liều lượng glucose được truyền chậm, với tốc độ 2 đến 3 ml mỗi phút

o Đối với tất cả các nhóm tuổi, dung dịch này có thể được cung cấp dưới dạng dung dịch dextrose 25% (D25W), 2-4 ml/kg (D25W là 250 mg dextrose/ml)

o Một giải pháp thay thế cho trẻ sơ sinh và trẻ em dưới 12 tuổi là sử dụng dung dịch dextrose 10% (D10W), 5-10 ml/kg (D10W là 100 mg dextrose/ml)

− Glucocorticoid giảm stress - Sử dụng hydrocortisone (Solu-Cortef) dưới dạng liều bolus, sử dụng liều lượng từ 50 - 100 mg/m2 tiêm tĩnh mạch

o Trẻ sơ sinh và trẻ mới biết đi 0 đến 3 tuổi - 25 mg tiêm tĩnh mạch o Trẻ em từ 3 đến 12 tuổi - 50 mg tiêm tĩnh mạch

o Trẻ em và thanh thiếu niên từ 12 tuổi trở lên - 100 mg tiêm tĩnh mạch

− Tiếp tục GC với cùng một liều được cho theo tỷ lệ không đổi hoặc chia làm 4 lần trong 24 giờ sau đó Liều lượng và thời gian tiếp theo phụ thuộc vào tình trạng lâm sàng của bệnh nhân

− Điện giải đồ - Nếu có tăng Kali máu, thực hiện điện tâm đồ để đánh giá: o Điện tâm đồ thay đổi phù hợp với tăng Kali máu - Ban đầu là sóng T cao, đỉnh với khoảng QT rút ngắn, sau đó là kéo dài dần khoảng PR và thời gian QRS

o Tăng kali máu thường cải thiện sau khi truyền dịch và điều trị bằng hydrocortisole Hiếm khi, Kali máu tăng nghiêm trọng và có triệu chứng cần điều trị khẩn cấp (như tiêm Canxi qua đường tĩnh mạch sau đó truyền insulin và truyền glucose qua đường tĩnh mạch…) − Theo dõi và điều trị các bất thường điện giải khác và cân bằng dịch [24]

Phẫu thuật tạo hình bộ phận sinh dục ngoài cho trẻ gái với mục đích chuyển bộ phận sinh dục về đúng giới tính cho trẻ

Trước đây phẫu thuật tạo hình được tiến hành lúc trẻ 2-3 tuổi, ngày nay có xu hướng phẫu thuật sớm hơn trong năm đầu (4 đến 12 tháng) và tốt nhất không muộn hơn 18 tháng tuổi để giảm gánh nặng tâm lý cho gia đình và bệnh nhân

Sau phẫu thuật trẻ gái có thể phát triển bình thường như những trẻ khác cùng lứa tuổi nếu tuân thủ duy trì điều trị nội khoa

1.1.6 Theo dõi

Các xét nghiệm cần được theo dõi (17-OHP huyết thanh, Androstenedione, hoạt tính Renin huyết tương và điện giải) nên được thực hiện không quá 10 - 14 ngày sau khi bắt đầu điều trị Kết quả nên được sử dụng để hướng dẫn điều chỉnh liều GC và MC Cần dùng đủ liều GC và lưu ý rằng khi dùng quá liều có thể làm giảm sự phát triển Cần dùng đủ liều MC để duy trì nội môi và điện giải bình thường, nhưng dùng quá liều có thể gây tăng huyết áp hoặc hạ Kali máu và có thể góp phần làm suy giảm khả năng tăng trưởng Cụ thể theo khuyến cáo thực hành lâm sàng của Hội Nội tiết cập nhật năm 2018 [2]:

- Bệnh nhân <18 tháng tuổi theo dõi chặt chẽ trong 3 tháng đầu đời và 3 tháng một lần sau đó Sau 18 tháng, chúng tôi khuyến cáo nên đánh giá 4 tháng một lần

- Thường xuyên đánh giá về tốc độ tăng trưởng, cân nặng, huyết áp, cũng như khám sức khỏe ngoài việc làm xét nghiệm sự thích ứng của GC và MC

- Ở trẻ dưới 2 tuổi, nên được đánh giá tuổi xương hàng năm cho đến khi đạt được chiều cao trưởng thành

1.2 Chương trình SLSS bệnh TSTTBS

Sàng lọc sơ sinh (SLSS) là thuật ngữ dùng để chỉ thăm dò và thăm khám trong vài ngày đầu sau khi sinh, tiếp đó trẻ sơ sinh phải được lấy mẫu máu để xét nghiệm Tính toàn diện của các chương trình SLSS khác nhau ở từng địa phương và có thể sàng lọc tới 30 bệnh khác nhau

Chương trình sàng lọc sơ sinh bao gồm nhiều bước từ lúc lấy bệnh phẩm trực tiếp từ đứa trẻ trong thời kỳ sơ sinh, đến lúc gửi mẫu và có kết quả tư vấn cho gia đình tới cơ quan có đủ chuyên môn chẩn đoán và tới chẩn đoán xác định, là cả một quy trình đòi hỏi sự phối hợp chặt chẽ giữa các bên

Sau một báo cáo năm 1969 về việc gia tăng nguy cơ mắc TSTTBS trong quần thể Alaska và sự phát triển của xét nghiệm sàng lọc bằng giấy máu thấm

khô với độ nhậy cao và đặc hiệu đối với TSTTBS vào năm 1977, một chương trình SLSS TSTTBS thí điểm đã được thực hiện tại Alaska Kết quả của chương trình này đã chứng minh rằng cả tính khả thi của việc bổ sung sàng lọc TSTTBS bằng giấy lọc vào hệ thống SLSS và khả năng việc phát hiện ca bệnh bằng kỹ thuật này sẽ cải thiện đáng kể việc phát hiện các trường hợp bệnh, và do đó làm giảm tỷ lệ mắc bệnh và tử vong liên quan Ngoài ra, kết quả sàng lọc chỉ ra khả năng xác định được các trường hợp bị bỏ sót xác định giới tính ở một số trẻ gái bị nam hoá nặng Lợi ích đặc biệt là việc xác định sớm những trẻ nam giới không có triệu chứng có nhiều nguy cơ không được phát hiện [25], [26], [27]

Như vậy, mục đích chính của chương trình SLSS bệnh TSTTBS là ngăn ngừa mất muối nặng và tử vong do suy thượng thận cấp Lợi ích thứ yếu là những trẻ mắc các thể TSTTBS nhẹ hơn được chẩn đoán sớm có thể tránh các triệu chứng cường androgen sớm và thay vào đó đạt được sự tăng trưởng và phát triển bình thường Hơn 50 năm nay việc chăm sóc bệnh nhân TSTTBS đã phát triển và hiện tại vấn đề đáng chú ý không chỉ là chẩn đoán bệnh sớm và điều trị, mà cả vấn đề cải thiện việc theo dõi và nâng cao chất lượng cuộc sống về sau này của trẻ mắc bệnh [10]

1.2.1 Chương trình SLSS trên thế giới

SLSS đang được áp dụng mở rộng ở các nước trên thế giới Dựa theo kết quả sàng lọc, tỷ lệ mắc TSTTBS thể cổ điển ở hầu hết các quần thể là 1:14,000 đến 1:18,000 Tình hình dịch tễ được tổng hợp vào năm 2008 cho thấy tỉ lệ mắc bệnh trong 10 năm không có khác biệt nhiều ở các nước [2]

Mục đích chính của chương trình SLSS là chẩn đoán được bệnh sớm và tránh được tình trạng mất muối và tử vong trong thời kỳ chu sinh Tuy nhiên, những trường hợp không được phát hiện qua sàng lọc, tình trạng mất muối liên quan chặt chẽ với thiểu năng trí tuệ và các vấn đề về hành vi, suy thượng thận cấp có thể dẫn đến tử vong [28], [29] Bên cạnh đó, theo kết quả của nghiên cứu trên 1,9 triệu trẻ ở Texas được làm xét nghiệm SLSS không phải tất cả trẻ sơ

sinh đều được phát hiện qua sàng lọc ban đầu: 14% trẻ mắc TSTTBS thể cổ điển và 87% mắc TSTTBS thể không cổ điển được phát hiện trong xét nghiệm sàng lọc bước 2 [30]

Tại Nhật Bản trước khi có chương trình SLSS bệnh TSTTBS, Atsumi Tsuji-Hosokawa và cộng sự đã tiến hành một cuộc khảo sát trên toàn quốc và báo cáo [31] Theo khảo sát đó, tỷ lệ mắc bệnh 21OHD ước tính là 1/43.764, và tuổi trung bình của những ngày bệnh nhân đến khám lần đầu tại bệnh viện là 1102 Ở thể MM, tuổi trung bình của lần khám đầu tiên tại bệnh viện là 55 ngày (nam: 63 ngày (1 ngày đến 3 tuổi), nữ: 47 ngày (0 ngày đến 3,9 tuổi)) và ở thể NHĐT, độ tuổi trung bình lần đầu khám bệnh là 6,4 tuổi (nam: 5,9 tuổi (14 ngày đến 34 tuổi), nữ: 6,5 năm (0 ngày đến 44 tuổi)) Cuộc khảo sát cho thấy tỷ lệ tử vong ở trẻ sơ sinh thể MM là 10,6%, phù hợp với các báo cáo từ các quốc gia khác Ở những trường hợp 46,XX, 12,9% số đó lần đầu tiên được xác định giới tính là nam vì cơ quan sinh dục mơ hồ và được điều chỉnh thành giới tính nữ sau khi chẩn đoán 21OHD Sau khi bắt đầu thực hiện chương trình SLSS, kết quả lâm sàng của 21OHD trong giai đoạn sơ sinh và trẻ nhỏ đã được cải thiện đáng kể Độ tuổi trung bình tại lần khám đầu tiên lần lượt là 8,2 và 7,6 ngày (nam: 9,2 ngày, nữ: 6,0 ngày) ở Sapporo và Tokyo Đến nay, chưa có trường hợp tử vong nào được ghi nhận [25], [26], [27]

Theo báo cáo của Astrid và cộng sự tại Thuỵ Điển tuổi chẩn đoán trung bình ở trẻ em trai là 21 ngày với những bệnh nhân không được làm sàng lọc so với 9 ngày (trung bình) của nhóm được sàng lọc Natri huyết thanh thấp nhất được ghi nhận tại thời điểm chẩn đoán là 124 mmol/L (93–148 mmol/L) với nhóm không được sàng lọc, so với 134 mmol/L (115–148 mmol/L) với nhóm được sàng lọc [32]

Nghiên cứu khác của Patrick và cộng sự thực hiện khi so sánh tỉ lệ chẩn đoán, thời điểm chẩn đoán bệnh và thời gian nằm viện, giữa 2 nhóm được SLSS và không được SLSS giữa quần thể Arkansas và Oklahoma (4000118) với quần

thể Texas (n=1613378) trong 5 năm Kết quả là không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê trong chẩn đoán TSTTBS thể mất muối ở nhóm được SLSS (p=0,7) so với nhóm không được sàng lọc nhưng kết quả sàng lọc có hiệu quả rõ ràng hơn ở nhóm trẻ nam Nhóm trẻ nam qua SLSS được chẩn đoán sớm hơn với tuổi chẩn đoán trung bình là 12 ngày so với nhóm trẻ nam không được sàng lọc có tuổi chẩn đoán trung bình là 24 ngày, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p=0,01 Hiệu quả là giảm tỷ lệ tử vong và rút ngắn ngày nằm viện Tuy nhiên cần các nghiên cứu hợp tác lớn hoặc phân tích tổng hợp để xác định các lợi ích của chương trình sàng lọc [33]

1.2.2 Phương pháp sàng lọc sơ sinh

Phương pháp xét nghiệm sàng lọc TSTTBS cấp một được sử dụng là xét nghiệm phương pháp miễn dịch để đo nồng độ 17-OHP trong các giọt máu khô trên một thẻ giấy lọc, như Guthrie test Hiện có ba phương pháp khác nhau Kỹ thuật miễn dịch phóng xạ là kỹ thuật đầu tiên được phát triển nhưng xét nghiệm này, cũng như xét nghiệm miễn dịch liên kết với enzyme gần như đã được thay thế hoàn toàn (ở 46 tiểu bang và hầu hết các quốc gia châu Âu) bằng phương pháp xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang, vì có khả năng phân ly cao hơn, thiết bị phân tích tự động hoá hơn (DELFIA®, Wallac Oy Corporation, Turku, Phần Lan) [34]

Tuy nhiên có một số yếu tố kỹ thuật làm giảm độ chính xác của xét nghiệm này:

1) Nồng độ 17-OHP thường cao khi sinh và giảm nhanh chóng trong vài ngày đầu sau sinh ở trẻ khỏe mạnh Ngược lại, mức 17-OHP tăng theo thời gian ở trẻ sơ sinh bị TSTTBS Do đó, độ chính xác chẩn đoán kém trong 2 ngày đầu tiên trừ khi tồn tại các cơ chế mạnh mẽ để lấy mẫu theo dõi

2) Trẻ sơ sinh nữ có mức 17-OHP trung bình thấp hơn so với trẻ nam, làm giảm nhẹ độ nhạy của SLSS trong một số báo cáo

3) Trẻ sinh non, bị bệnh hoặc chịu stress có mức 17-OHP cao hơn trẻ đủ tháng, tạo ra nhiều trường hợp dương tính giả

4) Xét nghiệm miễn dịch có thể thiếu tính đặc hiệu Không có tiêu chuẩn được chấp nhận rộng rãi để phân tầng trẻ sơ sinh, nhưng hầu hết các phòng thí nghiệm sử dụng các mức giới hạn được điều chỉnh theo cân nặng khi sinh [34] Thông thường, các phòng xét nghiệm SLSS đặt giá trị cut-off 17-OHP ở ngưỡng thấp để phát hiện tất cả trẻ sơ sinh có một trong hai thể 21-OHD cổ điển (độ nhạy sàng lọc 100%) Tuy nhiên, độ đặc hiệu lại thấp 17-OHP tăng cao ở cả trẻ sinh non và trẻ sơ sinh bệnh, và thông thường trẻ trai có nồng độ 17-OHP cao hơn trẻ nữ Các yếu tố này khiến các phòng thí nghiệm điều chỉnh các giá trị cut-off dựa trên giới tính, cân nặng khi sinh và/hoặc tuổi thai của trẻ, nhưng nhìn chung, giá trị dự đoán dương tính vẫn thấp (trung bình dưới 10%) đối với xét nghiệm miễn dịch bậc một được thực hiện trên bệnh phẩm được thu thập trong vòng hai ngày tuổi Vì vậy trong 15 năm nay chương trình SLSS cần đến sàng lọc bước hai để tăng sự đặc hiệu Xét nghiệm sàng lọc bước hai, được thực hiện trên mẫu ban đầu, định lượng 17-OHP cộng với các steroid bổ sung, bao gồm cortisol, 21-deoxycortisol và androstenedione, sắc kí lỏng khối phổ kép Sự kết hợp khác nhau giữa các nồng độ và tỷ lệ steroid riêng lẻ đã được chứng minh là giúp tăng cường độ đặc hiệu của sàng lọc, giảm tỷ lệ dương tính giả lên tới 90% Trong một nghiên cứu tiến cứu gần đây, giá trị dự đoán dương tính được báo cáo là 17% đã đạt được với một thuật toán sàng lọc bao gồm cả xét nghiệm miễn dịch bước một và xét nghiệm steroid bước hai [34], [35]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn:

Bệnh nhân chẩn đoán TSTTBS thiếu 21-OH tại Trung tâm Nội tiết, Chuyển hóa, Di truyền và Liệu pháp phân tử, Bệnh viện Nhi Trung ương, theo tiêu chuẩn [36]:

- 17-OHP tĩnh mạch ≥ 3 nmol/l kết hợp với có kết quả SLSS (17-OHP máu gót chân > 60nmol/l)

- hoặc hai allele đột biến gây bệnh của gen CYP21A2,

- hoặc lâm sàng(1) + xét nghiệm hóa sinh(2):

(1) Nam hóa:

• Trẻ gái: âm vật phì đại, dính hai môi lớn, xoang niệu dục; • Trẻ nam: dậy thì sớm

(1) Sạm da và niêm mạc (môi, tuyến vú và bộ phận sinh dục)

(1) Chậm tăng cân hoặc sụt cân sau đẻ, nôn, mất nước, bú kém, li bì có thể có sốc;

(2) ACTH tăng, hạ Natri, tăng Kali; • Na+ < 130 mmol/l,

• hoặc Na+ 130-135 mmol/l + K+ > 5,5 mmol/l - Gia đình chấp thuận tham gia vào nhóm nghiên cứu

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ:

- Loại trừ các thể TSTTBS khác (được khẳng định bằng chẩn đoán phân tử) bao gồm thiếu 11β-OH; thiếu 3β-hydroxysteroid dehydrogenase typ 2

- Các bệnh nhân không chấp thuận tham gia nghiên cứu

2.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu:

- Địa điểm: Trung tâm Nội tiết, Chuyển hóa, Di truyền và Liệu pháp phân tử, Bệnh viện Nhi Trung ương

- Thời gian hồi cứu: từ tháng 6/2017 đến tháng 1/2022

- Thời gian tiến cứu: từ tháng 1/2022 đến tháng 9/2022

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế và chọn mẫu nghiên cứu

209 bệnh nhân TSTTBS thể 21-OH

Nghiên cứu mô tả một loạt các ca bệnh (case series study), hồi cứu và tiến cứu Chọn mẫu thuận tiện, lấy tất cả các bệnh nhân đủ tiêu chuẩn trong thời gian nghiên cứu

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 2.2.2 Chỉ số nghiên cứu và phương pháp thu thập số liệu

2.2.2.1 Các chỉ số nghiên cứu cho mục tiêu 1 Đặc điểm kiểu hình

Phân loại bệnh nhân vào các nhóm kiểu hình lâm sàng gồm có MM, NHĐT, KCĐ dựa vào các chỉ số sau đây:

SLSS (+): 17-OHP máu gót chân > 60 nmol/l

1) Lâm sàng

- Tiền sử: cân nặng lúc sinh, tuổi thai được phân loại theo WHO (World Health Organization) 2014: đẻ non < 37 tuần, đủ tháng 37-41 tuần, già tháng > 41 tuần, tiền sử bệnh tật của anh chị em ruột và các thành viên trong gia đình

- Cân nặng khi chẩn đoán bệnh (gr)

- Chiều cao khi chẩn đoán (cm) – đo chiều cao bằng thước đo SECA: chiều dài nằm cho trẻ < 2 tuổi hoặc trẻ không đứng được, và đo chiều cao đứng cho trẻ > 2 tuổi

- Giới: nam, nữ

- Các triệu chứng: suy thượng thận cấp bao gồm mất nước, giảm cân, nôn, tiêu chảy; sạm da; mức độ nam hoá ở trẻ gái theo Prader (phụ lục 2), các giai đoạn dậy thì theo Tanner (phụ lục 3) [37], [38], bao gồm: các giai đoạn phát triển lông mu ở cả hai giới; các giai đoạn phát triển tuyến vú ở bệnh nhân nữ; đo chiều dài và chu vi dương vật; đo thể tích tinh hoàn bằng bộ dụng cụ orchidometer; phát hiện các biểu hiện khác như: giọng ồm, ria mép ở bệnh nhân nữ; cơ bắp phát triển, trứng cá ở cả hai giới

2) Cận lâm sàng

- Xét nghiệm hóa sinh: ure, glucose, creatinin, điện giải đồ, 17OHP, ACTH, testosteron, cortisol 8 giờ Được tiến hành ở Khoa Sinh hoá Bệnh viện Nhi Trung ương

Điện giải đồ huyết thanh (định lượng nồng độ Na+, K+ và Cl-) theo phương pháp điện cực chọn lọc ion gián tiếp, sử dụng máy tự động Beckman Coulter AU2700/ AU 680 Chỉ số bình thường Na+ 134-143 mmol/l, K+ 3,5- 5,6 mmol/l, Cl- 97 – 110 mmol/l

Định lượng các hormon ACTH, cortisol, testosterone, androstenedione, OHP được tiến hành ở điều kiện cơ bản Giá trị bình thường 17OHP < 19,1

17-nmol/l, Testosteron < 2,19 17-nmol/l, ACTH 1,6-13,9 pmol/l, cortisol 8 giờ 138 – 690 nmol/l

- Siêu âm ổ bụng thượng thận, siêu âm tử cung, buồng trứng ở trẻ gái; Xquang tuổi xương được tiến hành tại Khoa Chẩn đoán hình ảnh, Bệnh viện Nhi Trung ương X-quang tuổi xương cho trẻ nam và nữ > 3 tuổi và nhận định kết quả dựa trên Atlat của Greulich và Pyle

- Xét nghiệm NST ở trẻ gái – được chỉ định trong trường hợp mơ hồ giới tính Bệnh phẩm là 2 ml máu ngoại vi chống đông bằng heparin được tiến hành tại Khoa Di truyền Sinh học Phân tử, Bệnh viện Nhi Trung ương

Đặc điểm kiểu gen

Bệnh nhân được thu thập 2 ml máu tĩnh mạch, chống đông bằng EDTA 1,5 mg/ml Quy trình đảm bảo tuyệt đối vô trùng ADN được chiết tách theo quy trình chuẩn từ bạch cầu lympho máu ngoại vi sử dụng kit thương mại tại Khoa Di truyền và Sinh học phân tử, Bệnh viện Nhi Trung ương

Giải trình tự và/hoặc MLPA tìm đột biến của gen CYP21A2

Viết danh pháp các đột biến: các đột biến phát hiện được ở các bệnh nhân được viết dưới dạng thay đổi của nucleotid trong phân tử cDNA và ở dạng thay đổi của protein Đối với cDNA thì danh pháp được đánh số bắt đầu từ nucleotid A của bộ ba mã hóa cho acid amin đầu tiên (HGVS Recommendations for the description of sequencing variants: 2016 update Hum Mutat 2016) Đối với thay đổi protein thì đột biến được viết theo danh pháp “Genome Variation Nonmenclature” (http://www.hgvs.org/mutnomen/)

Trình tự gen CYP21A2 thu được sẽ được so sánh với trình tự gen CYP21A2tham khảo ở “reference sequencing NM_000500.2”

Các đột biến của CYP21A2 phát hiện được sẽ được so sánh với dữ liệu

http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/gene.php?gene=CYP21A2 và so sánh với dữ liệu

của uỷ ban danh pháp Cytochrome P450 allele người Gen CYP21A2 tại

http://www.cypalleles.ki.se/cyp21.htm

Các đột biến chưa được báo cáo tại các cơ sở dữ liệu trên đây sẽ được kiểm tra đối chiếu với dữ liệu tại 1000 genomes database tại "MutationTaster" http://www.mutationtaster.org Đột biến nào chưa được báo cáo tại các cơ sở dữ liệu trên đây sẽ được coi là đột biến mới (novel mutation) hay đột biến chưa được báo cáo (unreported mutation)

Tương quan kiểu gen – kiểu hình và tỷ lệ dự báo dương tính

Để đánh giá tương quan kiểu gen - kiểu hình, các bệnh nhân được chia thành 4 nhóm kiểu gen (Krone 2000 có bổ xung) [12]:

Nhóm “null” (0): các đột biến gây mất toàn bộ hoạt độ enzym: xóa đoạn, exon 6 cluster, p.L307FfsX6, p.Q318X, p.R356X, và các đột biến mới gây lệch khung dịch mã trên cả 2 allele

Nhóm A: đồng hợp tử đột biến trên intron 2 (I2g), hoặc có một allele là I2g và allele khác là đột biến trong nhóm “null” Đột biến I2g được biết là còn lượng hoạt độ enzym rất nhỏ

Nhóm B: đột biến p.I172N (hoạt độ enzym còn khoảng 2%) đồng hợp tử hoặc dị hợp tử kép với các đột biến của nhóm “null” hoặc A, hoặc hoán vị gen promoter + p.P30L

Nhóm C: đột biến p.P30L, p.V281L (còn khoảng 20-60% hoạt độ enzym) đồng hợp tử hoặc dị hợp tử kép với các đột biến của nhóm “null”, hoặc A, hoặc B

Nhóm D: các đột biến chưa đánh giá được ảnh hưởng của đột biến trên hoạt độ enzym và các bệnh nhân chưa xác định được đột biến

Kiểu hình dự báo kết hợp với các nhóm kiểu gen “null” và A là thể cổ điển MM, nhóm kiểu gen B là cổ điển NHĐT, và nhóm kiểu gen C là thể không cổ điển Giá trị dự báo dương tính (positive predictive value - PPV) được tính

bằng số bệnh nhân có kiểu hình đúng như dự báo của mỗi nhóm kiểu gen chia cho tổng số bệnh nhân của nhóm đó và nhân với 100 Cụ thể như sau:

 PPV-0 = n bệnh nhân thể MM của nhóm “null”/tổng số bệnh nhân có kiểu gen thuộc nhóm “null” x 100;

 PPV-A = n bệnh nhân thể MM trong nhóm A/tổng bệnh nhân có kiểu gen thuộc nhóm A x 100;

 PPV-B = n bệnh nhân thể NHĐT trong nhóm B/tổng số bệnh nhân có kiểu gen thuộc nhóm B x 100;

 PPV-C = n bệnh nhân thể không cổ điển trong nhóm C/tổng số bệnh nhân có kiểu gen thuộc nhóm C x 100

Để đánh giá tương quan giữa mức độ nặng của nam hóa bộ phận sinh dục ngoài với kiểu gen của các bệnh nhân nữ thì tỷ lệ của các mức độ nam hóa giữa các nhóm kiểu gen khác nhau được so sánh

Để đánh giá tương quan giữa mức độ nặng của nam hóa bộ phận sinh dục ngoài với kiểu gen của các bệnh nhân nữ thì tỷ lệ của các mức độ nam hóa giữa các nhóm kiểu gen khác nhau được so sánh trong huyết thanh của các bệnh nhân của từng nhóm kiểu gen “null”, A, B, C được so sánh với nhau

2.2.2.2 Các chỉ số nghiên cứu cho mục tiêu 2

- Khai thác tiền sử SLSS: thời điểm lấy mẫu, thời điểm trả kết quả, kết quả 17-OHP máu gót chân, dấu hiệu bệnh xuất hiện trước khi có kết quả SLSS hay không

- Tuổi chẩn đoán bệnh

- Mức độ mất nước: nhẹ, trung bình, nặng - Sạm da

- Định lượng điện giải đồ:

o Mức độ hạ Na máu cấp: Nhẹ: 130-134 mmol/L, trung bình: 129 mmol/L, nặng: < 125 mmol/L

125-o Kali máu: tăng khi > 5,5 mmol/l

- Định lượng 17-OHP máu tĩnh mạch - Thời gian nằm viện

Các chỉ số nghiên cứu này chúng tôi đã mô tả cách thức thu thập và đánh giá kết quả ở mục tiêu 1

Các kết quả này chúng tôi so sánh giữa hai nhóm được phát hiện qua SLSS và không qua SLSS để đánh giá mức độ nặng

2.3 Xử lý số liệu thống kê

Các phiếu bệnh án đã thu thập phải được kiểm tra trước và sau khi nhập số liệu, các phiếu bệnh án không rõ ràng hoặc không phù hợp phải được hoàn thiện hoặc loại bỏ

Nhập số liệu và xử lý được tiến hành 2 lần để đối chiếu kết quả

Số liệu được nhập vào máy tính trên phần mềm Microsoft Excel 2019, các thông tin được mã hóa bằng số hoặc các ký tự riêng, đồng thời được kiểm tra tính logic

Các số liệu đã thu thập được sẽ được xử lý theo thuật toán thống kê y học trên máy tính bằng chương trình phần mềm STATA 14.0 để tính toán các thông số thực nghiệm Các biến định lượng phân bố chuẩn sẽ thể hiện dưới dạng trung bình, độ lệch chuẩn Nếu biến định lượng phân bố không chuẩn sẽ thể hiện dưới dạng trung vị và tứ phân vị Các biến số định tính được trình bày theo tần suất, tỷ lệ phần trăm (%) Số liệu được trình bày bằng bảng và biểu đồ minh họa

Test kiểm định sử dụng: Chi - square test (2) (được hiệu chỉnh Fisher’s exact test khi thích hợp) để so sánh các tỷ lệ T-test để so sánh hai trung bình có phân bố chuẩn, test Kruskal-Wallis để so sánh trung vị nếu không phải là phân bố chuẩn Các phép kiểm định, so sánh có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05

2.4 Đạo đức nghiên cứu

- Nghiên cứu được tiến hành với sự tuân thủ về mặt y đức, được chấp thuận của Hội đồng Bảo vệ đề cương luận văn cao học trường Đại học Y Dược –

Đại học Quốc gia Hà Nội và Hội đồng đạo đức Bệnh viện Nhi Trung ương (phụ lục 4), được sự đồng ý của đối tượng nghiên cứu

- Thu thập mẫu bệnh phẩm máu, nước tiểu và các xét nghiệm là cần thiết để chẩn đoán bệnh, điều trị và theo dõi Các thủ thuật thu nhận bệnh phẩm đơn giản và an toàn cho bệnh nhân

- Nghiên cứu chỉ quan sát mô tả, không can thiệp vào quá trình điều trị của bệnh nhân

- Nghiên cứu không có mâu thuẫn lợi ích liên quan

- Các thông tin được thu thập đầy đủ, trung thực, khách quan theo mục tiêu nghiên cứu và giải thích rõ về mục đích nghiên cứu theo dõi bệnh nhân, để gia đình bệnh nhân tự nguyện tham gia Bệnh nhân sẽ được thông báo về kết quả xét nghiệm gen để giúp cho các bác sĩ tư vấn di truyền hoặc lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp Gia đình bệnh nhân có quyền rút khỏi nghiên cứu Các thông tin cá nhân sẽ được đảm bảo bí mật và chỉ được sử dụng làm nghiên cứu