Đặt vấn đềTrong nhiều nghiên cứu, việc sử dụng các biến thể khác nhau của Phản ứng chuỗipolymerase PCR để phát hiện sự hiện diện của một trình tự cụ thể trong một mẫu là mộtphần quan trọ
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu
Sự dụng các trang web sau:
- Trang web NCBI: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
- Trang web Primer3: https://primer3.ut.ee/
- Trang web In silico PCR amplification: http://insilico.ehu.es/PCR/
Các bước tiến hành
Bước 1: Truy cập NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), nhập tên loài Novosphingobium aromaticivorans và tìm kiếm.
Bước 2: Chọn đối tượng là Proteins.
Bước 3: Danh sách Hypothetical của loài được đề xuất, lựa chọn những đối tượng có độ dài trình tự Protein từ 80 đến 200 amino acid tại Sequence length.
Bước 4: Thông tin Hypothetical của loài được chọn, chọn Run BLAST.
Hình 3.3 Danh sách Hypothetical loài có từ 80 đến 200 amino acid.
Bước 5: Tiếp tục nhấn vào BLAST để tiến hành BLAST thông tin loài.
Bước 6: Kết quả BLAST của loài được đề xuất, chọn loài có Per Ident 100%, nhấn Accession.
Bước 7: Chọn Identical Proteins (thay đổi)
Bước 8: Tại CDS Region in Nucleotide, chọn dấu (-) (thay đổ)
Hình 3.8 Chọn CDS Region in Nucleotide của loài (-).
Bước 9: Thông tin trình tự đoạn nucleotides của loài xuất hiện, chọn FASTA (thay đổi)
Bước 10: Sao chép toàn bộ trình tự chuỗi nucleotide của loài (thay đổi)
Hình 3.9 Thông tin trình tự đoạn nucleotides của loài.
Hình 3.10 Sao chép đoạn nucleotides của loài.
Bước 11: Truy cập trang web Primer3 (https://primer3.ut.ee/) và dán trình tự nucleotide vào ô, chọn Pick Primers.
Bước 12: Xuất hiện những thông số về nhiệt độ, % GC, và cặp primer ưu tiên,
Hình 3.11 Truy cập trang web Primer3.
Hình 3.12 Đề xuất cặp Primer ưu tiên.
Bước 13: Truy cập trang web In Silico (http://insilico.ehu.es/PCR/), chọn loài
Bước 14: Nhập 2 đoạn primer được đề xuất bên primer3 vào ô primer 1 và primer 2, tại Migroorganism chọn APPLY TO ALL, nhấn Amplify.
Hình 3.13 Truy cập trang web In Silico.
Bước 15: Kết quả In Silico đề xuất (thay đổi)
Hình 3.15 Kết quả điện di trên In Silico.
Bước 16: Sao chép đoạn 2 đoạn primer tại In Silico và truy cập vào trang web Primers BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi) dán 2 đoạn primer vào ô.
Bước 17: Tại Primer Pair Specificity Checking Parameters, mục Database chọn nr , mục Organism xóa bỏ Homo sapiens và ấn vào GET PRIMER và chờ kết quả.
Hình 3.16 Truy cập Primers BLAST.
Hình 3.17 Tiến hành Get Primers.
Các cặp primer tìm được
>CP000248.1:c821043-820417 Novosphingobium aromaticivorans DSM 12444, complete genome
GTGCTTGGCGTGTGCATCAGGATGAGGGGACTGGCGGGAGCCTTGGGCACCGCTTGGCTTCTTGCGGC TGCACCAGCCTGCGCCCAGGCGCTTTCGGCGACCGTATATGCGCCAGGGGATGGAGCGCCCAATTCGC TTACATTTACAGTTCCGGTGACTGCATCGATTGGCGGCATCTGCGGCTTTGCGACCGCTCCTAGCGGCA ATTACGACGCTGGCGCTCTGGACACGAATACCTGGACCAACGACTTCGCGTTCAAGTTGAACTGCACC GTTCCGTCTCGTGTCGCCGTGGTCTCTTCCAATGGTGGCCTGTTGACGCCGGCAGCGCCCGGAGCGCCC GGTTACACCAACAAGGCGCCCTATACGGTGACCTTGAAGCTGCAGGGTTCGTCCACTTCGGCAATGGC CAACTGCCCGGCGGCAGACCTTTCGCCCACGGCAGCGAACCCTTGCTCATTTCGTGGGGCATCGTCGTC CACGCAGGGGCTACGGCTCGACGATACGTCGATCAACGTCGACGGCTCATATCTTCGCGTCAATGCGC CGGCCTATTCGGGGGCCGATGCCCTGATCAACGGAAATTACACTGACACTCTGACGGTTACGGTTTCGGCTTCGCC CTGA
Hình 3.18 FASTA của loài cần tìm.
Vào in silico PCR Amplification và dán cặp primer vào tại Migroorganism chọn APPLY TO ALL Novosphingobium -> Amplify
Hình 3.19 Dán cặp primer vào In Silico PCR Amplification.
Thu được kết quả như sau với band ở mức 248 bp phù hợp với yêu cầu của giáo viên
Hình 3.20 Kết quả thu được ở band 248.
Sau đó vào copy đoạn primer vào Primer BLAST để chạy kiểm tra trên tất cả các loài
Hình 3.21 Chạy kiểm tra trên tất cả các loài.
Hình 3.22 Kết quả thu được.
Hình 3.23 Chạy kiểm tra trên Novosphingobium.
Hình 3.24 Kết quả thu được.
Hình 3.25 Chạy kiểm tra trên Bacteria.
Hình 3.26 Kết quả thu được.
Sau khi chạy trên các các loài trên và chỉ cho ra một loài đó là Novosphingobium aromaticivorans DSM 12444
>CP000248.1:3199831-3200304 Novosphingobium aromaticivorans DSM 12444, complete genome
ATGCCGCGCGGTCTCAATTCTCCGCTGATCTTTCCAGGCTGTCTGAATGTGATGCGGGCCAAGAAGATTG GGCGCATGGTAGAGGGATGCACCCCGCCCTTGCACTGGCCGAAGCAGCCCTTCGCGCAAAGGAGGCCGGA AATGGCTGATGATCTGGTGGGCGGAATCGTCTGCAACGGCTGCTGGGAGACCTGCGCTCATGCGCCGGGG ATCGGATATTACTGTCGAAATGAAGGCTGCACGTATGAGTATAATAGGGCGAAGGCCATGCTTTGGCACA TGCGGCCTGTTGAACCACGAGACGCCCGCATCGAAGCGCTCGAAGCCGCGCTGGCAGAGGCAAGGCGTAC AGCCCTGACCGAATGCCTCCGCATCGCCAAGGCGGCGCAATACAGCAAGGCACCAGCCACTGACACCATG CGCGGCATTCAGAAGCTGATAGAGGATTCCCCTACGCCCCCGCCTGTGGTATAG
Cần kiểm tra 2 cặp primer trên như sau
Vào in silico PCR Amplification và dán cặp primer vào tại Migroorganism chọn APPLY TO ALL Novosphingobium -> Amplify
Hình 3.28 Dán cặp primer vào In Silico PCR Amplification.
Thu được kết quả như sau với band ở mức 224 bp phù hợp với yêu cầu của giáo viên
Hình 3.29 Kết quả thu được ở band 224.
Sau đó vào copy đoạn primer và vào Primer BLAST để chạy kiểm tra trên tất cả các loài
Hình 3.30 Chạy kiểm tra trên tất cả các loài.
Hình 3.31 Kết quả thu được.
Hình 3.32 Chạy kiểm tra trên Novosphingobium.
Hình 3.33 Kết quả thu được.
Hình 3.34 Chạy kiểm tra trên Bacteria
Hình 3.35 Kết quả thu được.
Sau khi Primer BLAST trên các các loài trên và chỉ cho ra một loài đó là Novosphingobium aromaticivorans DSM 12444
>CP000248.1:3199831-3200304 Novosphingobium aromaticivorans DSM 12444, complete genome
ATGCCGCGCGGTCTCAATTCTCCGCTGATCTTTCCAGGCTGTCTGAATGTGATGCGGGCCAAGAAGATTG GGCGCATGGTAGAGGGATGCACCCCGCCCTTGCACTGGCCGAAGCAGCCCTTCGCGCAAAGGAGGCCGGA AATGGCTGATGATCTGGTGGGCGGAATCGTCTGCAACGGCTGCTGGGAGACCTGCGCTCATGCGCCGGGG ATCGGATATTACTGTCGAAATGAAGGCTGCACGTATGAGTATAATAGGGCGAAGGCCATGCTTTGGCACA TGCGGCCTGTTGAACCACGAGACGCCCGCATCGAAGCGCTCGAAGCCGCGCTGGCAGAGGCAAGGCGTAC AGCCCTGACCGAATGCCTCCGCATCGCCAAGGCGGCGCAATACAGCAAGGCACCAGCCACTGACACCATG CGCGGCATTCAGAAGCTGATAGAGGATTCCCCTACGCCCCCGCCTGTGGTATAG
Cần kiểm tra 2 cặp primer trên như sau Vào in silico PCR Amplification và dán cặp primer vào tại Migroorganism chọn APPLY TO ALL Novosphingobium -> Amplify
Hình 3.37 Dán cặp primer vào In Silico PCR Amplification.
Thu được kết quả như sau với band ở mức 232 bp phù hợp với yêu cầu của giáo viên
Hình 3.38 Kết quả thu được ở band 232.
Sau đó vào copy đoạn primer vào Primer BLAST để chạy kiểm tra trên tất cả các loài
Hình 3.39 Chạy kiểm tra trên tất cả các loài.
Hình 3.40 Kết quả thu được.
Hình 3.41 Chạy kiểm tra trên Novosphingobium.
Hình 3.42 Kết quả thu được.
Hình 3.43 Chạy kiểm tra trên Bacteria.
Hình 3.44 Kết quả thu được.
Sau khi Primer BLAST trên các các loài trên và chỉ cho ra một loài đó là
Cả 3 cặp primer đều bắt cặp với Novosphingobium aromaticivorans DSM 12444 sau khi BLAST primer và chỉ cho kết quả 1 loài là Novosphingobium aromaticivorans DSM 12444 Tuy nhiên, vẫn còn nhiều phần mền kiểm tra độ chuyên biệt của primer nên cũng rất có thể 3 cặp primer nó sẽ không chuyên biệt đối với Novosphingobium aromaticivorans DSM 12444 khi ta kiểm tra cặp primer trên phần mền khác.
