Tổng quan về các phương pháp được sử dụng để chiết xuất sericin từ vỏ kén tằm Su-Jin và cộng sự, 2023 .... xxi TÓM TẮT KHÓA LUẬN Khóa luận nghiên cứu khảo sát trích ly protein sericin từ
TỔNG QUAN
Tổng quan về kén tằm
Kén tằm là một loại polymer tự nhiên có bản chất là protein, được tạo ra trong các tuyến tơ của tằm ở độ tưởi thứ năm (tức là tằm đã phát triển qua năm lần lột xác) và sẽ được lưu trữ trong các túi lumen cho đến khi con tằm tiết ra thông qua việc kết kén làm tổ (Mondal và cộng sự, 2007)
Trên thế giới, tơ tằm tự nhiên được biết đến và sản xuất từ nhiều loài tằm khác nhau như: Bombyx mori L (thuộc họ Bombycidae), Antheraea assamensis, antheraea mylitta, Antheraea paphia, Samia cynthia ricini (thuộc họ Saturniidae), … (Valerie H và cộng sự,
2015) Trong số đó tơ tằm Bombyx mori L được biết đến rộng rãi nhất và đóng góp tới 90% sản lượng lụa thế giới (Valerie H và cộng sự, 2015)
Hình 2.1 Kén tằm Bombyx mori L từ Nam Định
2.1.2 Đặc điểm và phân bố
Tằm ở Việt Nam chủ yếu được nuôi trồng ở các tỉnh Lâm Đồng Thái Nguyên, Đắk Lắk, Nam Định… Các tỉnh này đều nằm ở khu vực có địa hình, khí hậu, độ ẩm thích hợp cho việc trồng dâu nuôi tằm Cây dâu là loại cây sinh trưởng tốt Sau 4-6 tháng có thể thu hoạch lá Tằm lại là sinh vật dễ nuôi, thời gian nuôi ngắn nên có thể nuôi được nhiều vụ trong năm
Kén tằm không chỉ giúp gia tăng kinh tế mà còn có giá trị sinh học cao Việc nuôi tằm có chi phí dầu tư và sản xuất thấp, đồng thời tậ dụng được nguồn nhân lực dồi dào, mọi người ai cũng có thể tham gia vào các công đoạn được
2.1.3 Thành phần hóa học của kén tằm
Kén Bombyx mori là một lớp vỏ polymer phức hợp tự nhiên được tạo ra từ một sợi tơ liên tục duy nhất có chiều dài từ 1000 đến 1500 mét và được liên kết bởi sericin Mỗi sợi được cấu tạo bởi các sợi kép được bao bọc bởi một lớp phủ sericin Kén được tạo thành từ một cấu trúc không dệt ba chiều (3-D) bao gồm nhiều lớp Sericin đóng vai trò là chất kết dính các sợi ngẫu nhiên và cấu trúc nhiều lớp trong toàn bộ kén Hầu hết các kén không dệt khác đều có tiết diện là hình elip, sợi kén Bombyx mori có tiết diện là hình tam giác (Chen và cộng sự, 2012)
Kén tằm được cấu tạo bởi hai thành phần chính bao gồm fibroin và sericin Fibroin trong tơ tằm tồn tại ở dạng hai sợi dài song song được liên kết với nhau bằng liên kết disulfide và được bao phủ bởi chất keo sericin Fibroin có các miền vô định hình và kết tinh với các chuỗi acid amin ngắn cho phép nó duy trì cấu trúc nhỏ gọn (Koh và cộng sự, 2015) Sericin là một protein hoạt động như một chất kết dính để duy trì tính toàn vẹn cấu trúc của sợi và kén Sericin có tính hòa tan, cho phép loại bỏ nó dễ dàng khỏi kén B mori bằng cách sử dụng quy trình nhiệt hóa học được gọi là khử keo Hình 2.2 cho thấy một tập hợp các thứ bậc về cấu trúc kén B mori, từ kén bình thường đến tổ hợp sợi sericin riêng lẻ, từ đó thấy rằng kén có cấu trúc hỗn hợp không dệt (Chen và cộng sự, 2012)
Hình 2.2 Phân cấp hình thái của kén Bombyx mori với tỷ lệ từ trái sang phải: 1 cm,
Kén tằm B mori bao gồm nhiều loại thành phần hóa học khác nhau, chủ yếu là fibroin (70 – 80 %) và sericin (20 – 30 %), cũng như các chất khác như: carbohydrate (1.2 – 1.6 %), chất vô cơ (0.6 – 0.7 %), chất sáp (0.4 – 0.8 %) và chất màu (0.2 – 0.3 %) (Ahsan và cộng sự, 2018; Hurst, 1892) Dư lượng acid amin được tìm thấy trong protein tơ tằm có thể được chia thành ba loại dựa trên chức năng của chúng bao gồm acid amin tích điện (acid aspartic), acid amin phân cực (serine) và kỵ nước (glycine)
2.1.4 Đặc tính sinh học của kén tằm
Những năm gần đây, người ta đặc biệt quan tâm đến các đặc điểm sinh học của kén tằm, cụ thể là thành phần protein chính của nó: fibroin và sericin Các tác dụng dược lý khác nhau của kén tằm và các thành phần của nó, bao gồm bảo vệ tim mạch, chống oxy hóa, chống ung thư, trị đái tháo đường, hạ đường huyết, bảo vệ dạ dày và cải thiện làn da, đã được chứng minh trong các tài liệu khoa học (Biganeh và cộng sự, 2022) Hơn nữa, độc tính của nó nằm trong phạm vi chấp nhận được.
Tổng quan về sericin
Sericin là một polymer tự nhiên có trong vỏ kén tằm B mori, chiếm khoảng 20 - 30 % khối lượng kén, có tác dụng liên kết với các phân tử fibroin bằng liên kết hydro Sericin chủ yếu ở dạng vô định hình và có dạng keo giúp hình thành và duy trì cấu trúc của kén (Ho và cộng sự, 2012) Sericin cũng là một protein cao phân tử có tính ưa nước, dễ tan trong nước nóng, có thể dễ dàng loại bỏ khỏi fibroin thông qua quá trình khử keo (Zurovec và cộng sự, 1998) Hình 2.3 minh họa cấu trúc hóa học của sợi tơ và các liên kết hydro liên phân tử giữa fibroin và sericin (Lee và cộng sự, 2004) Fibroin đóng vai trò là lõi bên trong và mang lại độ bền cơ học cho sợi, trong khi sericin là lớp phủ giống như lớp keo bên ngoài Mỗi sợi tơ chứa hai sợi fibroin được phủ sericin Cả fibroin và sericin đều được cấu thành bởi một chuỗi acid amin lặp đi lặp lại có khả năng hình thành cấu trúc tấm β
Hình 2.3 Cấu trúc hóa học của sericin tơ tằm thể hiện các liên kết hydro liên phân tử giữa fibroin và sericin (Lee và cộng sự, 2004) Độ hòa tan trong nước của sericin bị ảnh hưởng bởi vị trí của nó trong sợi tơ, sericin nằm ở lớp ngoài của sợi dễ hòa tan nhất trong nước ấm (α-sericin); trong khi sericin nằm ở lớp bên trong của sợi (cạnh fibroin) lại không hòa tan trong nước nóng (β-sericin) (Mondal và cộng sự, 2007)
Quá trình tạo gel của sericin có thể thực hiện được nhờ sự chuyển đổi cuộn ngẫu nhiên thành cấu trúc β Tuy nhiên, ở nhiệt độ thấp (10 °C, pH khoảng 6–7), cấu trúc này chuyển thành cấu trúc tấm β tạo điều kiện thuận lợi cho việc hình thành mạng ba chiều và thúc đẩy
6 sự hình thành gel sericin (Zhu và cộng sự, 1995; Hirabayashi và cộng sự, 1989; Padamwar và cộng sự, 2004) Hiện tượng này có thể đảo ngược khi mẫu được gia nhiệt (50–60 °C) (Zhu và cộng sự, 1995; Hirabayashi và cộng sự, 1989; Padamwar và cộng sự, 2004) Mặt khác, quá trình tạo gel của sericin cũng có thể được diễn ra nhờ vào liên kết ngang hóa học, dẫn đến sự hình thành cấu trúc tấm β ổn định
Cấu trúc của sericin phụ thuộc vào giống và phương pháp được sử dụng để chiết xuất Theo nghiên cứu của Kumar và cộng sự (2017) cho thấy phương pháp chiết xuất urea sẽ có tỷ lệ β-sheet và xoắn ngẫu nhiên cao như nhau Nếu chiết xuất sericin từ dung dịch acid thì tỷ lệ xoắn α cao hơn so với chiết xuất bằng urea Phương pháp tách chiết bằng dung dịch kiềm cho thấy sự hiện diện của α-helix, xoắn và xoắn ngẫu nhiên Ngược lại, phương pháp chiết chuất bằng nồi hấp tiệt trùng (nhiệt) thì sericin thiếu cấu trúc xoắn ốc (Bảng 2.1.)
Bảng 2.1 Tỷ lệ (%) cấu trúc bậc hai của sericin từ B mori được chiết xuất bằng các phương pháp khác nhau (Kumar và cộng sự, 2017)
Cấu trúc thứ cấp (%) α-helix β-sheet Turns Xoắn ngẫu nhiên
Sericin được chiết xuất bằng các phương pháp khác nhau có trọng lượng phân tử khác nhau dẫn đến các đặc tính hóa học và sinh học khác nhau Sericin thu được từ tất cả các phương pháp chiết đều thể hiện giá trị thế Zeta âm Thế Zeta là hiệu điện thế giữa môi trường phân tán và lớp chất lỏng đứng yên gắn với hạt phân tán Độ lớn của điện thế zeta cho thấy dấu hiệu về độ ổn định tiềm năng của hệ thống, trong đó điện thế zeta cao (âm hoặc dương) biểu thị các hạt ổn định về điện, trong khi các chất keo có điện thế zeta thấp có xu hướng đông tụ (Aramwit và cộng sự, 2010) Sự khác biệt về trọng lượng phân tử, điện thế Zeta và kích thước trung bình của sericin được thể hiện ở Bảng 2.2
Bảng 2.2 Trọng lượng phân tử, điện thế Zeta và kích thước trung bình của sericin từ các phương pháp tách chiết khác nhau (Aramwit và cộng sự, 2010) Điều kiện tách chiết
Trọng lượng phân tử (kDa) Điện thế Zeta (mV)
2.2.1 Thành phần hóa học của sericin
Sericin là một protein cao phân tử có tính ưa nước cao bao gồm 18 loại amino acid với acid amin hydroxyl (serine và threonine) chiếm 45.8 %; acid amin phân cực chiếm 42.3 % và 12.2 % còn lại là acid amin không phân cực (Takasu và cộng sự, 2002; Barajas-Gamboa và cộng sự, 2016) Trong đó, thành phần acid amin chủ yếu của sercin là serine (40 %), glycine (16 %), acid glutamic, acid aspartic, threonine và tyrosine… (Takasu và cộng sự, 2002) Tuy nhiên, tỷ lệ hàm lượng acid amin có thể thay đổi tùy thuộc vào các phương pháp chiết khác nhau như được trình bày trong Bảng 2.3
Bảng 2.3 Thành phần acid amin của sericin được chiết bằng các phương pháp khác nhau
Với sự có mặt của các acid amin phân cực, sericin được phân thành ba loại dựa trên khả năng hòa tan của chúng: sericin A, sericin B và sericin C Sericin A nằm ở lớp ngoài, có thể tan trong nước nóng, có hàm lượng nitơ khoảng 17.2 % và chứa các hợp chất acid amin ở nồng độ cao như: serine, threonine, glycine và axit aspartic Mặt khác, sericin B nằm ở lớp giữa và có thể tan trong nước nóng, chứa hàm lượng nitơ 16.8 % và có thành phần acid amin tương tự như sericin A Đối với sericin C, nó không hòa tan trong nước cất nhiệt độ cao do nằm gần lớp fibroin Tuy nhiên, sericin C có thể được thủy phân dưới nhiệt độ cao bằng cách sử dụng dung dịch acid hoặc kiềm Sericin C chứa 16.6 % nitơ, bao gồm các axit amin tương tự như các acid amin có trong sericin B Ngoài ra, sericin C có thể tạo ra praline khi thủy phân (Shaw và cộng sự, 1951)
2.2.2 Đặc điểm và giá trị sinh học của sericin
Nhờ vào các đặc điểm cấu trúc, sericin được chứng minh là một chất có các hoạt tính sinh học như chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống elastase, chống tyrosinase, giữ ẩm,… sericin được đánh giá là nguyên liệu tiềm năng ứng dụng đa dạng, đặc biệt là trong lĩnh vực y sinh và công nghệ thực phẩm
Hoạt động chống oxy hóa của sericin có tương quan với hàm lượng serine và threonine Mặt khác, các phân tử sắc tố (flavonoid và carotenoid) tích lũy trong các lớp sericin có thể là một trong những nguyên nhân khiến sericin có đặc tính chống oxy hóa và hoạt động chống tyrosinase
Nồng độ sericin ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn gram dương (Staphylococcus aureus) và gram âm (E coli) thông qua các thí nghiệm vi sinh Thời gian khử keo càng ngắn thì sericin còn lại trên fibroin càng nhiều và do đó tơ tằm có hoạt tính kháng khuẩn chống lại vi khuẩn nhiều hơn (Senakoon và cộng sự, 2009)
Sericin khả năng bảo vệ tế bào khỏi tia cực tím vì nó có thể hấp thụ hiệu quả bức xạ cực tím (UV) và giảm stress oxy hóa (oxidative stress) cho da bằng cách duy trì cân bằng oxy hóa khử Đã có báo cáo chứng minh rằng việc cung cấp sericin từ Bombyx mori đã bảo vệ chuột cái không lông khỏi bị cháy nắng do bức xạ UVB và khởi phát khối u (Zhaorigetu và cộng sự, 2003).
Một số ứng dụng của sericin
2.3.1 Ứng dụng của sericin trong ngành công nghiệp thực phẩm
Người ta đã phát hiện ra rằng sericin tơ có chứa các acid amin thiết yếu, và nó được sử dụng như một thành phần trong các sản phẩm y tế, dược phẩm, mỹ phẩm và thực phẩm (Liu và cộng sự, 2022) Là một nguồn protein thực phẩm, nó đã được sử dụng như một chất tăng cường hương vị và kết cấu trong cháo, chất bổ sung acid amin trong đồ uống, chất chống oxy hóa ăn được trong thực phẩm béo, chất chống nâu trong các loại thực phẩm khác nhau, chất tăng cường cho sự hấp thụ khoáng chất, và như một chất bổ sung chế độ ăn uống (Ghosh và cộng sự, 2017)
Chất chống oxy hóa tổng hợp như BHT và BHA thường được sử dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm, vì chúng mạnh hơn và giá cả phải chăng hơn các chất chống oxy hóa tự nhiên (Fan và cộng sự, 2007) Tuy nhiên, điều này luôn đi kèm với sự lo lắng về việc sử dụng chất chống oxy hóa tổng hợp vì an toàn sức khỏe, do đó nguồn protein tự nhiên được ưa thích thay vì các chất chống oxy hóa tổng hợp (Fan và cộng sự, 2007) Sericin, như một protein đại phân tử tự nhiên, có các nhóm chức như Tyr, Trp, His, và Cys (Fan và cộng sự, 2007) Do xu hướng tặng hydro và tương tác, chúng tạo ra các phân tử ổn định hơn, sử dụng các gốc tự do và làm gián đoạn phản ứng dây chuyền gốc, và các nhóm chức trong acid amin làm giảm và khử màu DPPH (Rocha và cộng sự, 2017)
Sericin được sử dụng là một chất phụ gia với liệu lường 2-4 g sericin/1 kg bột để làm bánh mì có xu hướng làm giảm chiều cao và thể tích cụ thể của bánh mì, cùng với màu sắc của nó, trong khi vẫn duy trì kết cấu bề mặt bên trong đồng nhất và hương vị (Takechi và Takamura, 2014) Trong một nghiên cứu khác, Tarangini đã nghiên cứu các tính chất của vật liệu phủ lên thức ăn được dựa trên sericin về thời hạn sử dụng và chất lượng của cà chua trong thời gian bảo quản trong khoảng thời gian 40 ngày ở 25 °C và độ ẩm tương đối 70 %, và họ kết luận rằng vật liệu phủ dựa trên sericin được phát triển có thể làm giảm tổn thất về trọng lượng và độ cứng trong cà chua (Tarangini và cộng sự, 2022) Hơn nữa, với sự gia tăng thời gian bảo quản, hàm lượng axit của các mẫu cà chua tăng lên và độ pH, tổng hàm
10 lượng chất rắn hòa tan, tổng hàm lượng phenol, tổng chất chống oxy hóa và hàm lượng lycopene vẫn thấp so với cà chua không được phủ sericin (Tarangini và cộng sự, 2022)
2.3.2 Ứng dụng của sericin trong một số ngành công nghiệp khác
Bên cạnh ứng dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm, sericin còn có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực khác, được thể hiện trong Bảng 2.4 Các đặc tính của sericin như khả năng tương thích sinh học, khả năng phân hủy sinh học và độ ẩm có được sử dụng một mình hoặc kết hợp với fibroin tơ trong mỹ phẩm da, tóc và móng (Barajas và cộng sự, 2016) Khi được sử dụng trong kem dưỡng da, kem, và thuốc mỡ, sericin cải thiện độ đàn hồi của da, chống nhăn và chống lão hóa có tác dụng Bởi vì sericin hấp thụ bức xạ UV, nó có thể được sử dụng làm kem chống nắng (Goyal và Jerold, 2021) Các ứng dụng khác bao gồm các hợp chất hấp thụ mồ hôi và chất béo do da tiết ra tuyến bã nhờn Sericin có khả năng thay đổi bề mặt của sợi và hàng dệt Nó được sử dụng như một lớp phủ vật liệu cho sợi cellulose và len Các loại vải được xử lý đã chứng minh giảm hàm lượng formaldehyde tự do, kích ứng da, cải thiện khả năng giữ nước, hấp thụ nước và tăng cường kháng khuẩ, chỉ với một sự sụt giảm nhỏ về độ bền kéo dệt Đây được xem là một giải pháp tiềm năng cho các nhà máy tơ lụa để Giải quyết các vấn đề về thu hồi sericin và xử lý nước thải (Takechi và cộng sự, 2011)
Bảng 2.4 Một số ứng dụng của sericin protein (Fatahian và cộng sự, 2022)
Công nghiệp Ứng dụng Nguồn tham khảo
Làm sạch vải Cải thiện hoạt động kháng khuẩn Chế tạo sợi nano Dệt may y tế
Rangi và cộng sự (2015) Ghosh và cộng sự (2017)
Chăm sóc da: chống viêm da, chống nắng, cải thiện độ đàn hồi, chống nếp nhăn Chăm sóc tóc: ngăn ngừa hư tổn
Voegeli và cộng sự (1993) Kumar và cộng sự (2022)
Chữa lành vết thương Hoạt tính chống ung thư Khả năng chống viêm
Fakharany và cộng sự (2020) Omar và cộng sự (2020)
Một số phương pháp tách chiết sericin
Có nhiều phương pháp khác nhau để chiết xuất sericin từ kén tơ, trong đó phương pháp chiết xuất thông thường chỉ sử dụng nước nóng là rất phổ biến Nó có lợi thế là cho phép sử dụng polymer tự nhiên, mặc dù độ tinh khiết của sericin, trong trường hợp này, thấp hơn nhiều so với khi sử dụng các phương pháp chiết xuất khác (Yang và cộng sự, 2013) Một phương pháp chiết xuất sericin thông thường khác là quá trình khử trùng xà phòng-kiềm sử dụng xà phòng Marseille và các hóa chất như dung dịch natri carbonat (Na2CO3) đun sôi ở áp suất khí quyển dưới nhiệt độ cao (Silva và cộng sự, 2022) Tuy nhiên, trong quá trình này, khả năng thu hồi của sericin rất thấp, dẫn đến mất các đặc tính của sericin (Silva và cộng sự, 2022) Thông thường, quá trình đun sôi trong chiết xuất ảnh hưởng đáng kể đến cấu trúc tơ và sau thời gian đun sôi kéo dài, trọng lượng phân tử bị giảm xuống do sự phân mảnh của sericin, dẫn đến sự thoái hóa của các vùng vô định hình, bao gồm cả tính chất ưa nước của sericin (Kunz và cộng sự, 2016) Các phương pháp này có thể được chia thành ba nhóm chính: vật lý, enzyme và hóa học
Bảng 2.5 Tổng quan về các phương pháp được sử dụng để chiết xuất sericin từ vỏ kén tằm
(Su-Jin và cộng sự, 2023)
Phương pháp trích ly Cách tiếp cận Ưu điểm Nhược điểm Nguồn tham khảo
Vật lý Nước nóng Sử dụng polyme tự nhiên Độ tinh khiết của sericin thấp
Hóa học Dung dịch kiềm: Na2CO3
Năng suất cao và hoạt tính chống oxy hóa tốt
Tách các ion và phân tử trong dung dịch sericin;
Trao đổi với các ion và các phân tử khác
Lamboni và cộng sự (2015) Yun và cộng sự (2013) Fatahian và cộng sự (2017)
12 Đặc tính kiềm: xà phòng Marseille
Xà phòng là một vật liệu tự nhiên
Việc tách xà phòng Marseille khó
Lamboni và cộng sự (2015) Bungthong và cộng sự (2021)
Thu hồi sericin có độ tinh khiết cao từ kén tơ
Giảm lượng chất thải vi sinh vật
Các bước thanh lọc là cần thiết
Giá trị acid amin thiết yếu cao gấp ba lần so với phương pháp chiết xuất nước Đắt tiền
Sử dụng với số lượng lớn
Trong trường hợp quy trình chiết xuất enzyme, các acid amin, hoạt tính nhặt gốc DPPH và tổng giá trị acid amin thiết yếu thu được đối với sericin là đáng chú ý vì chúng cao gấp ba lần so với phương pháp chiết xuất nước (Bungthong và cộng sự, 2021) So với quá trình chiết xuất nước nóng, việc sử dụng enzyme protease trong quá trình chiết xuất sericin gây ra sự phá vỡ liên kết peptide trong các phân tử protein, dẫn đến acid amin tự do và peptide ngắn hơn (Bungthong và cộng sự, 2021) Tuy nhiên, cách tiếp cận này có hạn chế là tốn kém để sử dụng cho số lượng lớn (Bungthong và cộng sự, 2021) Trong trường hợp phương pháp chiết xuất hóa học, natri carbonate, ure-mercaptoethanol, urea, natri chlorua, v.v., được sử dụng, nhưng quá trình này đòi hỏi một bước tinh chế bổ sung để loại bỏ các hóa chất, và cũng khó chiết xuất sericin chất lượng cao (Lamboni và cộng sự, 2015) Trong một số trường hợp, canxi chlorua được sử dụng để thu hồi sericin có độ tinh khiết cao trong quá trình chiết xuất bằng cách tách sericin khỏi chất hoạt động bề mặt (Yang và cộng sự, 2013) Hiện nay, các phương pháp chiết xuất liên quan đến việc sử dụng natri carbonate hoặc các loại môi trường kiềm khác được sử dụng rộng rãi ở quy mô công nghiệp (Yun và cộng sự, 2013)
Tình hình nghiên cứu sericin
2.5.1 Tình hình nghiên cứu sericin ngoài nước
Vật liệu đóng gói thực phẩm tự nhiên có thể phân hủy sinh học để thay thế polyme tổng hợp đã được ghi nhận để đáp ứng mối quan tâm ngày càng tăng về ô nhiễm nhựa (Adel và cộng sự, 2019) Một nghiên cứu của Oh et al cho thấy tiềm năng sử dụng dịch trích sericin trong bao bì thực phẩm Màng sericin có liên kết ngang chặt chẽ được sử dụng để chế tạo glucose và xử lý nhiệt và do đó tăng cường khả năng hóa lý hạn chế của sericin bằng cách kích hoạt phản ứng Maillard sericin-glucose (Oh và cộng sự, 2021) Tác giả đã nghiên cứu tính ưa nước của bề mặt màng sericin bằng cách sử dụng góc tiếp xúc, được sử dụng để đánh giá tính ưa nước của bề mặt polymer (Oh và cộng sự, 2021) Tác giả tuyên bố rằng, với sự tiến triển của phản ứng liên kết ngang hóa học dựa trên phản ứng Maillard, những điểm yếu vốn có của màng sericin, chẳng hạn như tính chất cơ học và khả năng chống nước, đã được cải thiện đáng kể, và nó cũng mang lại cho màng sericin đặc tính chống tia cực tím và chống oxy hóa (Oh và cộng sự, 2021) Do đó, bằng cách áp dụng glucose để tạo ra lớp phủ sericin, quá trình oxy hóa thực phẩm có thể được kiểm soát và do đó thời hạn sử dụng có thể được kéo dài (Oh và cộng sự, 2021) Để bổ sung các tính chất cơ học của sericin, một nghiên cứu đã được thực hiện bằng cách kết hợp nó với agarose, một trong những polysacaride trung tính (Mallakpour và cộng sự, 2021) Sau khi phủ polydopamine, có đặc tính kết dính với tính chất bề mặt, các hạt nano
Ag / ZnO đã được thu giữ để cải thiện hoạt tính kháng khuẩn (Li và cộng sự, 2020) Kết quả là, lớp phủ đã chuẩn bị cho thấy hoạt tính kháng khuẩn tuyệt vời chống lại vi khuẩn Gram âm E coli và vi khuẩn Gram dương S aureus (Mallakpour và cộng sự, 2021) Do đó, sự liên kết của màng sericin / agarose với Ag / ZnO không chỉ cải thiện tính chất cơ học của sericin mà còn mang lại hiệu suất kháng khuẩn Màng có những đặc điểm này làm vật liệu polymer cho thấy tiềm năng sử dụng trong việc bao phủ các bề mặt khác để tiêu diệt vi sinh vật (Mallakpour và cộng sự, 2021)
Trong một nghiên cứu khác của Silva và cộng sự, các tác giả đã chứng minh các phương pháp chiết xuất khác nhau ảnh hưởng đến axit amin và thành phần nhóm chức năng của sericin (Silva và cộng sự, 2022) Hàm lượng tyrosine trong sericin thấp hơn đáng kể khi chiết xuất bằng phương pháp chiết xuất urê so với khi sử dụng các phương pháp khác và hàm lượng các chất chuyển hóa thứ cấp và các nhóm chức năng, chẳng hạn như phenol và flavonoid, có trong sericin cũng khác nhau đối với các phương pháp chiết xuất khác nhau
(Silva và cộng sự, 2022) Tổng hàm lượng phenol được tìm thấy cao hơn khi sericin được chiết xuất bằng phương pháp nhiệt (nước nóng) và thấp hơn khi sericin được chiết xuất bằng dung dịch urê (Kumar và cộng sự, 2017) Tương tự, sericin được trích ly bằng axit mang lại tổng hàm lượng flavonoid cao hơn phương pháp trích ly bằng kiềm (Kumar và cộng sự, 2017)
2.5.2 Tình hình nghiên cứu sericin trong nước
Từ trước đến nay, các nghiên cứu trong ngành dâu tằm Việt Nam chủ yếu tập trung vào trồng dâu, nuôi tằm lấy kén để sản xuất tơ, lụa Trong quá trình xử lý tơ lụa cho mềm mại, phương pháp tẩy chuội bớt sericin hiện đang được sử dụng trong sản xuất là đun cùng với nước nóng có bổ sung muối Na2CO3 hoặc xà phòng trung tính Tuy nhiên, các phương pháp này đều nhằm loại bớt sericin chứ không thu lại để sử dụng Kỹ thuật tách chiết protein sericin cũng đã được Trần Bích Lam và Vương Bảo Thy (2003) nghiên cứu để chế tạo màng polyme nhưng từ từ tuyến của tơ tằm Phương pháp tổng hợp sử dụng enzyme cần thời gian khá dài, kỹ thuật phức tạp, thời điểm tằm chín để lấy tuyến tơ rất ngắn nên khó áp dụng trên quy mô công nghiệp Vì sericin và fibroin là cơ sở cho các ứng dụng, đặc biệt là chế biến các sản phẩm giá trị gia tăng cao nên cần tiếp tục nghiên cứu và nên thực hiện trên kén tằm là sản phẩm nông nghiệp có sẵn trên thị trường, vừa giúp ích được cho nông dân và góp phần thúc đẩy nghề dâu tằm phát triển Tác giả Lê Hồng Vân và cộng sự về Nghiên cứu tách chiết protein sericin từ vỏ kén tằm đã nghiên cứu kết quả tách chiết sericin và fibroin thông qua ba phương pháp: dùng muối Na2CO3, sử dụng xà phòng trung tính và phương pháp nhiệt độ cao, áp suất cao Đã nghiên cứu tách chiết được sericin, fibroin là các protein từ tơ tăm và chế biến thành bột để thuận tiện trong quá trình bảo quản Bột sericin và fibroin có độ tinh khiết cao, dễ hòa tan trong nước có thể dùng cho các ứng dụng trong ngành công nghiệp mỹ phẩm hay thực phẩm (Lê và cộng sự, 2022) Tuy nhiên, hiện nay chưa có nghiên cứu nào trong nước đi sâu vào nghiên cứu khả năng chống oxy hóa hay hoạt tính kháng khuẩn của sericin
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu
Nguyên liệu chính sử dụng là vỏ kén tằm Bombyx mori, giống kén được thu mua từ trang trại nuôi trồng ở Nam Định Chúng tôi ưu tiên lựa chọn các kén có màu trắng, không bị lẫn những vệt dơ do nhộng để lại và phải nguyên vẹn về cấu trúc
Vỏ kén tằm được thu mua vào giữa tháng 8 với giá 1 400 000/kg vỏ kén tằm
Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu được trình bày ở Bảng 3.1
Bảng 3.1 Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
SST Tên hóa chất Nơi sản xuất
1 Sodium hydroxide (NaOH) Trung Quốc
4 Sodium carbonate (Na2CO3) Trung Quốc
5 Thuốc thử Folin Ciocalteu phenol reagent Đức
6 2,2’ – azinobis - (3 - ethylben zthiazoline – 6 - sulfonic acid) (ABTS) Sigma Aldrich
9 Yeast extract powder Ấn Độ
10 Hydrochloric acid (HCl) Trung Quốc
Bảng 3.2 Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên thiết bị Xuất xứ
1 Cân phân tích Thụy sĩ
4 Máy tiệt trùng Nhật bản
6 Tủ cấy vô trùng BSA Singapore
7 Máy quang phổ UV-VIS hai chùm tia Hitachi UH-5300 Nhật bản
8 Và những thiết bị khác
Bảng 3.3 Dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu
STT Dụng cụ Xuất xứ
1 Ống nghiệm thủy tinh Đức
Nội dung nghiên cứu
Hình 3.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu
Khảo sát đặc tính hoá học và sinh học của protein sericin từ kén tằm
Khảo sát thành phần nguyên liệu trong vỏ kén tằm
Tiến hành đo hàm lượng ẩm, hàm lượng tro, lipid, protein tổng và carbohydrate tổng
Khảo sát ảnh hưởng của dung môi bazo (NaOH) đến quá trình tách chiết sericin
Khảo sát pH của dung môi trích ly
Khảo sát nhiệt độ trích ly Khảo sát thời gian trích ly Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn Chống oxy hóa của sericin Đo phổ UV – Vis Đo điểm đẳng điện (pI) của sericin Xác định khối lượng phân tử protein bằng phương pháp SDS-Page
3.2.2 Quy trình chiết suất sercin từ vỏ kén tằm
Hình 3.2 Quy trình chiết suất sericin từ kén tằm
Kén sau khi thu mua được đưa về phòng thí nghiệm và tiến hành loại bỏ các tạp chất, các sợi tơ bao quanh kén và con nhộng trong kén Sau đó, cắt kén thành những sợi có đường kính 1 – 2 mm, kích thước kén nhỏ để tăng hiệu quả trích ly
Hình 3.3 Vỏ kén tằm sau khi xử lý (trái) và Vỏ kén tằm sau khi cắt nhỏ 1–2 mm
Sericin là một chất protein dính được tạo ra bởi con tằm để giữ các sợi tơ lụa chặt chẽ Chất protein này được tách ra khỏi bề mặt tơ lụa thông qua quá trình khử gôm (degumming) Các yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình khử gôm sericin là chất hoạt động bề mặt, thời gian khử gôm, nhiệt độ và pH
Hình 3.4 Dịch chiết trước (trái) và sau (phải) quá trình khử gôm
Sau khi đã thực hiện bước khử gôm, thu được dịch chiết chứa hai loại protein là sericin và fibroin Fibroin là một loại protein không hòa tan có trong tơ tằm được sản xuất bởi ấu trùng tằm Fibroin là thành phần chính của sợi tơ tằm, cung cấp độ cứng và độ bền cho sợi tơ Sericin là một loại protein vô định hình giống như keo, hoạt động như một chất kết dính để giữ tính tồn vẹn cấu trúc của sợi tơ Sử dụng giấy lọc Qualitative Filter Paper
20 đường kính 10 cm để lọc sericin và fibroin, lỗ lọc có đường kính 15 ~ 20 m, giúp tách sericin ra khỏi fibroin và thu được dịch trích sericin không tạp chất
Hình 3.5 Dịch sericin sau khi lọc (trái) và bã fibroin thu được sau lọc (phải)
Sau khi lọc dịch trích, dịch thu được sẽ đem đi ly tâm ở điều kiện 4500 vòng/phút trong vòng 20 phút.
Phương pháp nghiên cứu
3.3.1.1 Phương pháp xác định độ ẩm
Mục đích: Xác định hàm lượng ẩm có trong kén tằm dựa trên độ giảm khối lượng của mẫu khi được làm nóng trong tủ sấy trong một khoảng thời gian đủ dài
Cách thực hiện: Sấy khô đĩa petri trong tủ sấy ở 105 o C trong 30 phút Để nguội đĩa trong bình hút ẩm đến nhiệt độ phòng rồi cân chính xác khối lượng của cả đĩa đặt 2 g mẫu lên đĩa và cân Đặt đĩa và tử sấy ở 105 o C trong 1 giờ Lấy đĩa ra khỏi tủ sấy và để nguội trong bình hút ẩm, sau đó lấy ra cân Sấy đến khi khối lượng không đổi Tính độ ẩm theo phần trăm khối lượng theo công thức sau:
G1: Khối lượng đĩa và mẫu trước khi sấy (g)
G2: Khối lượng đĩa và mẫu sau khi sấy (g)
Go: Khối lượng đĩa (g) ssG: Khối lượng mẫu cần xác định (g), 𝐺 = 𝐺 1 − 𝐺 𝑜
3.3.1.2 Phương pháp xác định hàm lượng tro tổng
Mục đích: Định lượng hàm lượng tro trong kén tằm dựa trên khối lượng tro trắng của mẫu thu được sau quá trình nung mẫu ở nhiệt độ cao trong thời gian dài
Cách thực hiện: Cho vào 3 g mẫu vào chén nung Cân chính xác khối lượng chén và mẫu Cho tất cả vào và nâng nhiệt lên từ từ cho đến 550 o C, nung trong 5 giờ 30 phút cho khi xuất hiện tro trắng Trong trường hợp còn tro đen, lấy ra để nguội, cho thêm H2O2 hoặc HNO3 đậm đặc và nung đến khi tro trắng Để nguội trong bình hút ẩm và cân Tính hàm lượng tro theo % khối lượng
Hàm lượng tro (%)s được tính theo công thức:
G1: trọng lượng chén và mẫu trước khi nung (g)
G2: trọng lượng chén và mẫu sau khi nung (g)
3.3.1.3 Xác định hàm lượng protein tổng bằng phương pháp Kjeldahl
Mục đích: Xác định hàm lượng nitơ tổng từ kén tằm Phần trăm nitơ sau đó sẽ được chuyển đổi thành phần trăm protein
Cách tiến hành: Thí nghiệm dựa trên phương pháp của Bradstreet (1954) và có một số điều chỉnh:
- Vô cơ hóa mẫu: Cho 15 mL H2SO4 đặm đặc và các ống Kjeldahl Sử dung 2.5 g
K2SO4, 0.075 g CuSO4 và 0.075 TiO2 để xúc tác phản ứng
- Chưng cất: Mẫu sau khi vô cơ hóa được tiến hành cất đạm NH3 bay hơi ra được thu hồi trong dung dịch H3BO3 với hai chất chỉ thị Bromocresol green 0.1 % và Methyl red 0.1 %
- Chuẩn độ: Lượng NH3 trong dung dịch muối borate và được định phân bằng dung dịch HCl 0.1 N chuẩn Từ thể tích HCl vừa định phân được, tính được % nitơ tổng và % protein tổng theo công thức sau:
Hàm lượng (%) Nitơ tổng có trong mẫu:
N – hàm lượng Nitơ tính bằng phần trăm khối lượng, %
VHCl – số mL dung dịch chuẩn HCl 0.1N sử dụng chuẩn độ, mL m – khối lượng mẫu đem vô cơ hóa, g
K – hệ số hiệu chỉnh nồng độ HCl 0.1N (hệ số chuẩn độ được xem là bằng 1 nếu chúng ta sử dụng ống chuẩn)
1/17 = Hệ số chuyển đổi sang protein đối với kén tằm
3.3.1.4 Xác định hàm lượng lipid
Hàm lượng lipid trong sericin được xác định bằng phương pháp Soxhlet (Castro và cộng sự, 1998) Phương pháp sử dụng dung môi: diethyl ether và petroleum ether Diethyl ether và petroleum ether đóng vai trò trong việc trích ly chất béo và các thành phần tan trong béo Sau khi dung môi trong pha nhẹ bay hơi hết sẽ thu được chất béo có trong mẫu
Cách tiến hành: Cân 2 g mẫu kén tằm đã cắt nhỏ, gói trong giấy lọc và đặt vào phễu chiết Bổ sung hỗn hợp dung môi diethyl ether và petroleum ether vào phễu chiết, cho chảy tràn xuống bình chứa dung môi sao cho lượng dung môi chiếm ít nhất 1/3 bình chứa và không quá 2/3 bình chứa dung môi Lắp ống sinh hàn Gia nhiệt làm nóng dung môi và tiến hành trích ly trong 6 - 8 giờ cho đến khi lipid được trích ly hoàn toàn Kết thúc quá trình trích ly, mẫu kén trong giấy lọc được đem loại bỏ dung môi thừa (để trong tủ hút và sau đó sấy đến khối lượng không đổi) Lượng lipid trong mẫu được tính bằng độ cao hút khối lượng so với mẫu kén ban đầu (mẫu kén chưa trích ly)
3.3.1.5 Xác định hàm lượng carbohydrate
Hàm lượng carbohydrate trong mẫu nước được xác định từ các thành phần protein, lipid, độ ẩm, độ tro và được xác định theo công thức sau:
Carbohydrate (%) = 100 % - % Protein - % Lipid - % Ẩm - % Tro
3.3.2 Khảo sát các điều kiện chiết tách sericin bằng phương pháp khử gôm sử dụng dung dịch NaOH
Mục đích: Xác định điều khiện nhiệt độ, thời gian trích ly tối ưu của dung môi NaOH ở các pH khác nhau
- Cân 0.5 g vỏ kén tằm đã cắt nhỏ Đong 15 mL dung dịch NaOH 0.1 N Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/30 (w/v)
- Khảo sát từng điều kiện thời gian, nhiệt độ và pH của dung dịch theo Bảng 3.4
Bảng 3.4 Bố trí thí nghiệm khảo sát các điều kiện tách chiết
Thí nghiệm Điều kiện cố định Điều kiện thay đổi
Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi
Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi
Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi
- Sau khi trích ly, dung dịch sẽ được lọc qua giấy lọc để loại bỏ fibroin Và đem đi ly tâm để loại bỏ cặn còn sót Hàm lượng sericin (mg/mL) sẽ được xác định bằng phương pháp Lowry Thí nghiệm được lặp lại ít nhất 3 lần
3.3.3 Xác định hàm lượng sericin trong dịch chiết phương pháp Lowry
Mục đích: Xác định hàm lượng sericin sau mỗi thí nghiệm tách chiết để đánh giá ảnh hưởng cửa thời gian, nhiệt độ và độ pH đến lượng sericin thu nhận được Thí nghiệm dựa trên phương pháp của Rangi và cộng sự (1951)
- Dung dịch A: 2 g Na2CO3 và 0.4 g NaOH pha trong 100 mL nước cất
- Dung dịch B: Pha 0.1 g NaKC4H4O6 vào 10 mL nước cất
- Dung dịch C: Pha 0.05 g CuSO4.5H2O vào 10 mL nước cất
→ Dung dịch thuốc thử Lowry là hỗn hợp của 3 dung dịch A:B:C theo tỷ lệ 48:1:1
- Thuốc thử Folin: Pha loãng 2 lần với nước cất trước khi sử dụng
- Pha loãng dung dịch protein chuẩn từ huyết thanh bò (Bovine serum albumin - BSA) với nước cất ứng với các nồng độ 2, 4, 6, 8, 10 (mg protein/mL)
- Lấy 0.5 mL BSA ở các nồng độ khác nhau pha với 2.5 mL thuốc thử Lowry, lắc đều và để yên trong 20 phút Sau đó, cho thêm 0.1 mL thuốc thử Folin đã pha loãng, lắc đều và để yên trong 20 phút Đo độ hấp thu của hỗn hợp ở bước sóng 660 nm Dựng đường chuẩn ứng với độ hấp thụ của 5 nồng độ BSA Đo protein mẫu: Lấy 0.5 mL dịch trích đã pha loãng ở các nồng độ nồng độ 2, 4,
6, 8, 10 (mg protein/mL) và 2.5 mL thuốc thử Lowry cho vào ống nghiệm và lắc và để yên trong 20 phút Sau đó, cho thêm 0.1 mL thuốc thử Folin đã pha loãng, lắc đều và để yên trong 20 phút Đo độ hấp thu của hỗn hợp ở bước sóng 660 nm Dựa vào phương trình đường chuẩn xác định được giá trị nồng độ sericin trong dung dịch tách chiết
3.3.4 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của sericin
Mục đích: Khảo sát hoạt tính bắt gốc tự do ABTS của mẫu dịch trích sericin ở nhiều nồng độ khác nhau
Chuẩn bị: ABTS là một gốc cation tự do bền, hòa tan ABTS trong nước với nồng độ
7 mM Chuẩn bị dung dịch kali persulfate với nồng độ 2.45 mM Pha dung dịch cation ABTS + bao gồm 250 mL ABTS 7 mM và 250 mL K2S2O8 2.45 mM, để dung dịch trong bóng tối trong vòng 16 giờ Dung dịch ABTS + được pha loãng với nước cất cho đến khi đạt được 0,7 ± 0,05 khi đo Abs bước sóng 734 nm
Cách thực hiện: Thí nghiệm được thực hiện dựa trên phương pháp của Wang và cộng sự (2021) và có một số điều chỉnh, cụ thể là: Hỗn hợp bao gồm 270 mL dung dịch ABTS + được điều chỉnh và 30 mL dung dịch sericin ở các nồng độ khác nhau Hỗn hợp được lắc nhẹ và để trong bóng tối trong vòng 10 phút ở nhiệt độ phòng Sau đó, đo hỗn hợp ở 734 nm Nước cất được dùng làm mẫu trắng Khả năng bắt gốc tự do ABTS được tính bằng công thức sau:
Phần trăm bắt gốc tự do ABTS (%) = [ 1 – (A mẫu-734nm - A mẫu trắng-734nm)] 100 (%) Trong đó:
A mẫu-734nm: giá trị mật độ quang của mẫu đo ở bước sóng 734 nm
A mẫu trắng-734nm: giá trị mật độ quang của mẫu trắng đo ở bước sóng 734 nm
Dựa vào phương trình hồi quy y = ax+ b được xây dựng ta có thể tính được hoạt tính kháng oxy hóa 𝐼𝐶50 (Cho biết hàm lượng hợp chất có khả năng ức chế 50% hàm lượng gốc
25 tự do có mặt) Giá trị càng thấp 𝐼𝐶50 chứng tỏ khả năng bắt gốc tự do ABTS của mẫu càng cao (Wei-Hsun và cộng sự, 2021)
Lặp lại thí nghiệm ba lần
3.3.5 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của sericin
Mục đích: Khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch chiết sericin được tách chiết bằng
NaOH, từ đó so sánh khả năng khả năng kháng khuẩn dịch chiết trong điều kiện tách chiết khác nhau
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Khảo sát nguyên liệu
Tiến hành khảo sát các chỉ tiêu cơ bản của vỏ kén tằm B mori Thành phần chung của kén được phân tích và thể hiện ỏ Bảng 4.1
Bảng 4.1 Một số chỉ tiêu nguyên liệu vỏ kén tằm B mori
STT Chỉ tiêu Đơn vị Kết quả
5 Carbohydrate % 11.34 Độ ẩm, tro, chất béo, carbohydrate và protein tổng là các thành phần cơ bản của vỏ kén
B mori, Dựa trên dữ liệu trong Bảng 4.1, độ ẩm, độ tro và hàm lượng lipid của vỏ kén lần lượt là 4.13 %, 0.35 % và 0.50 % Kết quả trên có sự tương đồng với báo cáo của Kweon và công sự (2012) với độ ẩm từ 5 ÷ 6 %, thành phân tro đạt 0.3 ÷ 0.4 % và lipid nằm trong khoảng 0.39 ÷ 0.51 %
Theo Wang và cộng sự, tổng hàm lượng protein trong vỏ kén chiếm hơn 90%, bao gồm cả fibroin và sericin Tuy nhiên, kết quả thí nghiệm của nhóm cho thấy hàm lượng protein tổng của vỏ kén tằm là 83.68 % thấp hơn so với báo cáo Nguyên nhân dẫn đến sự sai lệch này có thể là do cùng giống kén B mori nhưng khác nhau về chế độ ăn và môi trường sống và các thao tác trong quá trình khử khoáng, khử protein cũng ảnh hưởng đến hàm lượng protein của vỏ kén Mặc dù sô liệu thấp hơn thí nghiệm của Wang và cộng sự nhưng kết quả tổng hàm lượng protein cho ra vẫn khá cao nếu tính trên tổng khối lượng kén Do lượng protein tổng trong thí nghiệm này tương đối thấp nên thành phần carborhydrate (11.34%) có sự chênh lệch so với nghiên cứu của Kweon và cộng sự (2012) là 0.27 ÷ 1.7 %
4.2 Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và thời gian đến quá trình tách chiết sericin bằng phương pháp sử dụng dung dịch kiềm NaOH Để khảo sát điều kiện tách chiết tốt nhất với NaOH là tác nhân khử gôm, một chuỗi các điều kiện khác nhau (độ pH, nhiệt độ, thời gian) đã được chuẩn bị và tiến hành như đã trình bày ở mục 3.2.1 Các dữ liệu đã được tính toán và được thể hiện trong Hình 4.1
Hình 4.1 Hàm lượng sericin trích ly bằng NaOH ở điều kiện pH thay đổi
Tốc độ khử keo tăng dần khi độ pH trong NaOH tăng như trong Hình 4.1 Ở các pH từ 8 đến 11, lượng sericin thu hồi khá thấp, tức là chỉ có lớp sericin bên ngoài và lớp giữa được loại bỏ Khi tăng pH lên 12, lớp sericin bao quanh fibroin gần như bị loại bỏ hoàn toàn và thu được hàm lượng cao nhất là 100.35 mg/mL với thời gian và nhiệt độ cố định lần lượt là 30 phút và 100°C Một vài báo cáo cho rằng tốc độ trích ly protein sericin của kén càng tăng khi độ pH càng cao (Brogan và công sự, 2016; Bussler và công sự, 2016; Fogang Mba và công sự, 2021; Azagoh và công sự, 2016) Độ hòa tan của protein tăng lên độ pH trong dung môi càng cao do các acid amin có tính acid và trung tính bị ion hóa Vì vậy, quá trình trích ly sericin trong môi trường kiềm sẽ cho hàm lượng protein cao hơn (Deleu và cộng sự, 2019)
Hàm lượng sericin (mg/mL) Độ pH
Hình 4.2 Hàm lượng sericin trích ly bằng NaOH ở điều kiện nhiệt độ thay đổi Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình khử keo đã được nghiên cứu trong khoảng nhiệt độ từ 80 °C – 130 °C để tối ưu hóa nhiệt độ cần thiết cho quá trình khử keo hoàn toàn Quá trình khử keo được thực hiện ở pH 12 trong 30 phút Hàm lượng thu được cao nhất khi sử dụng dung môi NaOH được quan sát thấy ở 100 o C là 101.55 mg/mL (Hình 4.2.) Tuy nhiên, khi tăng mức nhiệt lên 110 °C thì hàm lượng dịch giảm mạnh, và ở nhiệt độ cao, áp suất cao (120°C), lượng sericin tăng nhẹ nhưng không đáng kể và có xu hướng giảm trở lại ở mức nhiệt kế tiếp Nguyên nhân là do độ pH cao gây ra những biến đổi cho hầu hết các cấu trúc bậc 3 và bậc 4 của protein Kết hợp thêm NaOH với mức nhiệt cao, một số acid amin sẽ tham gia vào phản ứng hóa học Điều này không chỉ ảnh hưởng đến giá trị dinh dưỡng của protein mà còn ảnh hưởng đến độ phức tạp cấu trúc protein dẫn đến việc hình thành nhiều liên kết ngang (Deleu và cộng sự, 2019)
Hàm lượng sericin (mg/mL)
Hình 4.3 Hàm lượng sericin trích ly bằng NaOH ở điều kiện thời gian thay đổi
Kết quả ở Hình 4.3 cho thấy rằng tất cả sericin bên ngoài sợi fibroin gần như bị loại bỏ khi đun sôi vỏ kén với dung dịch NaOH trong 45 phút với hàm lượng thu được là 113.27 mg/mL Nhưng khi kéo dài thời gian trích ly, hàm lượng sericin thu hồi có chiều hướng giảm dần mặc dù đã cố định nhiệt độ và pH tối ưu Gulrajani và cộng sự (1996) đã nghiên cứu quá trình khử keo và nhận thấy rằng hầu hết quá trình khử keo hoàn tất trong 30 – 45 phút và việc tăng thêm thời gian chiết không mang lại hiệu quả đáng kể Thời gian trích càng lâu sẽ làm giảm tính chất cơ học của kén, thậm chí làm hỏng bề mặt của fibroin và protein sericin; chuỗi sericin sẽ bị thủy phân thành các peptide và acid amin tự do (Cao và cộng sự, 2013) Trong khảo sát này, có thể thấy khi tăng các điều kiện tách chiết (pH, nhiệt độ, thời gian) thì lượng sericin thu được càng tăng vì ở nhiệt độ cao sẽ cung cấp nhiều năng lượng để tác sericin ra khỏi fibroin và độ hòa tan của sericin trong dịch chiết cũng cao hơn (Kunz và cộng sự, 2016) Ở nhiệt độ và thời gian thấp, năng lượng cung cấp cho quá trình trích ly không đủ để tách hoàn toàn sericin ra khỏi vỏ kén, dẫn đến hàm lượng thu được thấp Nhưng ở mức nhiệt độ quá cao và thời gian lâu cũng làm tổn thất hàm lượng dịch chiết vì khi ở trong môi trường kiềm mạnh, cấu trúc protein sericin có thể bị phân hủy (Freddi và cộng sự, 2003)
Nhìn chung, quá trình khử keo vỏ kén tằm trong dung dịch NaOH (pH 12, nhiệt độ
100 o C, thời gian 45 phút) thu được nồng độ sericin rất cao Chất kiềm làm tăng khả năng chiết protein bằng cách phá vỡ chất nền và làm cho protein dễ hòa tan hơn (Deleu và cộng sự, 2019) Khi ở xa điểm đẳng điện pI của chúng, protein mang điện tích cao hơn, làm tăng
Hàm lượng sericin (mg/mL)
34 khả năng hòa tan của chúng trong môi trường nước Dung dịch sau khi chiết thường được trung hòa bằng acid HCl, protein sericin và muối natri có thể được tái chế để tránh gây ô nhiễm nước thải và tổn thất nguồn tài nguyên sinh học Ngoài ra, những thay đổi về cấu trức và/ hoặc thành phần (bao gồm quá trình đồng phân hóa), liên kết ngang thường có ý nghĩa về mặt dinh dưỡng và có chức năng kỹ thuật (Deleu và cộng sự, 2019).
Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của sericin
Hình 4.4 Kết quả khả năng bắt gốc tự do ABTScủa dung dịch sericin tách chiết từ B mori bằng dung môi NaOH Đối với phương pháp tách chiết bằng dung dịch NaOH khả năng bắt gốc tự do của sericin ở nồng độ 1; 2; 3; 4; 5; 6 mg/mL cho kết quả lần lượt là 46.73 %; 49.10 %; 52.50 %;
55 %; 56.63 % và 63.57 % Nhìn Hình 4.4 có thể thấy, khả năng bắt gốc tự do của sericin tỉ lệ thuận với nồng độ của sericin
Phương pháp ABTS được sử dụng trong nghiên cứu này là một phương pháp gián tiếp để phát hiện khả năng chống oxy hóa của các chất ABTS bị oxy hóa là gốc ABTS cation xanh lam ổn định, hòa tan trong ethanol axit hoặc pha nước, với mức hấp thụ tối đa được phát hiện ở 734 nm Sau khi ABTS được thêm vào dung dịch, thành phần chống oxy hóa phản ứng với ABTS và sau đó mờ dần Tại thời điểm này, sự thay đổi độ hấp thụ ở 734 nm đã được phát hiện (Olabiyi và cộng sự, 2016) ABTS có màu xanh lam - xanh lục Các chất chống oxy hóa phản ứng với ABTS để làm cho dung dịch mờ dần; do đó, khả năng bắt gốc
Nồng độ sericin (mL dịch/ mL môi trường)
35 tự do ABTS có thể được thể hiện bằng giá trị hấp thụ Trong nghiên cứu này, khả năng bắt gốc tự do ABTS của dung dịch sericin tách chiết từ B mori dung môi NaOH tăng lên cùng với sự gia tăng nồng độ mẫu Dựa trên kết quả tính toán và xử lý số liệu thu được giá trị IC50 của các phương pháp tách chiết sericin bằng NaOH là 2.2 mg/mL
Trong một vài nghiên cứu, tác giả Dash và cộng sự đã chỉ ra rằng protein sericin từ tằm ức chế quá trình apoptosis do UVB gây ra trong tế bào keratinocytes da người (Dash và cộng sự, 2008) và tiềm năng chống oxy hóa của protein chống lại stress oxy hóa do hydrogen peroxide gây ra trong nguyên bào sợi da bằng cách sử dụng các chỉ số của hoạt động catalase, lactate dehydrogenase và malondialdehyde (Dash và cộng sự, 2008)
Trong số các cơ chế chống oxy hóa của sericin, việc ức chế hoạt động tyrosinase đã được nghiên cứu rộng rãi Enzyme tyrosinase, còn được gọi là poliphenoloxidase, xúc tác quá trình hydroxyl hóa từ monophenol thành diphenol và quá trình oxy hóa chúng thành quinone Quá trình này dẫn đến sự hình thành melanin, gây ra hiệu ứng chuyển màu nâu ở một số loại trái cây và rau quả (Xing và cộng sự, 2016) Các hoạt động chống oxy hóa của sericin có tương quan với hàm lượng serine và threonine cao, có các nhóm hydroxyl hoạt động như các nguyên tố vi lượng như đồng và sắt (Fatahian và cộng sự, 2021; Lamboni và cộng sự, 2015)
Sericin cũng được báo cáo là có hoạt tính bảo vệ quang vì nó có thể hấp thụ hiệu quả bức xạ cực tím (UV) và ngăn ngừa thiệt hại oxy hóa bằng cách duy trì cân bằng oxy hóa khử Trước đây đã có báo cáo rằng việc cung cấp B mori sericin tại chỗ đã bảo vệ chuột cái không có lông khỏi cháy nắng do bức xạ UVB và bắt đầu khối u (Zhaorigetu và cộng sự, 2003) Sericin sở hữu các nhóm dựa trên amin khác nhau giàu hydro, oxy và nitơ tạo điều kiện hấp thụ mạnh bước sóng tia UV dưới 200 nm,
Xác định điểm đảng điện của sericin
Hình 4.5 Kết quả thí nghiệm đo điểm đẳng điện pI của sericin
Kết quả thí nghiệm từ Hình 4.5 cho thấy, ống nghiệm số 5 đục nhất với pH = 5.8 vậy nên điểm đẳng điện pI của sericin được chiết bằng dung môi NaOH, điều này cho thấy ở pH 5.8 tổng điện tích dương bằng tổng điện tích âm của sericin bằng không Sericin có điểm đẳng điện trong vùng amino acid trung tính (pI = 5.8), điều này chứng minh sericin chứa nhiều các amino acid có tính trung tính mạnh như serine, glycine, axit glutamic, axit aspartic… Kết quả này tương đương với kết quả nghiên cứu của Kanono và cộng sự (2020) Sericin có khả năng hòa tan trong nước nóng Độ hòa tan của sericin được quyết định bởi hàm lượng acid amin trong chúng Sericin có khả năng tạo gel và hiện tượng này xảy ra nhanh ở nhiệt độ thấp và khoảng pH 6 – 7 (Zhu và cộng sự, 1995) Cấu trúc gel có thể bị phá hủy ở nhiệt độ cao và tạo gel ngược trở lại khi hạ nhiệt độ Trong quá trình tạo gel, độ bền của gel tăng khi sức căng bề mặt giảm (Kweon và cộng sự, 2000).
Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của sericin đối với chủng Staphylococcus aureus và chủng Escherichia coli
Hoạt tính kháng khuẩn của sericin được tiến hành bằng thí nghiệm trải đĩa đối với S aureus - vi khuẩn gram dương và E coli - vi khuẩn gram âm gây bệnh Khả năng kháng khuẩn của dịch trích sericin được thể hiện qua sự giảm mật độ vi khuẩn S aureus ở Hình 4.6 và Hình 4.7
Hình 4.6 Hoạt tính kháng khuẩn S aureus của sericin sau 12 giờ ủ đối với (a) Đĩa đối chứng, (b) Đĩa bổ sung sericin
Hình 4.7 Hoạt tính kháng khuẩn E coli của sericin sau 12 giờ ủ đối với (a) Đĩa đối chứng, (b) Đĩa bổ sung sericin
Có thể thấy từ Hình 4.6 và Hình 4.7 mật độ vi khuẩn giảm xuống khi có sự hiện diện của dung dịch sericin Theo Lim và Hudson, hoạt động kháng khuẩn của sericin là do sự tương tác của sericin tích điện dương với dư lượng tích điện âm ở bề mặt tế bào của nhiều loại nấm và vi khuẩn, gây ra sự thay đổi bề mặt tế bào và làm thay đổi tính thấm của tế bào Điều này gây ra sự rò rỉ các chất nội bào, chẳng hạn như chất điện giải, vật liệu hấp thụ tia cực tím, protein, acid amin, glucose… Kết quả là sericin ức chế quá trình trao đổi chất của vi sinh vật và ức chế sự sinh sôi của vi khuẩn
Hình 4.8 Độ giảm mật độ tế bào S aureus (log CFU/ mL) của mẫu dịch chiết bằng dung môi NaOH Ở Hình 4.8 mẫu dịch trích từ dung môi NaOH thì cũng có khả năng làm giảm mật độ tế bào vi khuẩn S aureus từ 1mL mẫu/40mL môi trường đến 6mL mẫu/ 40mL môi trường thì độ giảm mật độ tế bào cũng tăng từ 0.63 (log CFU/mL) đến 0.97 (log CFU/mL) Kết quả cho thấy sự gia tăng nồng độ sericin dẫn đến hiệu quả kháng khuẩn cao hơn đối với vi khuẩn gram dương S areus Hoạt tính kháng khuẩn của sericin có thể bắt nguồn từ các chuỗi acid amin cation của nó, được tạo ra bởi các nhóm NH3 tích điện dương ở pH acid (Doakhan và công sự, 2013; Mowafi và cộng sự, 2016) Hành vi polycationic được coi là yếu tố chính góp phần vào cơ chế tương tác có thể có của nó với thành tế bào vi khuẩn tích điện ẩm Sự tương tác này này ảnh hưởng đến độ cứng và tính ổn định của peptidoglycan, tạo ra sự rò rỉ protein và các thành phần nội bào khác, cuối cùng dẫn đến sự ức chế sự phát triển của vi khuẩn (Seo và cộng sự, 1992; Chen và cộng sự, 1998) Tế bào vi khuẩn dram dương có áp suất thẩm thấu bên trong cao hơn và không có thành tế bào cứng, tế bào của chúng ỡ ra dẫn đến mất chất bên trong tế bào (Martinez-Camacho, 2010)
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 ĐC 1 2 3 4 5 Độ giảm nồng độ tế bào (log CFU/ mL) Độ pha loãng (mL mẫu/ mL môi trường)
Hình 4.9 Độ giảm mật độ tế bào E coli (log CFU/ mL) của mẫu dịch chiết bằng dung môi NaOH Ở Hình 4.9 mẫu dịch trích từ dung môi NaOH thì cũng có khả năng làm giảm mật độ tế bào vi khuẩn E coli từ 1mL mẫu/40mL môi trường đến 5mL mẫu/ 40mL môi trường thì độ giảm mật độ tế bào cũng tăng từ 0.14 (log CFU/mL) đến 0.44 (log CFU/mL) Kết quả cho thấy sự gia tăng nồng độ sericin dẫn đến hiệu quả kháng khuẩn cao hơn đối với vi khuẩn gram âm E coli Nhìn Hình 4.8 và Hình 4.9 có thể thấy khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn gram dương và vi khuẩn gram âm không cao lý do là dịch trích sericin thu được có pH 9 và có điểm đẳng điện pI = 5.8 nên protein sẽ mang điện tích âm Đối với mẫu sericin có pH >
4 (pH = 9) khả năng kháng khuẩn thấp hơn mẫu dịch trích từ dung môi có pH thấp (< 4), do proton của các ion –NH3 + bị khử thành nhóm NH2 trung tính, nhóm này không hỗ trợ tương tác cho thành tế bào tích điện âm Ngoài ra, thành tế bào vi khuẩn gram dương (peptidoglycan bên ngoài dày) dễ dàng tương tác với một sericin tích điện dương Và đối với vi khuẩn Gram âm (E coli) thành tế bào của vi khuẩn có một lớp phospholipid bên ngoài làm cho sericin tơ tích điện dương khó tiếp cận lớp mỏng lớp peptidoglycan bên trong Do đó sericin có tác dụng kháng khuẩn không đáng kể đối với Gram âm (Gilbert, 1991; Friedman, 2010) Hoạt động kháng khuẩn này của protein sericin tơ được giải thích theo sự sắp xếp không gian của chuỗi bên axit amin của nó (Palermo và cộng sự, 2010) Protein sericin tơ ở nồng độ thấp cung cấp sự phân bố phân tử tốt hơn trong dung môi với số lượng tương tác
0,50 ĐC 1 2 3 4 5 Độ giảm nồng độ tế bào (log CFU/ mL) Độ pha loãng (mL mẫu/ mL môi trường)
40 tương đối nhỏ giữa các chuỗi lân cận của nó, dẫn đến tối đa hóa các vị trí tích điện có sẵn cho khớp nối bên ngoài (Gabriel và cộng sự, 2009) Tuy nhiên, trong trường hợp nồng độ cao hơn, lượng khuẩn lạc phát triển giảm dần, điều này thể hiện khả năng kháng khuẩn sericin của tơ tằm tăng dần để có thể ức chế sự phát triển của vi khuẩn Ở nồng độ cao, sự phát triển liên kết hydro và cộng hóa trị giữa các nhóm chức tăng lên, làm giảm độ phân tán, khiến cấu trúc có cấu trúc cuộn chồng chéo lên nhau, do đó thiết lập các hạn chế về không gian đối với các nhóm chức tích điện gây cản trở sự liên kết với thành tế bào vi khuẩn (Freitas và cộng sự, 2010; Solomonidou và cộng sự, 2001) Trong nghiên cứu này, nồng độ ức chế thích hợp để kìm khuẩn của sericin là 5 mL mẫu/mL môi trường.
Định tính sericin bằng phương pháp UV-Vis
Hình 4.10 Phổ UV của sericin từ phương pháp tách chiết bằng dung môi NaOH (màu xanh) và nước cất (màu cam)
Hàm lượng Protein trong sericin chiếm gần 90 % thành phần của nó Sericin chứa 18 loại axit amin Trong số 18 loại acid amin, serine, acid aspartic và glycine là những acid amin rất quan trọng được quy cho các tính chất hóa lý và chức năng của sericin Protein thường có hai đỉnh hấp thụ ở vùng UV, một giữa 215-240 nm và 260-290 nm khác Liên kết peptide acid amin hấp thụ 215-240 nm vùng tia UV Trong phạm vi bức xạ UV 260-290 nm được hấp thụ bởi các acid amin thơm như tryptophan, tyrosine và phenylalanine Dung dịch
41 sericin lụa cho thấy đỉnh hấp thụ ở 216 nm và 275 nm cho thấy rằng sericin có khả năng chống tia cực tím (Gupta và cộng sự, 2014)
Từ Hình 4.10 cho thấy, cực đại hấp thụ của sericin ở bước sóng 217 nm đối với dung môi NaOH và bước sóng 215 nm đối với nước cất Do liên kết peptide có nhiều trong sericin nên độ hấp thụ khá cao Sự hấp thụ trong khoảng 260 – 290 nm, dung dịch sericin được tách chiết bằng NaOH có đỉnh hấp thụ nằm ở bước sóng 263nm và sericin được tách chiết bằng nước cất có đỉnh hấp thụ nằm ở bước sóng 273nm.
Xác định trọng lượng phân tử của sericin bằng phương pháp SDS-PAGE
Một số nghiên cứu đã báo cáo rằng trọng lượng phân tử sericin phụ thuộc vào nguồn sericin và phương pháp chiết xuất Theo nghiên cứu trước đây, trọng lượng phân tử của sericin được chiết xuất bằng cách đun sôi trong nước có sự phân bố rộng từ 20 đến 400 kDa Ngoài ra, việc chiết xuất nhiệt tạo ra một dải bị nhòe do sự thoái hóa của protein polypeptide thành các phần trọng lượng phân tử nhỏ hơn (Sahu và cộng sự, 2016) Việc chiết xuất kiềm cho thấy trọng lượng phân tử thấp hơn 100 kDa (Gimenes và cộng sự, 2014) Tuy nhiên, trọng lượng phân tử sericin chính xác chưa được báo cáo do các thành phần phức tạp của sericin bị ảnh hưởng bởi các điều kiện chiết xuất và chế biến khác nhau
Hình 4.11 Kết quả chạy điện di protein của sericin từ phương pháp tách chiết bằng dung môi NaOH và nước cất
Kết quả chạy điện di sericin của 2 phương pháp được chuẩn trên thang đo với khối lượng phân tử từ 10 – 245 kDa Giữa 2 phương pháp sự chênh lệch này không đáng kể Dựa vào Hình 4.11 quan sát thấy có 3 phân đoạn protein rõ nét tại khối lượng phân tử 13 kDa và 24 kDa đối với dung môi là nước cất và khối lượng phân tử 11 kDa đến 24 kDa đối với dung môi là NaOH Theo nghiên cứu của Zhang và cộng sự đã sử dụng sericin tơ với khối lượng phân tử trong vòng 10–70 kDa để điều chế liên hợp sinh học sericin/insulin, thu được bằng cách liên kết chéo với glutaraldehyde Thời gian bán hủy của liên hợp sericin/insulin trong ống nghiệm lần lượt là 2.2 và 2.7 lần so với liên hợp albumin/insulin huyết thanh bò và insulin, không gây ra bất kỳ phản ứng kháng nguyên nào Sự ổn định hóa lý và sinh học của insulin được cải thiện với liên hợp sericin (Zhang và cộng sự, 2006)
Nagai và cộng sự, Ito và cộng sự đã sử dụng sericin nhỏ (30 kDa) như một phương pháp điều trị tổn thương giác mạc trong mô hình động vật của bệnh đái tháo đường loại 2 Trong các nghiên cứu của họ, các tác giả đã chỉ ra rằng việc nhỏ thuốc sericin pha loãng trong nước muối vào tổn thương giác mạc đã đẩy nhanh quá trình chữa bệnh Hơn nữa, sericin đã được thêm vào môi trường nuôi cấy của một dòng tế bào biểu mô giác mạc của con người và có hiệu quả trong việc tăng sinh và bám dính tế bào (Nagai và cộng sự, 2009; Ito và cộng sự, 2013) Mặt khác, trọng lượng phân tử của sericin ảnh hưởng đến ứng dụng của nó Trong khi sericin trọng lượng phân tử thấp (20 kDa sericin được ưa thích để sản xuất các sản phẩm (ví dụ: hệ thống phân phối thuốc, màng, hydrogel, sợi) cho kỹ thuật mô và các mục đích khác (Das và cộng sự, 2021).
Xác định cấu trúc hóa học của sericin bằng phương pháp FTIR
Trong phổ FTIR, các dải protein nằm trong khoảng 1630 – 1650 cm -1 đặc trưng cho amide bậc I (liên kết C=O), các amide bậc II (liên kết N-H thứ cấp) thường nằm ở dải từ
1540 – 1520 cm -1 và 1270 – 1230 cm -1 đối với các amide bậc III (các liên kết C-N và N-H)
Hình 4.12 Phổ FTIR của sericin được trích ly bằng dung môi NaOH (màu cam) và nước cất (màu xanh)
Trong Hình 4.12 mẫu sericin được trích ly bằng dung môi NaOH và nước cất ở nhiệt độ o áp suất cao có phổ FTIR xác định trong khoảng 4000 – 400 cm -1 Đỉnh hấp thụ FTIR đặc trưng của sericin được tạo ra bởi hai phương pháp trích ly trên nằm tại mức 3304 cm -1 (đối với mẫu SSNaOH) và 3308 cm -1 (đối với mẫu SSHTTP) biểu thị cho liên kết NH–OH
Tại đỉnh 2989 cm −1 biểu thị cho liên kết C–H, đỉnh 1656 cm −1 biểu thị liên kết C=O/ tương tác của Ag với nhóm hydroxyl của sericin Tuy nhiên, mẫu chiết bởi phương pháp HTHP có độ hấp thụ cao hơn so với mẫu chiết bởi dung môi NaOH là 80.88 % > 79.49 % (tại 2989 cm −1 ) và nhỏ hơn tại đỉnh1635 cm −1 với độ hấp thụ là 40.96 % < 49.24 % Các đỉnh 1530 cm -1 (đối với mẫu SSNaOH) và 1536 cm -1 (đối với mẫu SSHTTP) cho thấy sự hiện diện của dải liên kết uốn cong N-H
Trong khoảng 1270 – 1230 cm −1 thể hiện liên kết C–N với mẫu NaOH có đỉnh tại 1254 cm −1 và mẫu HTHP có đỉnh tại 1254 cm −1 và các đỉnh nhọn Ag–O nằm ở khoảng 1083 –
874 cm −1 Hơn nữa, các đỉnh dao động từ 400 đến 800 cm -1 cho thấy sự hiện diện của liên kết giữa Ag với các nguyên tử N
Hai phổ sericin từ hai phương pháp trích ly này có sự khác nhau về % độ hấp thụ nhưng nhìn chung chúng vẫn có sự tương đồng tại các đỉnh biểu hiện cho các liên kết hóa học sericin Các nhà nghiên cứu khác cũng mô tả các đỉnh FTIR tương tự như thí nghiệm trên, nhưng cũng có một số kết quả báo cáo hơi khác nhau Nguyên nhân của sự sai lệch này có
T ra ns im it ta nce (%)
44 thể là do các điều kiện trích ly, nguồn gốc kén khác nhau… (Dsugi và Elbashir, 2015; Prusty và Swain, 2018; Youssef và cộng sự, 2015; Chitichotpanya P và Chitichotpanya C, 2017).
Xác định thành phần acid amin trong dung dịch sericin được trích ly từ dung môi
Kết quả thành phần acid amin tự do được xác định bằng phương pháp AOAC 994.12 được trình bày trong Bảng 4.2
Bảng 4.2 Thành phần acid amin có trong sericin được chiết bằng dung môi NaOH
Phương pháp chiết bằng dung môi NaOH
Phương pháp chiết bằng Alkaline (Aramwit và cộng sự, 2010)
Hàm lượng serine và glycine có kết quả khá cao và không có sự khác biệt đáng kể ngoại trừ lượng của glycine thấp hơn so với bài báo cáo của Aramwit và cộng sự năm 2010 (GlyNaOH = 8.11 % < GlyAlkaline = 11.01 %) Hàm lượng acid aspartic giữa phương pháp chiết NaOH thấp hơn so với phương pháp của Aramwit (AspNaOH = 18.31 % < AspAlkaline = 19.88
%) Trong acid aspartic thường có điện tích âm ở pH sinh lý nên proton dễ dàng bị khử bởi nhóm -COOH ở mạch bên trong dung dịch kiềm để tạo ra COO−NH4 + tan trong nước Cả hai phương pháp chiết xuất đều sử dụng dung môi có gốc từ nước, do đó tạo ra lượng lớn serine và glycine hòa tan trong nước, trong khi rất ít acid amin kỵ nước như proline, leucine, isoleucine và phenylalanine được tìm thấy
Tổng hàm lượng cystine - cysteine trong mẫu dịch sericin chiết bằng dung môi NaOH được báo cáo không phát hiện được Theo Kahn (1985), cysteine dường như là chất ức chế tyrosinase tốt nhất Tuy nhiên, cysteine không thể ức chế trực tiếp enzyme này, mà nó cần phải kết hợp với quinine được sản xuất bởi enzyme mới mang lại hiệu quả kháng tyrosinase cao nhất (Dudley và Hotchkiss, 1989) Các peptide tương tác với tyrosinase có thể hoạt động như chất ức chế tiềm năng Các peptide liên kết tyrosinse luôn chứa một hoặc nhiều dư lượng arginine và thường kết hợp với pheylalanine Sự hiện diện của valine, alanine hoặc leucine cũng có góp phần quan trọng trong việc ức chế tyrosinase Do đó, các peptide ức chế tyrosinase tốt nhất nên chứa arginine và/ hoặc phenylalanine kết hợp với valine, alanine và/ hoặc leucine Kahn cũng chỉ ra rằng các peptide chứa dư lượng acid aspartic hoặc acid glutamic thường không liên kết tốt với tyrosinase và do đó hoạt tính kháng tyrosinase thấp hơn Điều này tương quan với mẫu sericin trích ly bằng dung dịch NaOH, hàm lượng acid aspartic và acid glutamic cao đáng kể cho nên khả năng ức chế tyrosinase thấp
Các kết quả trên có vài sai số so với nghiên cứu của Aramwit và cộng sự (2010), nguyên nhân có thể do có sự khác nhau giữa giống kén, các thao tác thực hành cũng như dung môi trích ly
