Nghiên cứu đặc điểm kiểu gen liên quan kháng carbapenem ở các chủng Enterobacteriaceae phân lập được bằng kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen (2015 2019).Nghiên cứu đặc điểm kiểu gen liên quan kháng carbapenem ở các chủng Enterobacteriaceae phân lập được bằng kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen (2015 2019).Nghiên cứu đặc điểm kiểu gen liên quan kháng carbapenem ở các chủng Enterobacteriaceae phân lập được bằng kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen (2015 2019).Nghiên cứu đặc điểm kiểu gen liên quan kháng carbapenem ở các chủng Enterobacteriaceae phân lập được bằng kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen (2015 2019).Nghiên cứu đặc điểm kiểu gen liên quan kháng carbapenem ở các chủng Enterobacteriaceae phân lập được bằng kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen (2015 2019).Nghiên cứu đặc điểm kiểu gen liên quan kháng carbapenem ở các chủng Enterobacteriaceae phân lập được bằng kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen (2015 2019).Nghiên cứu đặc điểm kiểu gen liên quan kháng carbapenem ở các chủng Enterobacteriaceae phân lập được bằng kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen (2015 2019).Nghiên cứu đặc điểm kiểu gen liên quan kháng carbapenem ở các chủng Enterobacteriaceae phân lập được bằng kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen (2015 2019).Nghiên cứu đặc điểm kiểu gen liên quan kháng carbapenem ở các chủng Enterobacteriaceae phân lập được bằng kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen (2015 2019).Nghiên cứu đặc điểm kiểu gen liên quan kháng carbapenem ở các chủng Enterobacteriaceae phân lập được bằng kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen (2015 2019).Nghiên cứu đặc điểm kiểu gen liên quan kháng carbapenem ở các chủng Enterobacteriaceae phân lập được bằng kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen (2015 2019).
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÕNG HỌC VIỆN QUÂN Y HÀ THỊ THU VÂN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM KIỂU GEN LIÊN QUAN KHÁNG CARBAPENEM Ở CÁC CHỦNG ENTEROBACTERIACEAE PHÂN LẬP ĐƢỢC BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ TOÀN BỘ HỆ GEN (2015 - 2019) Ngành: Khoa học Y sinh Mã số: 9720101 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI -2023 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI HỌC VIỆN QUÂN Y Người hướng dẫn khoa học GS.TS Keigo Shibayama PGS.TS Nguyễn Thái Sơn Phản biện 1: PGS.TS Hoàng Vũ Hùng Phản biện 2: PGS.TS Phan Quốc Hoàn Phản biện 3: PGS.TS Hoàng Thị Thu Hà Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường vào hồi: ngày tháng Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc Gia Thư viện Học viện Quân y năm 2023 ĐẶT VẤN ĐỀ Tính cấp thiết đề tài Trong vài thập niên trở lại đây, bệnh nhiễm khuẩn có chiều hướng gia tăng tiến triển theo chiều hướng xấu, điển hình trường hợp nhiễm khuẩn vi khuẩn Gram âm Trong số nguyên gây nhiễm khuẩn vi khuẩn Gram âm vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae loài vi khuẩn nghiên cứu nước đề cập đến nhiều khả gây nhiều bệnh nhiễm trùng nghiêm trọng mức độ lây lan nhanh kháng kháng sinh nhiễm khuẩn huyết, viêm phổi, nhiễm trùng đường tiết niệu, nhiễm trùng bệnh viện, nhiễm trùng bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch, có nguy gây tử vong cao cho bệnh nhân Tháng năm 2017, Tổ chức Y tế Thế giới công bố danh sách vi khuẩn cần ưu tiên phát triển loại kháng sinh tình trạng kháng thuốc đáng báo động Trong danh sách này, chủng vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae kháng cefalosporin hệ kháng carbapenem xếp vào ưu tiên hàng đầu chúng kháng lại với hầu hết kháng sinh có Năm 2022, IDSA đưa hướng dẫn điều trị chủng kháng carbapenem theo chế kháng, theo phác đồ chuyên biệt với loại carbapenemase cụ thể Hiện có nhiều phương pháp để chẩn đoán, phát Enterobacteriaceae sinh carbapenemase phương pháp dựa khả ly giải kháng sinh nhóm carbapenems carbapenemase (Hodge test, Carba NP, mCIM), phương pháp PCR phát gen mã hóa carbapenemase, phương pháp giải trình tự gen vi khuẩn Ngày nay, sử dụng giải trình tự tồn hệ gen vi khuẩn chẩn đoán vi khuẩn sinh carbapenemase ngày phổ biến Phương pháp có nhiều ưu điểm như: cung cấp toàn diện chế kháng thuốc vi khuẩn, phát gen kháng carbapenem, phát gen liên quan đến kháng kháng sinh khác gen xuất hiện, phát vị trí gen kháng carbapenem nằm nhiễm sắc thể hay plasmid, xây dựng phân loại vi khuẩn… Căn vào kết tổ hợp gen liên quan kháng kháng sinh yếu tố liên quan để tiên lượng mức độ kháng thuốc, lựa chọn kháng sinh điều trị theo chế kháng, có chiến lược sử dụng kháng sinh hợp lý góp phần nâng cao hiệu điều trị kiểm soát nhiễm khuẩn bệnh viện, giảm gánh nặng nguy lan truyền vi khuẩn kháng thuốc cộng đồng Các kết nghiên cứu cung cấp liệu Việt Nam mức độ vi khuẩn kháng thuốc cao so với kết nghiên cứa từ nước khác, đặc biệt mức độ kháng kháng sinh Enterobacteriaceae, đồng thời tỷ lệ Enterobacteriaceae sinh carbapenemase cao so với nước khu vực nghiên cứu chế phân tử liên quan đến kháng thuốc cịn hạn chế Chính đề tài “Nghiên cứu đặc điểm kiểu gen liên quan kháng carbapenem chủng Enterobacteriaceae phân lập kỹ thuật giải trình tự tồn hệ gen (2015 -2019)” Mục tiêu nghiên cứu - Xác định đặc điểm kháng kháng sinh phân bố chủng Enterobacteriaceae sinh carbapenemase phân lập Bệnh viện Quân y 103 (2015 -2019) - Phân tích đặc điểm kiểu gen liên quan kháng carbapennem số chủng Enterobacteriaceae đa kháng phân lập nghiên cứu kỹ thuật giải trình tự tồn hệ gen 3 Nội dung nghiên cứu đề tài - Xác định đặc điểm kháng kháng sinh Enterobacteriaceae, thu thập chủng kháng carbapenem - Xác định tỷ lệ, đặc điểm phân bố Enterobacteriaceae sinh carbapenemase Xác định tỷ lệ, đặc điểm phân bố gen mã hóa carbapenemase Enterobacteriaceae phân lập - Đặc điểm liên quan gen kháng carbapenem với gen kháng loại kháng sinh khác có Enterobacteriaceae - Liên quan kiểu gen kháng carbapenem mức độ kháng với kháng sinh carbapenem - Đặc điểm liên quan gen kháng carbapenem với đặc điểm phát sinh sequence type, nguồn gốc chủng mang gen kháng - Đăc điểm plasmid liên quan đến gen kháng carbapenem đặc điểm plasmid mang gen kháng xuất chủng giải trình tự Đóng góp luận án Cung cấp thêm số liệu tính kháng kháng sinh, xu hướng chuyển dịch tính kháng từ MDR sang XDR Enterobacteriaceae Bệnh viện Quân y 103, từ làm rõ tranh toàn cảnh vi khuẩn kháng kháng sinh Việt Nam - Cung cấp thêm liệu quan trọng đặc điểm sinh học phân tử vi khuẩn kháng thuốc, đa dạng gen mã hố tính kháng kháng sinh, đa dạng loại ST, plasmid mang gen mã hóa kháng kháng sinh - Lần ghi nhận: 02 chủng E coli mang tổ hợp gen mã hóa carbapenemase blaNDM-5 + blaOXA-484, ST 8346 02 chủng K pneumoniae mang Tmex-CD1 mã hóa kháng tigecyline 01 chủng Enterobacter spp mang mcr-9 mã hoá kháng colistin Cấu trúc luận án Luận án gồm 138 trang, chia thành phần: Đặt vấn đề (2 trang) Những đóng góp luận án (1 trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu (37 trang); Chương 2: Vật liệu phương pháp nghiên cứu (29 trang); Chương 3: Kết nghiên cứu (36 trang); Chương 4: Bàn luận kết (30 trang); Kết luận kiến nghị (3 trang); Các cơng trình cơng bố tác giả (1 trang) Luận án có 11 bảng biểu, 40 hình 194 tài liệu tham khảo tiếng Việt tiếng Anh Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án tham khảo tài liệu nước vấn đề chính: (1) Đặc điểm họ Enterobacteriaceae; (2) Sự kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn;(3) Các kỹ thuật thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh phát vi khuẩn sinh carbapenemase Họ Enterobacteriaceae (vi khuẩn đường ruột) họ lớn bao gồm trực khuẩn Gram âm, hiếu kị khí tùy ngộ, khơng sinh bào tử [1] Họ vi khuẩn đường ruột cư trú nhiều nơi khác nhau, bao gồm đường tiêu hóa người, đường tiêu hóa động vật khác môi trường khác Một số tác nhân gây bệnh động vật, gây nhiễm trùng cho quần thể động vật Chúng tồn đa dạng sinh vật khác phương thức truyền bệnh chúng sang người khác Các thành viên hay gặp gây nhiễm trùng bệnh viện bao gồm K pneumoniae., E coli, Citrobacter spp., Enterobacter spp., Proteus spp., Serratia spp nhiều loài khác Sau kháng sinh đưa thị trường thời gian, người ta nhận thấy kháng sinh sử dụng nhiều nhanh bị kháng Việc nhiều kháng sinh đưa thị trường kèm theo phối hợp nhiều kháng sinh điều trị dẫn đến vi khuẩn kháng lại nhiều loại kháng sinh đồng thời, vi khuẩn MDR, XDR, PDR [2], [3] Trong thập kỷ qua, chế đề kháng nghiêm trọng gọi kháng carbapenem thông qua carbapenemese phát Enterobacteriaceae Các loại carbapenemase khác bao gồm KPC (Class A) VIM, IMP, NDM (Class B) OXA48 (Class D) Các gen mã hóa carbapenemase chủ yếu tìm thấy transposon plasmid Các yếu tố có khả chép di chuyển độc lập sinh vật Plasmid tồn dạng nhiễm sắc thể thu nhỏ dạng chuỗi kép, khép kín, hình trịn Một tế bào vi khuẩn chứa vài plasmid Các yếu tố định lan truyền tính kháng thuốc có khả tồn tảng di truyền đa dạng di chuyển từ yếu tố di truyền sang yếu tố di truyền khác, sinh vật sang sinh vật khác, qua chi loài với khả khơng giới hạn Do đó, điều quan trọng bác sĩ lâm sàng nhà xét nghiệm không bỏ qua mơ hình kháng kháng sinh lên [4] Sự bùng nổ sinh học phân tử hai thập kỷ qua cung cấp giải pháp thay hỗ trợ cho xét nghiệm kiểu hình để xác định khả kháng kháng sinh vi khuẩn, thông qua xác định kiểu gen kháng thuốc Những năm gần đây, công nghệ giải trình tự hệ (Next Generation Sequencing- NGS) đời giúp giải mã toàn hệ gen vi khuẩn cách nhanh chóng với loạt ưu điểm vượt trội NGS giúp xác định tất tổ hợp gen liên quan kháng, phát gen mới, xác định vị trí gen nằm plasmid hay chromosome, phân tích đặc điểm plasmid mang gen kháng, xây dựng phát sinh loài… từ đem lại lợi ích to lớn nghiên cứu vi khuẩn kháng thuốc, góp phần tích cực cho điều trị hạn chế tình trạng kháng thuốc vi khuẩn Trên giới, tình trạng lan truyền tính kháng carbapenem vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae trở thành vấn đề báo động toàn cầu, có nhiều vụ dịch vi khuẩn kháng thuốc gây [5] Ở Việt Nam, hai chủng E coli K pneumoniae sản sinh NDM-1 phân lập từ hai bệnh nhân vào tháng năm 2010 [6] Đã có số nghiên cứu gen kháng carbapenem Enterobacteriaceae, nhiên đa số sử dụng phương pháp phát kiểu hình, PCR phát gen kháng Có số nghiên cứu sử dụng phương pháp giải trình tự tồn để nghiên cứu đặc điểm hệ gen nhiên dừng lại số loài E coli, K pneumoniae, chưa có nghiên cứu đầy đủ giải trình tự loài thuộc họ Enterobacteriaceae, đặc biệt sử dụng giải trình tự Nanopore để nghiên cứu đặc điểm plasmid loài vi khuẩn Phát kháng thuốc kiểu gen có giá trị dự báo nguy nhóm kháng sinh giảm hiệu lực điều trị phạm vi cụ thể (phạm vi bệnh viện, địa phương, quốc gia, quốc tế) tùy thuộc vào cỡ mẫu phạm vi nghiên cứu, từ giúp nhà quản lý hoạch định sách quản lý, sử dụng kháng sinh hợp lý (dừng lưu hành kháng sinh có tỷ lệ phát kháng, gen kháng diện rộng, đưa vào lưu hành kháng sinh tỷ lệ kháng thấp/ mang gen kháng ) Như vậy, trước tình trạng vi khuẩn khơng ngừng gia tăng mức độ kháng thuốc việc nghiên cứu tồn diện, thường xuyên vi khuẩn kháng kháng sinh cần thiết Nếu khơng có biện pháp ngăn chặn, giám sát lan truyền tính kháng kháng sinh dự đốn xuất nhiều vụ dịch Enterobacteriaceae toàn kháng tương lai gần Chƣơng ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chủng vi khuẩn Gồm 1236 chủng Enterobacteriaceae gây bệnh phân lập từ bệnh phẩm, từ khoa lâm sàng bệnh nhân điều trị bệnh viện Thời gian thu thập mẫu: từ tháng 1/2015 đến tháng 12/2019 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.1 Nuôi cấy phân lập xác định loài vi khuẩn theo hướng dẫn WHO 2.2 Định danh vi khuẩn, xác định mức độ nhạy cảm với kháng sinh hệ thống Vitek-2- Compact Lựa chọn chủng kháng với kháng sinh carbapenem 2.3 Sàng lọc chủng Enterobacteriaceae kháng carbapenem sinh enzym carbapenemase theo phương pháp ức chế carbapenem cải tiến mCIM 2.4 Giải trình tự tồn hệ gen chủng vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae kháng carbapenem số chủng đa kháng nhạy carbapenem (174 chủng) phương pháp giải trình tự hệ Illumina (Khoa Vi sinh Viện Truyền nhiễm Quốc gia Nhật Bản 2.5 Lựa chọn chủng mang gen mã hóa carbapenemase, thực kháng sinh đồ MIC kỹ thuật E-test với kháng sinh nhóm carbapenem phương pháp vi pha loãng ống nghiệm với kháng sinh colistin 2.6 Phân tích đặc điểm plasmid mang số gen kháng carbapenem gen kháng sử dụng kỹ thuật Oxford Nanopore (Khoa Vi sinh Viện Truyền nhiễm Quốc gia Nhật Bản) 2.7 Phân tích mức độ kháng kháng sinh, tỷ lệ MDR, XDR theo WHONET 2.8 Phân tích trình tự WGS cơng cụ tin sinh học 2.9 Xử lý, phân tích số liệu phần mềm SPSS 20.0 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Mức độ kháng kháng sinh Enterobateriaceae đặc điểm phân bố Enterobateriaceae sinh carbapenemase 3.1.1 Đặc điểm phân bố Enterobacteriaceae Trong thời gian năm, tổng số vi khuẩn Enterobacteriaceae phân lập 1236 chủng Trong số vi khuẩn Enterobacteriaceae phân lập E coli chiếm tỷ lệ cao (sau đến K pneumonia 3.1.2 Mức độ kháng kháng sinh E coli E coli có tỷ lệ kháng với ampicillin từ 87,18% đến 96,39% Tỷ lệ kháng với levofloxacin từ 58,33% đến 84%, ciprofloxacin từ 46,87% đến 72,81%, với norfloxacin tỷ lệ kháng từ 40,91% đến 72,62% với p < 0,05 E coli kháng Cefotaxim từ 54,10% đến 78,57%, với Ceftazidim từ 36% đến 47,57% E coli có tỷ lệ kháng 10% với kháng sinh nhóm carbapenem, Amikacin Trong số vi khuẩn đa kháng phân lập E coli kháng mở rộng có xu hướng tăng dần với tỷ lệ 44,44% vào năm 2015 48,96% vào năm 2019 E coli đa kháng không thuộc chủng kháng mở rộng có xu hướng giảm dần từ 55,56% vào năm 2015 đến 48,96% vào năm 2019 11 3.2 Đặc điểm kiểu gen liên quan kháng carbapenem chủng MDR đƣợc giải trình tự 3.2.1 Tỷ lệ, phân bố gen mã hóa carbapenemase phân lập Trong tổng số 107 CRE (1.2015-6.2019) phát 84 chủng mang gen mã hóa carbapenemmase (78,50%), chủng phát sinh carbapenemase theo phương pháp mCIM, 23 chủng Enterobacteriaceae kháng carbapenem không phát mang gen mã hóa carbapenemase (21,50%) Trong tổng số 84 chủng sinh carbapenemase, có 12 chủng mang kết hợp gen kháng, 72 chủng đơn gen, tổng số gen mã hóa kháng carbapenem 96 gen mã hóa kháng carbapenem Gen mã hóa carbapenemase phân lập nhiều blaNDM (60,42%), tiếp đến blaKPC (27,08%) blaOXA - 48 (12,50%) Số 14 12 10 13 blaKPC-2 blaNDM-1 blaNDM-1 + blaKPC-2 blaNDM-1, blaNDM-1-like blaNDM-4 blaNDM-4 + blaOXA-181 blaNDM-4 + blaOXA-48 blaNDM-5 0 blaNDM-5 + blaOXA-484 blaOXA-181 2015 2016 2017 2018 2019* blaOXA-48 Hình 3.10: Phân bố gen mã hóa carbapenemase theo năm Enterobacteriaceae Có tăng lên kiểu tổ hợp gen xuất gen mã hóa carbapenemase theo thời gian Năm 2015, 2016 ghi nhận 2, kiểu gen tổ hợp gen mã hóa kháng carbapenem Đến năm 2017, 2018 kiểu tổ hợp gen mã hóa kháng carbapenem ghi nhận lần 12 lượt kiểu, xuất kiểu tổ hợp gen kháng blaNDM -5 + blaOXA-484 3.2.2 Đặc điểm kết hợp gen kháng kháng sinh có chủng đa kháng Phân tích kết giải trình tự 174 chủng đa kháng cho thấy Enterobateriaceae đa kháng mang nhiều loại gen kháng kháng sinh kiểu kết hợp gen kháng kháng sinh khác Đã xác định gen kháng với 15 nhóm kháng sinh với đa dang biến thể khác Có xuất gen kháng blaOXA-484 mã hóa enzyme kháng carbapenem, Tmex mã hóa enzyme kháng Tigercillin; Mcr-1 Mcr-9 mã hóa enzyme kháng colistin Hình 3.15 Mức độ kết hợp gen mã hóa kháng kháng sinh Enterobacteriaceae Enterobacteriaceae mang gen mã hóa carbapenemase đồng thời mang gen kháng với nhiều nhóm kháng sinh khác gen mã hóa kháng b-lactam phổ rộng, Aminoglycoside, Fluoroquinolone and aminoglycoside, Quinolon, Rifampicin, Sulphonamide, Trimethoprim, Phenicol, Fosfomycin Trong chủ yếu kết hợp 13 10 đến 12 nhóm gen kháng sinh khác khơng ghi nhận chủng kết hợp với nhóm gen kháng kháng sinh khác Các chủng không mang gen mã hóa carbapenemase có kết hợp với gen kháng chủ yếu từ đến nhóm gen kháng khơng ghi nhận chủng kết hợp với 12 nhóm gen kháng kháng sinh khác 3.2.3 Đặc điểm liên hệ kiểu gen mã hóa kháng carbapenem kiểu trình tự vi khuẩn K pneumoniae mang gen kháng phân bố vào ST khác bao gồm ST11, ST15, ST16, ST307, ST395 ST656 Trong ST15 gặp nhiều Có chủng mang gen kháng carbapenem chưa xác định ST blaNDM blaKPC-2 gặp hầu hết ST, bla OXA - 48 có xu hướng tập trung ST15 ST16 Hình 3.17 Cây phân loại core genonem chủng K pneumoniae mang gen mã hóa carbapenemase 14 Hình 3.19 Cây phân loại core genome chủng vi khuẩn E coli mang gen mã hóa carbapenemase Có tổng số loại ST, 03 chủng ST448 02 chủng ST405, 01 chủng ST46, 01 chủng ST457 ST405 mang khơng mang gen mã hóa carbapenemase Hai chủng mang kết hợp gen kháng blaNDM blaOXA-484 thuộc ST8346 hai chủng mang blaNDM chưa xác định ST Hai chủng ST405 xác định có mang khơng mang gen mã hóa carbapenemase 3.2.5 Kết phân tích plasmid chủng Enterobacteriaceae mang gen kháng carbapenem Từ kết giải trình tự tồn hệ gen vi khuẩn, phân tích xác định số lượng, loại plasmid có chủng vi khuẩn đa kháng Rất đa dạng loại plasmid mang gen mã hóa kháng kháng sinh tìm thấy từ chủng giải trình tự tồn Có 51 loại plasmid ghi nhận Trong đó, chủng sinh carbapenemase gặp đa dạng loại plasmid chủng không mang gen mã hóa carbapenemase Trong nghiên cứu này, tỷ lệ vi khuẩn mang gen kháng carbapenem hay gặp blaNDM (58/96; 60,42%) Từ kết 15 giải trình tự toàn ghi nhận số chủng mang gen kháng kháng sinh bao gồm: 02 chủng K pneumoniae mang gen tmexCD1, mã hóa kháng tigecylin, 01 chủng Enterobacter homachei mang gen mang gen mcr – 9, mã hóa kháng colistin Các gen nằm plasmid Giải trình tự tồn với trình tự đọc dài Nanopore thực với số Enterobacteriaceae mang blaNDM plasmid mang gen kháng kháng sinh Hình 3.25 So sánh cấu trúc xung quanh blaNDM-1 số Enterobacteriaceae (A) so sánh P mirabilis pMH13-009N_1và Salmonella enterica FDAARGOS (B) so sánh E coli pMH13- 051M_1; C freundii pMH17-012N_2 ; E coli p103-2-4 Salmonella enterica Enteritidis p12367A Màu đỏ, vàng, xanh lam , xanh lục xám hiển thị cho gen blaNDM, gen kháng thuốc quan trọng khác AMR (ARGs), gen điều tiết (T4SS), gen liên quan đến tiếp hợp, yếu tố di động (MGEs) gen khác Màu xanh lam cho trình tự theo hướng màu đỏ cho trình tự theo hướng ngược lại 16 Hình 3.29 So sánh plasmid IncHI2 mang mcr-9 chủng Enterobacter hormaechei vùng xung quanh gen mcr-9 Hình 3.30 So sánh cấu trúc di truyền xung quanh cụm gen tmexCD1-toprJ1 17 Chƣơng BÀN LUẬN 4.1 Đặc điểm kháng kháng sinh Enterobacteriaceae Nhiễm khuẩn bệnh viện thách thức, mối lo ngại điều trị, đặc biệt ngày gia tăng chủng đa kháng thuốc, toàn kháng Kết nghiên cứu cho thấy E coli, K pneumoniae nguyên họ Enterobacteriaceae gây nhiễm khuẩn bệnh viện Kết phù hợp với kết nhiều nghiên cứu giai đoạn địa điểm khác Việt Nam giới [7], [8] Điều vi khuẩn có khả thích nghi, tồn tốt môi trường bệnh viện Trong nghiên cứu chúng tôi, mức độ kháng thuốc E coli, K pneumoniae phân lập cao so với kết thu từ nhiều nghiên cứu khác, đặc biệt từ quốc gia phát triển [10], [11], [12], [13], [14], [15] Đáng nói dù E coli phân lập từ bệnh nhân,hay từ nguồn nước thải, từ cộng đồng Việt Nam thể mức độ kháng kháng sinh cao [16], [17], [18], [19], [20], [21] Điều hoàn toàn phù hợp Việt Nam điểm nóng kháng thuốc kháng sinh Việt Nam Quốc gia phát triển, có kế hoạch hành động Quốc gia giám sát kháng thuốc vi khuẩn cần khơng ngừng quan tâm, tăng cường giám sát tồn diện công tác Các nghiên cứu chuyên sâu liên quan đến kháng thuốc chế kháng thuốc, đường lây truyền chủng kháng thuốc tăng cường kiểm soát tốt nhiễm khuẩn bệnh viện, góp phần hạn chế lây lan chủng đa kháng 18 4.2 Đặc điểm gen liên quan kháng carbapenem chủng đa kháng đƣợc giải trình tự 4.2.1 Đặc điểm kiểu gen mã hóa carbapenemase Nhiễm trùng Enterobacteriaceae đa kháng thuốc kháng thuốc mở rộng vi khuẩn sinh carbapenemase (CPE) (mã hóa gen blaKPC, blaNDM blaOXA-48) dần trở nên tồi tệ trở thành thách thức lớn sức khỏe cộng đồng lựa chọn kháng sinh hạn chế tỷ lệ tử vong cao Một số đợt bùng phát CPE khiến bệnh viện sở chăm sóc sức khỏe phải chịu gánh nặng kinh tế khổng lồ cho việc khử trùng ngăn chặn lây lan chúng Theo kết nghiên cứu chúng tơi, gen mã hóa carbapenemase có tỷ lệ cao blaNDM 60,42 %, tiếp đến blaKPC (27,08%) blaOXA - 48 (12,50%) Số lượng gen mã hóa carbapenemase tăng theo thời gian có xuất gen kháng K pneumoniae Với E coli, năm 2015, 2016 chưa phát chủng mang gen kháng carbapenem, đến năm 2017 phân lập chủng E coli mang carbapenemase có chủng mang KPC-2 Năm 2018 phân lập 10 chủng có chủng mang tổ hợp gen blaNDM-5 kết hợp blaOXA-484 Năm 2017 năm số lượng K pneumoniae mang gen mã hóa kháng carbapenemase tăng đột biến Các kiện diễn phạm vi bệnh viện chứng tỏ có tích lũy gen kháng lan truyền gen kháng từ K pneumoniae sang E coli mật độ bệnh nhân đông tiếp xúc gần bệnh nhân 19 4.2.2 Đặc điểm kết hợp với gen kháng kháng sinh khác Enterobateriacae mang gen mã hóa carbapenemase Sự lây lan chủng vi khuẩn đa kháng mang nhiều gen kháng kháng sinh khác tạo thành thách thức ngày tăng kiểm soát nhiễm khuẩn Kết WGS từ chủng nghiên cứu cho thấy chủng đa kháng mang kết hợp nhiều gen kháng kháng kháng sinh khác Mỗi nhóm kháng sinh bị kháng nhiều biến thể, gen khác Sự kết hợp nhiều gen kháng vi khuẩn gặp chủng kháng nhạy carbapenem, nhiên chủng có gen mã hóa carbapenemase kết hợp với đa dạng gen kháng Điều nói lên mức độ nguy hiểm, khó khăn điều trị khả kháng kháng sinh chủng Mặc dù chưa xuất chủng mang gen kháng đồng thời carbapenem, colistin tigecyline nghiên cứu đặc điểm gen nằm plasmid nên khả lan truyền, tổ hợp tính kháng chủng vi khuẩn để tạo chủng tồn kháng điều hồn tồn xảy tương lai gần Điều đỏi hỏi phải có theo dõi, giám sát thường xuyên mức độ kháng, khả lan truyền gen đề kháng vi khuẩn 4.2.3 Đặc điểm số loại plasmid mang gen kháng kháng sinh Trong nghiên cứu này, gen mã hóa carbapenemase bla NDM chiếm tỷ lệ cao chúng tơi thực phân tích di truyền tồn diện plasmid mang gen blaNDM Giải trình tự 12 plasmid mang blaNDM-1 từ K pneumoniae (ST11, ST395 ST656), E coli (ST405), C freundii, M morganii P mirabilis Kết quarchir plasmid gần giống mang blaNDM-1 loài vi khuẩn khác nhau, plasmid mang đồng thời gen 20 mã hóa kháng kháng sinh khác ESBL, gen mã hóa kháng Do đó, lan truyền gen kháng qua plasmid gây nên gia tăng tính kháng thuốc đe dọa cho sức khỏe cộng đồng Plasmid lai IncFII(pSE11)::IncN pMH13-009N_1 pMH16- 367M_1 tìm thấy P mirabilis M morganii gần giống hệt bao gồm tập hợp gen T4SS liên hợp với plasmid S enterica phân lập Hoa Kỳ Các plasmid IncN phổ biến hệ vi sinh động vật mang gen kháng phổ biến blaCTX-M-1 qnr [22], cho thấy plasmid IncN có nguồn gốc P mirabilis pMH13-009N_1 M morganii pMH16-367M_1 phổ biến cộng đồng, bao gồm người, động vật môi trường Việt Nam nước khác Hai chủng K pneumoniae kháng tigecycline (MH15-269M MH15-274M) phân lập từ bệnh phẩm máu bệnh nhân khác nhập viện khoa phòng khác vào thời điểm khác Hai chủng K pneumoniae thuộc sequence type (ST273) dựa kết phân tích trình tự đa locus (MLST) Chủng K pneumoniae ST273 sinh KPC -2 công bố phát Nga, từ bệnh nhân có tiền sử du lịch đến Việt Nam Như chủng K pneumoniae ST273 sinh KPC -2 phân lập có nguồn gốc từ Việt Nam chủng lan rộng theo đường xuất nhập cảnh từ quốc gia đến quốc gia khác Hiện nay, K pneumoniae ST273 phân lập từ khắp nơi giới, kiểu gen có liên quan chặt chẽ với kiểu hình kháng đa thuốc, bao gồm kháng carbapenem [23], [24], [25] Điều chứng tỏ chủng mang gen kháng thuốc bên cạnh gia tăng tính kháng thuốc xuất gen kháng chúng cịn ln có khả lan rộng nhanh chóng 21 Kết giải trình tự tồn cho thấy xuất biến thể gen mã hóa kháng colistin mcr -9 từ chủng MH17-539M Enterobacter hormaechei Chủng kháng với carbapenem nhiên khơng mang gen mã hóa carbapenemase Mcr - nằm plasmid 289,3-kb IncHI2 với gen kháng khác qnrA1, yếu tố di động (Hình 3.26) Điều đáng lo ngại loại plasmid IncHI2 mang mcr-9 gần công nhận 'siêu plasmid' liên quan đến việc vận chuyển gen kháng [26] Như vậy, plasmid IncHI2 mang mcr-9 liên quan đến kháng kháng sinh đặc trưng nghiên cứu có lẽ lan rộng Việt Nam cần tăng cường biện pháp giám sát kháng thuốc thường xuyên 22 KẾT LUẬN Đặc điểm kháng kháng sinh Enterobacteriaceae phân bố Enterobacteriaceae sinh carbapenemase Từ 1236 chủng Enterobacteriaceae phân lập Bệnh 103 rút kết luận sau: - Enterobacteriaceae có tỷ lệ cao nhất: E coli K pneumoniae E coli có tỷ lệ kháng cao với cephalosporin hệ 3,4; từ 30,47% đến 69,35% kháng sinh nhóm quinolone từ 63,25% đến 72,94%, xu hướng tăng dần theo thời gian; tỷ lệ kháng 10% với kháng sinh nhóm carbapenem (từ 3,20% đến 4,88%), amikacin (4,18%), nitrofuration (4,60%) - K pneumoniae có tỷ lệ kháng cao với hầu hết kháng sinh, tỷ lệ kháng với kháng sinh carbapenem từ 20,86% đến 27,91% - Các vi khuẩn E coli đa kháng có xu hướng chuyển dịch tính kháng từ MDR sang XDR PDR với tỷ lệ đa kháng giảm từ 55,56% (2015) đến 48,96% (2019) tỷ lệ kháng mở rộng tăng từ 44,44% (2015) đến 51,04% (2019) Kết tương tự với K pneumoniae với tỷ lệ đa kháng giảm từ 23,33% (2015) đến 16,28% (2019) tỷ lệ kháng mở rộng tăng từ 76,67% (2015) đến 83,72% (2019) - CRE sinh carbapenemase với tỷ lệ 69,75% K pneumoniae, E coli kháng carbapenem có tỷ lệ sinh carbapenemase 80,21% 72,73% - Tỷ lệ vi khuẩn sinh carbapenemase phân lập cao khoa hồi sức với tỷ lệ 21,37%) (p < 0,0001) - Bệnh phẩm phân lập vi khuẩn sinh carbapenemase với tỷ lệ cao bệnh phẩm hô hấp với tỷ lệ 22,98% (p < 0,0001) 23 Đặc điểm gen liên quan kháng carbapenem số Enterobacteriaceae Bằng kỹ thuật giải trình tự tồn bệ hệ gen 174 chủng Enterobacteriaceae phân lập cho thấy: - Gen mã hóa carbapenemase phân lập nhiều blaNDM (60,42%), tiếp đến blaKPC (27,08%) blaOXA 48 (12,50%) - Có xuất tổ hợp gen mã hóa carbapenemase theo thời gian E coli mang gen kháng carbapenem xuất từ năm 2017 - 100% chủng K pneumoniaae mang gen mã hóa carbapenemase có mang kết hợp gen mã hóa kháng kháng sinh amikacin Tỷ lệ kháng vi khuẩn với amikacin 16,67% (10/60) - K pneumoniae mang gen mã hóa carbapenemase kháng cao với kháng sinh meropenem, imipenem, doripenem với tỷ lệ MIC ≥ 32 35,0%, 30,0% 38,33% - Có kết hợp nhiều loại gen kháng nhóm kháng sinh khác nhau, loại plasmid mang gen kháng khác Enterobateriaceae - Một kiểu gen kháng thuộc nhiều loại ST đồng thời loại ST mang đa dạng kiểu gen kháng Có tương đồng ST chủng có mang khơng mang gen mã hóa carbapenemase, chủng phân lập thời điểm khác nhau, khoa phòng khác bệnh viện - Các chủng mang gen kháng carbapenem phân lập nghiên cứu có mối quan hệ gần gũi với chủng phân lập từ nhiều vùng địa lý khác giới - Các gen kháng carbapenem xác định nằm plasmid, plasmid mang đồng thời gen kháng khác ESBL, gen kháng aminoglycoside, gen kháng quinolone 24 - KIẾN NGHỊ Do vi khuẩn liên tục biến đổi thu nạp gen kháng thuốc nên việc nghiên cứu giám sát mức độ kháng thuốc chế kháng thuốc, lan truyền gen kháng cần thường xuyên liên tục hàng năm để kịp thời phát gen kháng mới, hạn chế lây lan chủng đa kháng - Điều trị, quản lý sử dụng kháng sinh theo chế kháng kháng sinh vi khuẩn - Nghiên cứu, điều tra nguồn gốc phát sinh chủng kháng theo chế mơi trường bệnh viện, ngồi cộng đồng DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN Van Thi Thu Ha, Linh Dieu Tran, Nguyen Thi Tuyet Mai, Aki Hirabayashi, Son Thai Nguyen, Hoang Huy Tran, Keigo Shibayama, Masato Suzuki (2021), The potential spread of mcr-9–carrying IncHI2 plasmids in Enterobacter hormaechei in Vietnam Journal of Global Antimicrobial Resistance, https://doi.org/10.1016/j.jgar.2021.09.012 Ha Thi Thu Van, Hoang Xuan Quang, Vo Thi Bich Thuy, Nguyen Thai Son (2020), The Five Years Surveillance and Trends of Antibiotic Resistance in Some Common Gram Negative Bacteria at the Vietnam Military Hospital Advances in Microbiology, Vol.10 No.12, December 2020 Aki Hirabayashi1 , Koji Yahara1 , Satomi Mitsuhashi2Ôa , So NakagawaID2 , Tadashi ImanishiID2 , Van Thi Thu Ha, An Van Nguyen3Ôb , Son Thai NguyenID3 , Keigo Shibayama4 *, Masato SuzukiID1 * (2021), Plasmid analysis of NDM metallo-βlactamase-producing Enterobacterales isolated in Vietnam PLoS ONE 16(7): https://doi.org/10.1371/journal.pone.0231119 Aki Hirabayashi, Van Thi Thu Ha, Son thai Nguyen, , Keigo Shibayama, Masato Suzuki (2021), Emergence of a plasmid-borne tigecycline resistance in Klebsiella pneumoniae in Vietnam Journal of Medical Microbiology 2021 Mar;70(3) https://doi.org/10.1099/jmm.0.001320 Hà Thị Thu Vân, Nguyễn Thái Sơn (2021), Đặc điểm phân bố vi khuẩn Enterobacterales kháng carbapenem mang gen mã hóa carbapenemase Bệnh viện Quân y 103 (2015 - 2019), tạp chí Y dược học Quân số 7: 16-24