khảo sát sự xuất hiện biến thể a1298c gen mthfr và a66g gen mtrr đối với một số mẫu bệnh phẩm máu của người việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: KHẢO SÁT SỰ XUẤT HIỆN BIẾN THỂ A1298C GEN MTHFR VÀ A66G GEN MTRR ĐỐI VỚI MỘT SỐ MẪ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

KHẢO SÁT SỰ XUẤT HIỆN BIẾN THỂ A1298C GEN MTHFR VÀ A66G GEN

MTRR ĐỐI VỚI MỘT SỐ MẪU BỆNH PHẨM MÁU CỦA NGƯỜI VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Y DƯỢC

CBHD: ThS Trương Kim Phượng SVTH: Phan Ngọc Bảo Trâm MSSV: 1553010218

Khóa: 2015

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

KHẢO SÁT SỰ XUẤT HIỆN BIẾN THỂ A1298C GEN MTHFR VÀ A66G GEN

MTRR ĐỐI VỚI MỘT SỐ MẪU BỆNH PHẨM MÁU CỦA NGƯỜI VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Y DƯỢC

SVTH: Phan Ngọc Bảo Trâm MSSV: 1553010218

ThS Trương Kim Phượng Khóa: 2015

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2019

Trang i

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành cảm ơn và tri ân thầy cô Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh và quý Thầy Cô của Khoa Công nghệ Sinh học đã tận tình chỉ dạy, truyền đạt kiến thức cho em trong những học kì vừa qua Quý thầy cô đã tạo điều kiện cho em thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Đặc biệt, em xin cảm ơn Cô PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy và Thầy Cô giảng dạy tổ chuyên ngành Công nghệ Sinh học Y dược đã tận tình truyền đạt kiến thức chuyên môn cho chúng em Kính mong Thầy Cô góp ý, chỉ dẫn cho em khắc phục những thiếu sót trong quá trình hoàn thành chuyên đề khóa luận tốt nghiệp

Tiếp đến, em xin cảm ơn cô ThS Trương Kim Phượng đã nhiệt tình, quan tâm, giúp đỡ hướng dẫn từng bước để hoàn thành quá tình thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Em xin phép gửi lời cảm ơn đến các bạn phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử giúp đỡ hỗ trợ trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp của em

Cuối cùng, con xin cảm ơn sâu sắc đến Cha Mẹ là bóng cả cho đời con!

Em xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên

Phan Ngọc Bảo Trâm

Trang ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ApoB Apolipoprotein B - 100 CAD Coronary Artery Disease CDS Coding sequencing CHD Coronary Heart Disease CHRD Cys-His-rich Domain CVD Cardiovascular Disease DNA Deoxyribonucleic Acid F Fixed effects meta-analysis

FH Familial Hypercholesterolemia GOF Gain of function

HDL High Density Lipoprotein

HeFH Heterozygous Familial Hypercholesterolemia HoFH Homozygous Familial Hypercholesterolemia LDL Low Density Lipoprotein

LDLR Low Density Lipoprotein Receptor LOVD Leiden Open Variation Database

MTHFR Methylenetetrahydrofolate reductase

MTRR Methionine synthase reductase

NCBI National Center for Biotechnology Information PCR Polymerase Chain Reaction

PCSK9 Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 R Random effects meta-analysis

RNA Ribonucleic Acid

SAH Sadenosyl homocysteine SAM S-adenosyl methionine VSD Ventricular Septal Defect

Bảng III.3 Tổng hợp kết quả phân tích chỉ số Proportion phản ánh tần suất xuất hiện

biến thể A1298C gen MTHFR trên các công bố khoa học 23

Bảng III.4 Tổng hợp kết quả phân tích chỉ số Proportion (%) về tần số xuất hiện biến

thể A1298C gen MTHFR trên bộ mẫu bệnh phẩm, thuộc 16 công bố ca chứng + 1 công

bố đoàn hệ 25

Bảng III.5 Chỉ số OR về sự xuất hiện biến thể A1298C gen MTHFR trên bộ mẫu bệnh

phẩm so với bộ mẫu lành, thuộc 9 công bố ca chứng 26

Bảng III.6 Chỉ số RR về sự xuất hiện biến thể A1298C gen MTHFR trên bộ mẫu bệnh

phẩm so với bộ mẫu lành, thuộc 9 công bố ca chứng 27

Bảng III.7 Chỉ số OR và chỉ số RR về sự xuất hiện biến thể A1298C gen MTHFR trên

bộ mẫu bệnh phẩm so với bộ mẫu lành, thuộc 9 công bố ca chứng 28 Bảng III.8 Tổng hợp kết quả phân tích chỉ số Proportion phản ánh tần suất xuất hiện

biến thể A66G gen MTRR trên các công bố khoa học 35

Bảng III.9 Tổng hợp kết quả phân tích chỉ số PR% về tần số xuất hiện biến thể A66G

gen MTRR trên bộ mẫu bệnh phẩm và bộ mẫu lành, thuộc 14 công bố ca chứng và 1

công bố đoàn hệ 37

Bảng III.10 Chỉ số OR xuất hiện biến thể A66G gen MTRR trên bộ mẫu bệnh phẩm so

với bộ mẫu lành, thuộc 8 công bố ca chứng 38

Bảng III.11 Chỉ số RR xuất hiện biến thể A66G gen MTRR trên bộ mẫu bệnh phẩm so

với bộ mẫu lành, thuộc 8 công bố ca chứng 39 Bảng III.12 Chỉ số OR và chỉ số RR thể hiện chỉ số tỷ suất chênh và nguy cơ về xuất

hiện biến thể A66G (AG+GG) so với thể hoang dại AA trên biến thể A66G gen MTRR

trên bộ mẫu bệnh phẩm, thuộc 8 công bố ca chứng 40

Bảng III.13 Một số bộ mồi khuếch đại vùng gen MTHFR 48

Bảng III.14 Kết quả phân tích độ tương đồng của các cặp mồi với trình tự tham chiếu bằng công cụ BLAST 48

Trang iv

Bảng III.15 Kết quả kiểm tra vị trí hoạt động của các cặp mồi khuếch đại trình tự gen

MTHFR bao quanh vị trí biến thể A1298C bằng công cụ Annhyb 49

Bảng III.16 Kết quả kiểm tra vị trí hoạt động của các cặp mồi khuếch đại trình tự gen MTRR bao quanh biến thể A66G bằng công cụ Annhyb 49

Bảng III.17 Thông số vật lí của các cặp mồi được khảo sát bằng công cụ Oligo analyzer IDT 3.1 và Annhyb 50

Bảng III.18 Các dạng biến thể/đột biến xuất hiện trên bộ mẫu bệnh phẩm trên gen mục tiêu 55

Bảng III.19 Các dạng biến thể/đột biến gen MTHFR xuất hiện trên một số mẫu bệnh phẩm được phân tích bằng công cụ Codon Code Aligner 68

Bảng III.20 Dạng biến thể/đột biến 66A>G gen MTRR xuất hiện đồng thời trên hai mẫu bệnh phẩm 72

Phụ lục VI.1 Tiêu chí chẩn đoán bệnh FH của tổ chức DLCN ……….85

Phụ lục VI.2 Bộ tiêu chí chẩn đoán FH của MEDPED 85

Phụ lục VI.3 Bộ tiêu chí chẩn đoán FH của Simon Broome Register 86

Phụ lục VI.39 Kết quả đo quang phổ mẫu DNA bộ gen trong phân tích……….107

Phụ lục VI.40 Kết quả đo quang phổ mẫu DNA bộ gen trong phân tích 107

Phụ lục VI.41 Thông tin bộ mẫu bệnh phẩm và tính chất đột biến trên gen MTHFR và MTRR 107

Trang v

DANH MỤC HÌNH

Hình I.1 Gen MTHFR định vị trên nhiễm sắc thể 1 4 Hình I.2 Gen MTRR định vị trên nhiễm sắc thể 5 5

Hình III.1 Sơ đồ quy trình trích xuất dữ liệu trong phân tích tổng hợp tính chất đột biến

gen MTHFR A1298C và MTRR A66G 19 Hình III.2 Đồ thị “Funnel plot” về chỉ số Proportion phản ánh tần suất xuất hiện tính biến thể A1298C trên gen MTHFR, thuộc 17 công bố khoa học ca chứng trên bộ mẫu

bệnh phẩm 23

Hình III.3 Đồ thị “Forest plot” về chỉ số Proportion phản ánh tần suất xuất hiện biến thể A1298C trên gen MTHFR, thuộc 17 công bố khoa học trên bộ mẫu bệnh phẩm 24 Hình III.4 Đồ thị “Funnel plot” về chỉ số Proportion phản ánh tần suất xuất hiện tính biến thể A66G trên gen MTRR, thuộc 15 công bố khoa học trên bộ mẫu bệnh phẩm 35 Hình III.5 Đồ thị “Forest plot” về chỉ số Proportion phản ánh tần suất xuất hiện tính biến thể A66G trên gen MTRR, thuộc 15 công bố khoa học trên bộ mẫu bệnh phẩm 36

Hình III.6 Vị trí hoạt động của cặp mồi MTHFR_F2&MTHFR_R2 trên trình tự NM_005957.4 (CDS- coding sequence) 51 Hình III.7 Vị trí hoạt động của cặp mồi MTRR_F5&MTRR_R5 trên trình tự NM_002454.2 (CDS-coding sequence) 51

Hình III.8 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gen MTHFR biến thể A1298C 52 Hình III.9 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gen MTRR biến thể A66G 53 Hình III.10 Các dạng biến thể/đột biến xuất hiên trên gen MTHFR được phân tích bằng

công cụ Codon Code Aligner phiên bản 8.0.2 57

Hình III.11 Dạng biến thể/đột biến 1286A>C gen MTHFR trên mẫu M2 - thể dị hợp AC

Hình III.21 Các dạng biến thể/đột biến xuất hiện trên gen MTRR được phân tích bằng

công cụ Codon Code Aligner phiên bản 8.0.2 69

Hình III.22 Dạng biến thể/đột biến 66A>G gen MTRR trên mẫu M1- thể dị hợp AG 70 Hình III.23 Dạng biến thể/đột biến 66A>G gen MTRR trên mẫu M2- thể dị hợp AG 71 Phụ lục VI.4 Đồ thị “Forest plot” về chỉ số Proportion phản ánh tần suất xuất hiện tính biến thể A1298C trên gen MTHFR, thuộc 16 công bố khoa học trên bộ mẫu bệnh

biến thể A1298C trên gen MTHFR, thuộc 9 công bố khoa học ca chứng 89

Phụ lục VI.10 Đồ thị “Forest plot” về chỉ số Relative Risk phản ánh chỉ số nguy cơ xuất hiện biến thể A1298C trên gen MTHFR, thuộc 9 công bố khoa học ca chứng 89

Trang vii

Phụ lục VI.11 Đồ thị “Funnel plot” về chỉ số Relative Risk phản ánh chỉ số nguy cơ xuất hiện biến thể A1298C trên gen MTHFR, thuộc 9 công bố khoa học ca chứng 90 Phụ lục VI.12 Đồ thị “Forest plot” về chỉ số Proportion phản ánh tần suất xuất hiện tính biến thể A66G trên gen MTRR, thuộc 14 công bố khoa học trên bộ mẫu bệnh phẩm 90 Phụ lục VI.13 Đồ thị “Funnel plot” về chỉ số Proportion phản ánh tần suất xuất hiện tính biến thể A66G trên gen MTRR, thuộc 14 công bố khoa học trên bộ mẫu bệnh phẩm 91 Phụ lục VI.14 Đồ thị “Forest plot” về chỉ số Proportion phản ánh tần suất xuất hiện tính biến thể A66G trên gen MTRR, thuộc 14 công bố khoa học trên bộ mẫu đối chứng 91 Phụ lục VI.15 Đồ thị “Funnel plot” về chỉ số Proportion phản ánh tần suất xuất hiện tính biến thể A66G trên gen MTRR, thuộc 14 công bố khoa học trên bộ mẫu đối chứng 92 Phụ lục VI.16 Đồ thị “Forest plot” về chỉ số Odds ratio phản ánh chỉ số tỷ suất chênh về sự xuất hiện tính biến thể A66G trên gen MTRR trên bộ mẫu bệnh phẩm so với bộ

mẫu lành, thuộc 8 công bố ca chứng 92

Phụ lục VI.17 Đồ thị “Funnel plot” về chỉ số Odds ratio phản ánh chỉ số tỷ suất chênh về sự xuất hiện tính biến thể A66G trên gen MTRR trên bộ mẫu bệnh phẩm so với bộ

mẫu lành, thuộc 8 công bố ca chứng 93

Phụ lục VI.18 Đồ thị “Forest plot” về chỉ số Relative Risk phản ánh nguy cơ xuất hiện biến thể A66G trên gen MTRR, thuộc 8 công bố khoa học ca chứng 93 Phụ lục VI.19 Đồ thị “Funnel plot” về chỉ số Relative Risk phản ánh chỉ số nguy cơ xuất hiện biến thể A66G trên gen MTRR, thuộc 8 công bố khoa học ca chứng 94

Phụ lục VI.20 Kết quả BLAST trình tự tham chiếu NC_000001.11 (11.785.730 –

11.806.103) trên gen MTHFR 94

Phụ lục VI.21 Vùng trình tự exon 8 theo LOVD 95 Phụ lục VI 22 Kết quả khảo sát vùng trình tự exon 7 (exon 8) bằng công cụ Annhyb 95 Phụ lục VI.23 Kết quả BLAST vùng exon 7 (exon 8) trên trình tự NC_000001.11 95 Phụ lục VI.24 Kết quả BLAST mồi MTHFR_F2 trên trình tự NC_000001.11 96 Phụ lục VI.25 Kết quả BLAST mồi MTHFR_F2 trên các trình tự nhiễm sắc thể (NC_000016.10, NC_00017.11, NC_000001.11) 97 Phụ lục VI.26 Kết quả BLAST mồi MTHFR_R2 trên các trình tự nhiễm sắc thể NC_000001.11 98 Phụ lục VI.27 Kết quả BLAST mồi MTHFR_F2 trên các trình tự nhiễm sắc thể (NC_00003.12, NC_00007.14, NC_000001.11) 99

Trang viii

Phụ lục VI.28 Mồi MTHFR_F2&MTHFR_R2 trên trình tự NC_000001.11 (11.785.730 – 11.806.103) 100 Phụ lục VI.29 Mồi MTHFR_F2&MTHFR_R2 trên trình tự NC_000001.11 (11.806.103 - 11.785.730) 100 Phụ lục VI.30 Mồi MTHFR_F2&MTHFR_R2 trên trình tự NM_005957.4 101 Phụ lục VI.31 Kết quả so sánh trình tự với mã số NC_000005.10 từ vị trí nucleotide 7.851.186 đến vị trí nucleotide 7.901.124 với các trình tự có trong cơ sở dữ liệu trên công cụ BLAST 101 Phụ lục VI.32 Kết quả BLAST mồi MTRR_F5 trên các trình tự nhiễm sắc thể (NC_000002.12, NC_000006.12, NC_000005.10) 102 Phụ lục VI 33 Kết quả BLAST mồi MTRR_F5 trên trình tự NC_000005.10 103 Phụ lục VI.34 Kết quả BLAST mồi MTRR_R5 trên các trình tự nhiễm sắc thể (NC_000007.14, NC_000001.11, NC_000005.10) 104 Phụ lục VI.35 Kết quả BLAST mồi MTRR_R5 trên trình tự NC_000005.10 105 Phụ lục VI.36 Mồi MTRR_F5&MTRR_R5 trên trình tự NC_000005.10 (7.851.186 – 7.901.124)………105 Phụ lục VI.37 Mồi MTRR_F5&MTRR_R5 trên trình tự NM_002454.2 106 Phụ lục VI.38 Mồi MTRR_F5&MTRR_R5 trên trình tự NG_008856.1 106

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU……….1

I.1 MỘT SỐ BỆNH LÝ RỐI LOẠN CHUYỂN HÓA………1

I.1.1 Bệnh tăng cholesterol máu có tính gia đình (Cholesterol familial hypercholesterolemia – FH)……….1

I.1.2 Các bệnh lý tim mạch (Cardiovascular Disease – CVD)………2

I.1.3 Các bệnh lý đột quỵ (Stroke)……… 3

I.2 GEN MỤC TIÊU 4

I.2.1 Gen MTHFR (Methylenetetrahydrofolate reductase)……… 4

I.2.2 Gen MTRR (5-Methyltetrahydrofolate-homocysteine methyltransferase reductase)……….5

I.3 TÍNH CHẤT ĐỘT BIẾN TRÊN GEN MTHFR A1298C VÀ GEN MTRR A66G ĐỐI VỚI MỘT SỐ BỆNH LÝ RỐI LOẠN CHUYỂN HÓA 5

I.3.1 Dạng biến thể A1298C gen MTHFR (Methylenetetrahydrofolate reductase)……….5

I.3.2 Dạng biến thể A66G gen MTRR (5-Methyltetrahydrofolate-homocysteine methyltransferase reductase)……… 6

I.3.3 Tình hình nghiên cứu tính chất biến thể A1298C trên gen MTHFR và tính chất biến thể A66G trên gen MTRR trên thế giới………6

I.3.3.1 Dạng biến thể A1298C gen MTHFR (Methylenetetrahydrofolate reductase)……… 6

Trang x

I.3.3.2 Dạng biến thể A66G gen MTRR

(5-Methyltetrahydrofolate-homocysteinemethyltransferase reductase)……….7

I.4 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TỔNG HỢP (META-ANALYSIS) 8

I.5 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT BIẾN THỂ/ĐỘT BIẾN A1298C TRÊN GEN MTHFR VÀ A66G TRÊN GEN MTRR……….11

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………12

II.2.1 Khai thác dữ liệu (Data-mining) ……… 12

II.2.2 Phân tích tổng hợp (Meta-analysis) ……….13

II.2.3 Khảo sát in silico gen MTHFR A1298C và MTRR A66G……… 13

II.2.4 Khảo sát thực nghiệm………14

PHẦN III KẾT QUẢ-THẢO LUẬN……… 18

III.1 KẾT QUẢ KHAI THÁC DỮ LIỆU VÀ PHÂN TÍCH TỔNG HỢP 18

III.1.1 Kết quả phân tích tổng hợp về sự tương quan giữa tính chất biến thể (đột biến) A1298C trên gen MTHFR và một số bệnh lý rối loạn chuyển hóa 22

III.1.1.1 Tần số tổng thể của sự xuất hiện dạng biến thể (đột biến) A1298C trên gen MTHFR 22

III.1.1.2 Sự xuất hiện dạng biến thể A1298C trên gen MTHFR được biểu thị qua chỉ số Proportion, OR và RR trên một số phân hạng 29

III.1.2 Kết quả phân tích tổng hợp về sự tương quan giữa tính chất biến thể (đột biến) A66G trên gen MTRR và một số bệnh lý rối loạn chuyển hóa 33

III.1.2.1 Tần số tổng thể của sự xuất hiện dạng biến thể (đột biến) A66G trên gen MTRR 34

Trang xi

III.1.2.2 Sự xuất hiện dạng biến thể A66G trên gen MTRR được biểu thị qua chỉ

số Proportion, OR và RR trên một số phân hạng………41

III.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT IN SILICO……….46

III.3 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM PHÂN TÍCH TÍNH CHẤT BIẾN THỂ (ĐỘT BIẾN) A1298C TRÊN GEN MTHFR VÀ A66G TRÊN GEN MTRR BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR KẾT HỢP GIẢI TRÌNH TỰ……….….52

PHẦN IV KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ……… 73

IV.1 KẾT LUẬN 73

IV.1.2 Phân tích tổng hợp……… 73

IV.1.3 Khảo sát In silico……… 74

IV.1.4 Khảo sát thực nghiệm……… 74

IV.2 ĐỀ NGHỊ 74

PHẦN V TÀI LIỆU THAM KHẢO……….75

PHẦN VI PHỤ LỤC……….85

Trang xii

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cholesterol là yếu tố tác động chính đến sức khỏe tim mạch của con người và đóng một vai trò trong việc cấu tạo nên các tế bào khỏe mạnh Cholesterol tăng cao là tình trạng nồng độ cholesterol trong cơ thể vượt mức bình thường, có thể làm tăng nguy cơ mắc bệnh, một yếu tố nguy cơ hàng đầu đối với bệnh tim mạch (Cardiovascular Disease - CVD), bệnh mạch vành (Coronary Artery Disease - CAD), bệnh tiểu đường (Diabetes disease) và đột quỵ (Stroke disease), bệnh huyết khối (Homocysteine), hội chứng

chuyển hóa (Metabolic Syndrome – MetS), sinh non…(Goldberg et al., 2011; Pishva et

al., 2013; Li et al., 2015; Ni et al., 2015)

Một số công bố khoa học ghi nhận các dạng biến thể/đột biến trên gen MTHFR và MTRR

là nguyên nhân dẫn đến các bệnh lý rối loạn chuyển hóa như: khiếm khuyết tâm thất (Ventricular Septal Defect – VSD) theo công bố khoa học của Pishva và cộng sự (2013),

là do các biến thể trên gen MTHFR và MTRR; hội chứng chuyển hóa (Metabolic

Syndrome – MetS) theo công bố khoa học của Botto và cộng sự (2003); bệnh động mạch

vành theo công bố khoa học Laraqui và cộng sự (2007) (Pishva et al., 2013; Laraqui et

al., 2007; Botto et al., 2003)… Hơn nữa, bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình

(Cholesterol Familial Hypercholesterolemia – FH) là bệnh lý rối loạn di truyền, liên quan đến quá trình chuyển hóa lipoprotein tỷ trọng thấp (Low Density Lipoproteins – LDLs) Bệnh FH là nguyên nhân dẫn đến tăng nguy cơ mắc sớm một số bệnh lý về tim

mạch: bệnh mạch vành, xơ vữa động mạch (Klose et al., 2014)

Công bố khoa học của Lievers và cộng sự (2001) ghi nhận tính chất biến thể đột biến

trên gen MTHFR (A1298C) dẫn đến sự thay đổi lượng homocystein huyết tương có sự

tương quan với diễn tiến bệnh lý động mạch vành (xơ vữa động mạch) ở bệnh nhân mắc

bệnh lý tăng cholesterol trong máu có tính gia đình FH (Lievers et al., 2001) Thêm vào

đó, công bố khoa học của Kawashiri và cộng sự (2000), Pisciotta và cộng sự (2005) ghi

nhận tính chất biến thể đột biến A1298C gen MTHFR dẫn đến sự thay đổi lượng

homocystein huyết tương có sự tương quan với diễn tiến bệnh lý động mạch vành (xơ

vữa động mạch) ở bệnh nhân mắc bệnh tăng cholesterol máu có tính gia đình (Kawashiri

et al., 2000; Pisciotta et al., 2005)

Trang xiii

Công bố khoa học Gaughan và cộng sự (2001) xác định tính biến thể A66G gen MTRR

là một yếu tố di truyền quyết định sự thay đổi nồng độ homocystein trong huyết tương

và tăng cholesterol máu có tính chất gia đình (Gaughan et al., 2001)

Cho đến nay, chưa có các công bố cụ thể về tính chất biến thể đột biến A1298C gen

MTHFR và tính chất biến thể đột biến A66G gen MTRR trên quần thể người Việt Nam

Dựa vào các dẫn chứng khoa học nêu trên và với mong muốn tiếp tục phát triển nội dung nghiên cứu từ chuyên đề thực tập tốt nghiệp về hướng nghiên cứu đặc điểm phân tử liên quan một số bệnh lý rối loạn (rối loạn chuyển hóa cholesterol và lipid trong máu, bệnh lý liên quan đến tim mạch, bệnh lý huyết khối,…), chúng tôi thực hiện chuyên đề khóa

luận tốt nghiệp: “Khảo sát sự xuất hiện biến thể A1298C gen MTHFR và A66G gen

MTRR đối với một số mẫu bệnh phẩm máu của người Việt Nam”

❖ Mục tiêu:

Xác định mối tương quan giữa sự xuất hiện biến thể A1298C gen MTHFR và A66G gen

MTRR và một số bệnh lý rối loạn (rối loạn chuyển hóa cholesterol và lipid trong máu,

bệnh lý liên quan đến tim mạch, bệnh lý huyết khối,…) trên thế giới và ở Việt Nam, dựa vào công cụ phân tích tổng hợp (Meta-analysis) và khảo sát thực nghiệm bằng kỹ thuật sinh học phân tử phù hợp (PCR kết hợp giải trình tự)

❖ Nội dung nghiên cứu:

- Khai thác dữ liệu khoa học trên NCBI, Google với một số từ khóa: MTHFR,

MTHFR A1298C, MTRR, MTRR A66G Cholesterol, Hypercholesterolemia,

Familial combined hyperlipidemia,…

- Phân tích tổng hợp (Meta-analysis) về mối tương quan giữa sự xuất hiện biến thể

A1298C gen MTHFR và A66G gen MTRR đối với một số bệnh lý rối lọan chuyển

hóa: bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình và một số bệnh lý (dự kiến: mạch máu, đột quỵ, ), dựa trên bộ dữ liệu khoa học đã công bố trên thế giới Quá trình phân tích tổng hợp dựa vào phân tích tần suất đột biến (Proportion) trên mô hình ảnh hưởng ngẫu nhiên hoặc mô hình ảnh hưởng bất biến bằng công cụ Medcalc (phiên bản 18.2.1)

- Cập nhật kết quả khảo sát trên máy tính để chọn lọc các bộ mồi phù hợp với quy

trình PCR - giải trình tự để xác định sự xuất hiện biến thể A1298C gen MTHFR và A66G gen MTRR

Trang xiv

- Bước đầu thực hiện quy trình PCR kết hợp giải trình tự để phân tích sự xuất hiện

biến thể A1298C gen MTHFR và A66G gen MTRR trên một số mẫu bệnh phẩm

máu của người Việt Nam với một số chỉ số sinh hóa trong máu

PHẦN I

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Trang 1

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I.1 MỘT SỐ BỆNH LÝ RỐI LOẠN CHUYỂN HÓA

I.1.1 Bệnh tăng cholesterol máu có tính gia đình (Cholesterol familial hypercholesterolemia – FH)

Dạng bệnh lý rối loạn lipid trong máu và cholesterol trong máu là những nguyên nhân

chính dẫn tới các bệnh lý tim mạch, đột quỵ, nhồi máu cơ tim (Watts et al 2004) Bệnh

lý tăng cholesterol trong máu có tính gia đình (Cholesterol Familial Hypercholesterolemia – FH) được xác định với biểu hiện rối loạn lipid, cholesterol toàn

phần và lipoprotein trong máu (Daniels et al., 2011)

Xét về đặc điểm phân tử trên các gen mã hóa protein tham gia sự chuyển hóa cholesterol trong máu, bệnh tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình (Cholesterol Familial Hypercholesterolemia – FH) là dạng bệnh lý di truyền trội trên nhiễm sắc thể thường,

thường là tính chất đột biến xảy ra chủ yếu trên các gen: LDLR (Low Density Lipoprotein Receptor), ApoB (Apolipoprotein B), PCSK9 (proprotein convertase subtilisin / kexin loại 9) (Goldberg et al., 2011), MTHFR (Methylenetetrahydrofolate reductase) (Yang et al., 2013), gen MTRR (Methionine synthase reductase) (Zhi et al.,

2016)…

Biểu hiện bệnh FH gồm có các biểu hiện đặc trưng như tổn thương da, xuất hiện u vàng

(xanthoma) ở gót chân hoặc mí mắt (Hobbs et al., 1990) Bệnh FH gồm thể đồng hợp

(Homozygous Familial Hypercholesterolemia - HoFH) và thể dị hợp (Heterozygous Familial Hypercholesterolemia - HeFH), có thể do sự di truyền từ bố mẹ sang thế hệ con Bệnh lý FH thể đồng hợp tử thuộc dạng bệnh lý hiếm gặp, với tần suất 1/1.000.000.000 trường hợp khảo sát Tuy nhiên, bệnh lý FH thể dị hợp tử với tần suất

trong khoảng 1/300 – 1/500 (Pejic et al., 2014; Hopkins et al., 2011) Bệnh lý FH thể dị

hợp tử có lượng cholesterol toàn phần trong khoảng 350-550 mg/dL Bệnh lý FH thể

đồng hợp tử có có lượng cholesterol toàn phần trong khoảng 650-1.000 mg/dL (Pejic et

al., 2014; Hopkins et al., 2011)

Nghiên cứu của Goldberg và cộng sự năm 2011, bệnh lý tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình (Familial Hypercholesterolemia – FH) rất khó điều trị, phái cần phát

hiện sớm để kiểm soát bệnh lý FH (Goldberg et al., 2011) Robinson và cộng sự (2011)

Trang 2

ghi nhận bệnh nhân bệnh lý tăng cholesterol máu gia đình (FH) có yếu tố nguy cơ mắc bệnh tim mạch và đột quỵ nếu không được chữa trị sớm Độ tuổi trung bình mắc bệnh tim do bệnh lý FH: nam giới vào 40 tuổi, phụ nữ vào 50 tuổi Bệnh lý FH có nguy cơ nhồi máu cơ tim tăng gấp 24 lần ở tuổi 40 Ở các nước phương Tây, tần suất mắc bệnh tim mạch ở những người trung niên có bệnh lý FH dao động từ 22% đến 39% Do đó, tất cả những người mắc bệnh lý FH tăng cường điều trị những người có tiền sử bệnh tim

mạch, bệnh tiểu đường hoặc các yếu tố nguy cơ tim mạch khác (Robinson et al., 2011)

Thông thường, thể trạng người khỏe mạnh có lượng cholesterol toàn phần thấp hơn 200 mg/dl, bệnh nhân mắc bệnh tim mạch có lượng cholesterol toàn phần trong khoảng 200 - 239 mg/dl và bệnh nhân tăng cholesterol trong máu có lượng cholesterol toàn phần cao

hơn 240 mg/dl (Ma et al., 2006)

Theo công bố của Smith và cộng sự (2005), một số dạng biến thể trên gen MTHFR:

MTHFR C677T và A1298C có liên quan đến tăng lượng homocysteine trong máu là yếu

tố nguy cơ chính dẫn dến bệnh lý FH, bệnh tim mạch, bệnh đột quỵ, Các dạng biến thể này gây nên sự bất hoạt của protein MTHFR, làm giảm chức năng của enzyme MTHFR dẫn đến tăng lượng homocystein huyết tương, dẫn đến đến các bệnh lý tim

mạch (Smith et al., 2005; Butler et al., 2018)

Trên thế giới, các bộ tiêu chí chẩn đoán bệnh nhân mắc bệnh FH thường được áp dụng thuộc tổ chức DLCN (Dutch Lipid Clinic Network), Simon Broome và MEDPED của

Hoa Kỳ (US Make Early Diagnoses Prevent Early Deaths) (Damgaard et al., 2005)

Thông tin về bộ tiêu chí phân tích chỉ số nồng độ lipid trong máu nhằm xác định bệnh lý FH của tổ chức DLCN, Simon Broome và MEDPED được trình bày ở Phụ lục VI.1- Phụ lục VI.3

I.1.2 Các bệnh lý tim mạch (Cardiovascular Disease – CVD)

Bệnh lý tim mạch (Cardiovascular Disease – CVD): tăng cholestrol trong máu là một

trong những yếu tố nguy cơ đối với các bệnh tim mạch – CVD (Zhou et al., 2006) Bệnh

nhân tăng cholesterol máu gia đình (FH) có nguy cơ mắc bệnh lý tim mạch rất cao

(Robinson et al., 2011)

Bệnh tim mạch là do lớp mỡ thừa tích tụ trong các đại thực bào chứa lipid trong nội mạc động mạch Việc tích tụ liên tục của các đại thực bào chứa lipid kết hợp với sự tăng sinh

Trang 3

tế bào cơ trơn có thể tiến triển thành tổn thương xơ vữa động mạch hoặc thành mảng xơ vữa Sự xơ vữa lòng động mạch hoặc tắc nghẽn lòng động mạch bởi các mảng xơ, thường có lượng huyết khối cao, dẫn đến các bệnh lý tim mạch như nhồi máu cơ tim và

đột quỵ (Daniels et al., 2011) Bệnh tim mạch là nguyên nhân của thiếu máu cơ tim gây

ra chết mô cơ tim dẫn đến ngừng tim và tử vong, bệnh bao gồm hàng loạt các bệnh lý có liên quan với nhau, đáng chú ý nhất là bệnh động mạch vành (Coronary Artery

Disease - CAD), gây ra khoảng 7 triệu ca tử vong trên toàn thế giới mỗi năm (Sharma

et al., 2014; Butler et al., 2018)

Công bố khoa học của Cortese và cộng sự (2001), công bố của Butler và cộng sự (2018)

ghi nhận biến thể gen MTHFR có yếu tố di truyền góp phần gây xơ vữa động mạch (Cortese et al., 2001; Butler et al., 2018)

I.1.3 Các bệnh lý đột quỵ (Stroke)

Đột quỵ là một rối loạn đa yếu tố do chịu ảnh hưởng của môi trường và các yếu tố di truyền Hầu hết các đột quỵ là do thiếu máu cục bộ; trong số 80% trường hợp đột quỵ

gây ra bởi tắc nghẽn động mạch thứ phát sau xơ vữa động mạch (Almawi et al., 2009; Humphries et al., 2004)

Bệnh lý tim mạch do biến đổi gen xảy ra tự nhiên, một số cá nhân có khả năng duy trì trạng thái đồng nhất tốt hơn so với những người khác khi đối mặt với cùng một thách thức môi trường và cũng có thể là một trường hợp đột quỵ Các yếu tố nguy cơ của đột quỵ bao gồm tăng huyết áp, hút thuốc, tiểu đường, rung tâm nhĩ, tăng lipid máu và có nguồn gốc châu Phi hoặc châu Á Trong đó, bệnh tăng huyết áp là nguyên nhân chính gây xuất huyết và đột quỵ do thiếu máu cục bộ; bệnh tiểu đường, do dẫn đến xơ vữa động mạch, có nhiều khả năng liên quan đến đột quỵ do thiếu máu cục bộ (Humphries

et al., 2004)

Ngoài ra, còn có một số các bệnh lý có liên quan do các đột biến trên gen MTHFR và

MTRR như: khiếm khuyết tâm thất (Ventricular Septal Defect – VSD) theo công bố khoa

học của Pishva và cộng sự (2013) là do các biến thể trên gen MTHFR và MTRR (Pishva

et al., 2013); hội chứng chuyển hóa (Metabolic Syndrome – MetS) theo công bố khoa

học của Yang và cộng sự (2014) ghi nhận gen MTHFR và gen MTRR là những yếu tố

quyết định lượng homocysteine, hội chứng chuyển hóa (MetS) được đặc trưng một

Trang 4

nhóm các bất thường chuyển hóa khác nhau, bao gồm béo phì, rối loạn lipid máu, huyết

áp cao và nồng độ glucose cao (Yang et al., 2014); bệnh lý tiểu đường loại 2 theo công bố của Chehadeh và cộng sự (2016) xác định sự giảm hoạt động của MTHFR do khuyết

tật bẩm sinh hoặc thiếu hụt có liên quan đến việc tăng lượng homocysteine trong máu, một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng nồng độ homocysteine trong máu tăng có liên quan

đến tình trạng kháng insulin (Scullion et al., 2012), đó là nguyên nhân chính của các biến chứng tiểu đường loại 2 như bệnh thận đái tháo đường (Chehadeh et al., 2016;

Mtiraoui et al., 2007; Ukinc et al., 2009)…

I.2 GEN MỤC TIÊU

I.2.1 Gen MTHFR (Methylenetetrahydrofolate reductase)

Gen MTHFR (Methylenetetrahydrofolate reductase) định vị trên nhiễm sắc thể người tại

Protein MTHFR là loại enzyme Methylenetetrahydrofolate reductase, giúp kiểm soát

lượng homocysteine trong máu (Varga et al., 2005) MTHFR đóng vai trò quan trọng

trong quá trình chuyển hóa, tổng hợp nucleotide, homocysteine và methyl hóa nội bào, bằng cách xúc tác chuyển đổi 5,10 methylenetetrahydrofolate thành 5-methyltetrahydrofolate sử dụng cho việc tái tạo vitamin B, vitamin D12-homocysteine

thành methionine và tổng hợp purine, DNA và RNA (Sultan et al., 2006) MTHFR bao

gồm một vùng đầu N-, domain trung tâm hoạt động và vùng điều hòa ở đầu C- (Födinger

et al., 2000)

5p15.2-MTRR với trọng lượng khoảng 80 kDa và 725 amino acid (NCBI; GeneCards)

Hình I.2 Gen MTRR định vị trên nhiễm sắc thể 5 (Nguồn: https://www.genecards.org/cgibin/ carddisp.pl?gene=MTRR&keywords=MTRR)

Gen MTRR mã hóa enzyme MTRR, là thành viên của họ “Ferredoxin-NADP(+)

reductase, FHR) tham gia vào con đường sinh tổng hợp methionine, theo cơ chế tái chuyển hóa Bởi vì quá trình sinh tổng hợp methionine cần có nhóm methyl được chuyển từ folate, do đó enzyme MTRR tham gia vào quá trình biến dưỡng folate và methyl hóa

nội bào (Binia et al., 2014; NCIB) Enzyme MTRR xúc tác quá trình methyl hóa

cobalamin chuyển hóa thành methionine, từ S-adenosyl methionine (SAM) thành

Sadenosyl homocysteine (SAH) (Naushad et al., 2017)

I.3 TÍNH CHẤT ĐỘT BIẾN TRÊN GEN MTHFR A1298C VÀ GEN MTRR

A66G ĐỐI VỚI MỘT SỐ BỆNH LÝ RỐI LOẠN CHUYỂN HÓA

I.3.1 Dạng biến thể A1298C gen MTHFR (Methylenetetrahydrofolate reductase)

Tính chất biến thể A1298C thuộc vùng trình tự exon 7 trên gen MTHFR - vùng trình tự mã hóa vùng polypeptide giữ chức năng là domain điều hòa ở đầu C (Fung et al., 2011)

Dạng biến thể này chính là dạng đột biến điểm – đột biến sai nghĩa: chuyển đổi nucleotide A sang C ở vị trí 1298 thuộc trình tự cds (trình tự mã hóa) và gây nên sự thay thế Glutamate (G) thành Alanine (A) tại amino 429 thuộc chuỗi polypeptide của protein MTHFR Theo Varga và cộng sự (2005), dạng biến thể C677T và A1298C trên gen

MTHFR là nguyên nhân dẫn đến hoạt động của enzyme MTHFR làm tăng lượng

homocysteine, yếu tố nguy cơ cho bệnh tim mạch, đột quỵ…(Varga et al., 2005)

Trang 6

I.3.2 Dạng biến thể A66G gen MTRR (5-Methyltetrahydrofolate-homocysteine methyltransferase reductase)

Dạng biến thể A66G trên gen MTRR là dạng đột biến sai nghĩa, làm cho nucleotide A

sang G ở vị trí 66 dẫn đến sự sai hỏng cấu trúc protein MTRR thay thế Isoleucine (I) bằng Methionine (M) ở acid amin 22 (I22M), dẫn đến rối loạn chức năng của protein MTRR làm tăng homocystein trong huyết tương và bệnh lý khuyết tật ống thần kinh (Neutal tube defects), bệnh lý rối loạn mỡ máu và bệnh lý tăng Homocystein (Hcy) máu

(Wilson et al., 1999; Rai et al., 2013; Li et al , 2015) Tần số của dạng biến thể A66G trên gen MTRR xấp xỉ 30% (Wilson et al., 1999) Theo công trình nghiên cứu của Brown và cộng sự (2000), tính chất biến thể A66G trên gen MTRR ở thể đồng hợp GG là yếu tố nguy cơ dẫn đến bệnh mạch vành sớm, ở độ tuổi thấp hơn 58 (Brown et al., 2000)

I.3.3 Tình hình nghiên cứu tính chất biến thể A1298C trên gen MTHFR và tính chất biến thể A66G trên gen MTRR trên thế giới

I.3.3.1 Dạng biến thể A1298C gen MTHFR (Methylenetetrahydrofolate reductase)

Nghiên cứu của Födinger và cộng sự (2000) cho thấy có biến thể A1298C trên gen

MTHFR gồm dạng A1298A (AA) là thể đồng hợp tử hoang dại, A1298C (AC) là dạng

biến thể/đột biến ở thể dị hợp tử và C1298C (CC) là dạng biến thể/đột biến ở thể đồng hợp tử Công bố khoa học của Foding và cộng sự chỉ rõ dạng biến thể A1298C dẫn đến protein MTHFR giảm biểu hiện gây tăng lượng homocysteine trong máu tạo thành khối

máu đông và làm xơ cứng thành mạch (Födinger et al., 2000)

Thêm vào đó, một số công bố khoa học ghi nhận dạng biến thể A1298C trên gen MTHFR

là dạng biến thể gắn chặt với bệnh lý tăng lượng homocystein và giảm lượng folate trong

máu nhưng có thể xuất hiện ở bệnh nhân ở thể FH dị hợp tử Friedman et al., 1999; Kawashiri et al., 2000; Pisciotta et al., 2005; Yang et al., 2013; Chehadeh et al., 2016)

Điển hình, công bố của Friedman và cộng sự (1999) tiến hành nghiên cứu để xác định

tần số xuất hiện tính biến thể A1298C và C677T trên gen MTHFR ở Jerusalem, trên

quần thể người Do Thái, ở những người bệnh nhân có biểu hiện tăng lượng homocysteine trong máu Công trình nghiên cứu này được thực hiện nhằm xác định sự tương quan giữa sự xuất hiện các dạng biến thể này và sự thay đổi folate trong máu cũng

như các yếu tố nguy cơ tim mạch (Friedman et al., 1999)

Trang 7

Báo cáo khoa học của Chehadeh và cộng sự ghi nhận tính biến thể A1298C xuất hiện

trên gen MTHFR ở quần thể bệnh nhân FH thuộc Các Tiểu vương quốc Ả Rập Thống nhất (The United Arab Emirates, UAE) (Chehadeh et al., 2016) Công bố khoa học của

Kawashiri và cộng sự (2000), Pisciotta và cộng sự (2005) ghi nhận tính chất biến thể

đột biến trên gen MTHFR A1298C dẫn đến sự thay đổi lượng homocystein trong máu

và có sự tương quan với bệnh lý động mạch vành (xơ vữa động mạch) và bệnh tăng

cholesterol trong máu có tính gia đình-FH (Kawashiri et al., 2000; Pisciotta et al., 2005)

Nghiên cứu của Sazci và cộng sự (2006) ghi nhận biến thể A1298C xuất hiện trên gen

MTHFR là yếu tố nguy cơ di truyền đối với bệnh đột quỵ do xuất huyết, đột quỵ thiếu

máu cục bộ, bệnh tiểu đường và xơ vữa động mạch (Sazci et al., 2006) Theo nghiên cứu của Yang và cộng sự (2013), tần suất tính chất biến thể A1298C trên gen MTHFR là 24% đến 46% ở châu Âu, 13% đến 32,2% ở châu Phi và 0% đến 15% ở Mỹ (Yang et

al., 2013)

I.3.3.2 Dạng biến thể A66G gen MTRR (5-Methyltetrahydrofolate-homocysteine methyltransferase reductase)

Công trình nghiên cứu Gaughan và cộng sự (2001) xác định tính biến thể A66G trên gen

MTRR là một yếu tố di truyền quyết định sự thay đổi nồng độ homocystein trong huyết

tương Nhóm nghiên cứu tiến hành phân tích kiểu gen, kiểu hình trên 601 trường hợp bệnh nhân nam ở Bắc Ailen từ 30 đến 49 tuổi Kết quả nghiên cứu cho thấy tần số xuất

hiện tính biến thể A66G trên gen MTRR xuất hiện là 29% với chỉ số tỷ suất chênh (Odds

ratio – OR) biểu thị nguy cơ tăng cao homocystein trong huyết tương là OR = 1,59 (khoảng tin cậy 95%: 1,10-2,25; P = 0,03) Hơn nữa, công trình nghiên cứu của Zhi và

cộng sự (2016) nhận tính biến thể A66G trên gen MTRR dẫn đến sự thay đổi nồng độ

cholesterol lipoprotein máu có tính chất gia đình Dạng biến thể này xuất hiện ở những bệnh nhân béo phì, thừa cân và rối loạn chuyển hóa cholesterol trong máu Công trình nghiên cứu của Zhi và cộng sự (2016) thực hiện trên 2239 người, trong đó có 750 bệnh nhân nữ và 1489 bệnh nhân nam Kết quả nghiên cứu biểu thị tần số xuất hiện tính biến

thể A66G trên gen MTRR là 24,73% ở nữ và 24,71% ở nam (Gaughan et al., 2001; Zhi

et al., 2016)

Bên cạnh đó, nghiên cứu của Wang và cộng sự (2017) cho rằng tính biến thể A66G trên

gen MTRR có liên quan đến nguy cơ gây ung thư ở người Công trình nghiên cứu của

Trang 8

Yu và cộng sự (2014) ghi nhận tính biến thể A66G trên gen MTRR làm thay đổi nồng

độ homocysteine trong huyết tương gây nguy cơ mắc dị tật bẩm sinh (CHDs) Hơn nữa,

một số công bố khoa học xác định tính biến thể của gen MTRR A66G xuất hiện ở những bệnh nhân mắc bệnh bạch cầu ở độ tuổi trẻ em và trên quần thể người da trắng (Fang et

al., 2014; Yu et al., 2014; Wang et al., 2017)

Tuy nhiên, cho đến nay, có rất ít dữ liệu về đặc điểm phân tử (tính chất biến thể, tính

chất đột biến): dạng biến thể A1298C gen MTHFR; dạng biến thể A66G gen MTRR ở

những bệnh nhân mắc các dạng bệnh lý rối loạn chuyển hóa, cụ thể là dạng tăng cholesterol trong máu (có tính chất gia đình) hoặc mắc các bệnh lý khác như: bệnh lý tim mạch, tiểu đường ở quần thể người Việt Nam Do đó, chuyên đề khóa luận tiến hành với mong muốn cung cấp một phần dữ liệu có ý nghĩa khoa học thực tiễn về đặc

điểm phân tử (tính chất biến thể, tính chất đột biến): dạng biến thể A1298C gen MTHFR; dạng biến thể A66G gen MTRR liên quan đến một số rối loạn chuyển hóa ở người Việt

Nam để tạo tiền đề phát triển hướng nghiên cứu thiết lập công cụ chẩn đoán hoặc cung cấp dữ liệu quan trọng cho các phương pháp điều trị hợp lý đối với một số bệnh lý thuộc nhóm “ít được chẩn đoán/chữa trị” ở người Việt Nam

I.4 Phương pháp phân tích tổng hợp (Meta-analysis)

Thu thập dữ liệu khoa học có hệ thống và phân tích tổng hợp là công cụ nghiên cứu đắc

lực trong các lĩnh vực khoa học, cụ thể là y học (Rodseth et al., 2016) Phân tích tổng

hợp được tiến hành chủ yếu dựa vào các thuật toán thống kê để xác định tính chất đặc trưng của ước số (biến số) khi có giá trị biến thiên khác nhau trong các công trình nghiên cứu độc lập, do phụ thuộc vào yếu tố phương pháp nghiên cứu, loại mẫu…

(DerSimonian et al., 1986)

Phân tích tổng hợp theo phương pháp thống kê trên mô hình phân tích tổng hợp ảnh hưởng bất biến (Fixed-effects meta-analysis-F) hoặc mô hình phân tích tổng hợp ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random effects meta-analysis-R) cho một tiêu chí nhị phân với

khoảng tin cậy 95% (CI) Tiêu chí lựa chọn mô hình phân tích tổng hợp (Ryan et al.,

2014) dựa vào chỉ số I2 phản ánh tính bất đồng nhất về biến số khảo sát trong bộ dữ liệu: - Khi I2<50% và P≥0,1: phân tích tổng hợp hướng theo mô hình ảnh hưởng bất biến (Fixed-effects models)

Trang 9

- Khi I2>50% và P<0,1: phân tích tổng hợp hướng theo phân tích tổng hợp ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random effects models)

Các bước thực hiện phân tích tổng hợp (Basu et al., 2017):

Bước 1: Đặt câu hỏi dựa trên cơ sở lý thuyết

Cách đặt câu hỏi trong PICO:

− P (Participant): độ tuổi, giới tính, chủng tộc, quốc tịch, − I (Intervention): Ước số cần phân tích

− C (Comparator): Giả dược hoặc không có giả dược; các loại phương pháp nghiên cứu (giải phẫu hay phương pháp truyền thống, phương pháp dựa trên thuốc, hoặc liệu pháp hành vi nhận thức khác, )

− (Outcomes): hướng tiếp cận giải quyết để xuất kết quả

Bước 2: Tiến hành tìm kiếm cơ sở dữ liệu Y học, các cơ sở dữ liệu khoa học đáng tin cậy: Pubmed/Medline, Google Scholar, NCBI,

Xác định các thuật ngữ tìm kiếm thích hợp, các thuật ngữ tìm kiếm được sắp xếp bằng các -án tử của Boolean Logic: "AND", "OR" và "NOT" để có thể giới hạn hoặc mở rộng phạm vi tìm kiếm, khai thác dữ liệu

Bước 3: Chọn lọc dữ liệu để phân tích tổng hợp bằng cách đọc tiêu đề, tóm tắt và toàn văn

Đầu tiên, đọc các tiêu đề và tóm tắt của tất cả các trang tìm kiếm có liên quan Trước hết, thiết lập một sơ đồ quyết định cho việc chọn và bỏ các bài viết để thực hiện phù hợp cho việc phân tích tổng hợp Thiết lập một sơ đồ gồm có:

− Dữ liệu (báo cáo khoa học) có/không liên quan đến câu hỏi nghiên cứu − Dữ liệu có/không có đối tượng/quần thể liên quan

− Dữ liệu có/không có sự liên quan đến nghiên cứu

− Dữ liệu có/không có nhóm so sánh, thuộc nhóm nghiên cứu ca chứng hoặc đoàn hệ,

− Dữ liệu có/không thảo luận về kết quả của nghiên cứu

Dữ liệu có/không được xuất bản ở định dạng chuẩn và phù hợp để trích xuất dữ liệu Dữ liệu được xuất bản bằng ngôn ngữ gì, có phù hợp để trích xuất dữ liệu? − Dữ liệu có/không có tính trùng lặp (cùng một ấn phẩm được xuất bản hai lần)

Bước 4: Trích xuất dữ liệu gồm một số thông tin:

Trang 10

− Tên của tác giả; Năm bài báo được xuất bản

− Cỡ mẫu/Loại mẫu, quần thể người bệnh, được thực hiện nghiên cứu

Loại nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu? Phương pháp nghiên cứu? Kết quả là gì và được xác định bằng phương pháp gì? kết quả như thế nào?

− Tổng mẫu khảo sát? Tổng mẫu đối chứng?

− Kết quả nghiên cứu theo thang đo liên tục hoặc thang đo nhị phân?,

Bước 5: Xác định độ tin cậy thông tin của các bài viết

Đối với mỗi nghiên cứu, cần phải đánh giá các thông tin và quyết định xem nghiên cứu có đáp ứng các tiêu chí hiệu lực nội bộ, dựa vào các câu hỏi: Lý thuyết và giả thuyết nghiên cứu này là gì?

− Cỡ mẫu có đủ cho câu hỏi nghiên cứu không? Nghiên cứu không đủ mạnh (giá trị power)?

Các tác giả đã loại bỏ những thành kiến trong nghiên cứu đến mức độ nào? Làm thế nào chắc chắn là các tác giả đã tiến hành một tiến trình ngẫu nhiên thích hợp?

Những biến gây nhiễu nào được kiểm

Bước 6: Xác định tính bất đồng nhất về biến số khảo sát trong bộ dữ liệu

Xác định chỉ số Heterroneity (tính bất đồng nhất) khi giá trị I2<50% và P≥0,1: phân tích tổng hợp hướng theo mô hình ảnh hưởng bất biến (Fixed-effects models) Khi giá trị I2>50% và P<0,1: phân tích tổng hợp hướng theo mô hình tổng hợp ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random effects models)

Bước 7: Xác định mô hình phân tích

− Xác định các chỉ số phản ánh biến số cần khảo sát: chỉ số OR (Odds ratio), chỉ số Proportion, với độ tin cậy 95% (P<0,05) Kết quả phân tích thể hiện ở dạng

đồ thị Forest plot

Đồ thị Forest plot thể hiện tính không đồng nhất về kết quả của biến số khảo sát trong từng công trình nghiên cứu, dựa trên mô hình ảnh hưởng bất biến và mô hình ảnh hưởng ngẫu nhiên để kiểm tra một loạt các nghiên cứu trong phân tích tổng hợp Để xác định mô hình phân tích, cần tiến hành xác định tính bất đồng nhất cho bộ dữ liệu, dựa vào chỉ số I2 (Index of Heterogeneity I2) dựa vào thuật toán Chi bình phương (Thorlund et al., 2012):

− Tính bất đồng nhất thấp: 0% <I2 < 40%

Trang 11

− Tính bất đồng nhất vừa: 30% <I2 < 60% − Tính bất đồng nhất cao: 50% <I2 < 90%

− Tính bất đồng nhất rất cao: I2 > 75%.

Bước 8: Xác định tính thiên vị và xây dựng đồ thị “Funnel plot” để kiểm tra tính thiên vị sẽ ảnh hưởng đến kết quả phân tích Nếu nghiên cứu dựa trên cỡ mẫu lớn và cho “kết quả nghiên cứu dương”, vì vậy nghiên cứu này được phân phối và có trọng số cao trong kết quả phân tích so với nghiên cứu nhỏ cho kết quả không rõ ràng hoặc “kết quả nghiên cứu âm” Do đó, trong quá trình chọn lọc, trích xuất dữ liệu đưa vào phân tích tổng hợp: việc lựa chọn các nghiên cứu lớn và loại bỏ các nghiên cứu nhỏ dẫn đến tính thiên vị

I.5 Phương pháp xác định tính chất biến thể/đột biến A1298C trên gen MTHFR và A66G trên gen MTRR

Theo công bố khoa học của Van der Put và cộng sự (1998), Gaughan và cộng sự (2001), Mahdieh và cộng sự (2013), Rai và cộng sự (2013), Li và cộng sự (2015), có nhiều phương pháp sinh học phân tử phù hợp để xác định trình tự nucleotide, gồm có: PCR kết hợp giải trình tự (PCR - Sequencing), Retriction Fragment Length Polymorphism – (RFLP), Multiplex PCR, Nested PCR, Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) Trong đó, phương pháp PCR kết hợp giải trình tự (PCR - Sequencing) là phương pháp cho phép phân tích chính xác trình tự nucleotide trên gen mục tiêu, giúp phát hiện và xác định bản chất các dạng đột biến điểm – nguyên nhân dẫn đến một số

bệnh di truyền thuộc nhóm rối loạn chuyển hóa (Jensen et al., 1996)

PHẦN II

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

− CodonCode Aligner phiên bản 8.0.2

II.1.2 Công cụ trực tuyến

− BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi) − GeneCards (http://www.genecards.org/)

Thực hiện quy trình PCR-giải trình tự phát hiện đột biến A1298C xuất hiện trên gen

MTHFR A1298C (2 mẫu bệnh phẩm) và đột biến A66G xuất hiện trên gen MTRR (3

mẫu bệnh phẩm) có chỉ số cholesterol trong máu >5mmol/L

II.2 PHƯƠNG PHÁP

II.2.1 Khai thác dữ liệu (Data-mining)

- Khai thác dữ liệu khoa học trên ngân hàng dữ liệu NCBI (PubMeb, PubMeb central (PMC) và dữ liệu trực tuyến khác Google, Google Scholar…

- Sử dụng một số từ khóa: Familial Hypercholesterolemia (FH), gene MTRR,

gene MTHFR, Autosomal Dominant Hypercholesterolemia (ADH),

- Thu thập và trích xuất dữ liệu để đưa vào phân tích tổng hợp: đặc điểm phân tử và tần suất xuất hiện của các dạng biến thể (tính chất biến thể hoặc tính chất

đột biến điểm) trên gen mục tiêu: MTHFR (đột biến A1298C), MTRR (đột biến

Trang 13

A66G) ở bệnh nhân mắc bệnh tăng cholesterol trong máu có tính gia đình hoặc một số bệnh lý về tim mạch, bệnh xơ vữa động mạch, bệnh mạch vành…

II.2.2 Phân tích tổng hợp (Meta-analysis)

Đưa bộ dữ liệu vào phân tích tổng hợp nhằm tìm hiểu sự tương quan giữa đặc điểm phân tử và tần suất xuất hiện của các dạng biến thể (tính chất biến thể hoặc tính chất đột biến

điểm) trên gen mục tiêu: MTHFR (biến thể A1298C), MTRR (biến thể A66G) và bệnh

tăng cholesterol trong máu có tính gia đình hoặc một số bệnh lý về tim mạch, bệnh xơ vữa động mạch, bệnh mạch vành

Quá trình phân tích tổng hợp dựa vào phân tích tần suất đột biến (Proportion), chỉ số tỷ suất chênh (Odds ratio-OR) và chỉ số nguy cơ (Relative risk-RR) với khoảng tin cậy 95% (Confidence intervals-CIs) và giá trị p<0,05 trên mô hình ảnh hưởng ngẫu nhiên hoặc mô hình ảnh hưởng bất biến, bằng công cụ Medcalc (phiên bản 18.2.1)

II.2.3 Khảo sát in silico gen MTHFR A1298C và MTRR A66G

Thu thập trình tự gen mục tiêu (MTHFR và MTRR) trên nguồn dữ liệu trực tuyến NCBI

và chọn lọc các cặp mồi phù hợp với phương pháp sinh học phân tử phù hợp (PCR - giải trình tự) nhằm mục tiêu:

(1) Khuếch đại vùng trình tự exon 7 (exon 8 – LOVD) gen MTHFR để hướng đến phân tích tính chất biến thể, tính chất đột biến A1298C trên gen MTHFR;

(2) Khuếch đại vùng trình tự gen MTRR để hướng đến phân tích tính tính chất biến thể, đột biến A66G trên gen MTRR

Trong quá trình phân tích các thông số của các cặp mồi, chúng tôi sử dụng một số công cụ tin sinh học:

− Kiểm tra độ đặc hiệu của bộ mồi với trình tự cần khảo sát và kích thước sản phẩm tạo thành bằng phần mềm Annhyb

− Để đánh giá các cặp mồi, sử dụng phần mềm trực tuyến IDT analyzer (http://www.idtdna.com/analyzer/applications/oligoanalyzer/) nhằm xác định các thông số của mồi: chiều dài mồi, nhiệt độ nóng chảy,

− Độ đặc hiệu của mồi được kiểm tra lại bằng chương trình BLAST trên NCBI (http://BLAST.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.cgi)

Trang 14

Dựa trên một số tiêu chí thiết kế mồi cho phương pháp PCR trong tài liệu Giáo trình Ứng dụng tin học trong Công nghệ sinh học (Lê Huyền Ái Thúy, 2016) và hướng dẫn của IDT (http://sg.idtdna.com/calc/Analyzer):

− Chiều dài mồi: thông thường chiều dài mồi nằm trong khoảng 17-28 nucleotide, tối thiểu 15 nucleotide

− Sản phẩm PCR có chiều dài khuếch đại nằm trong khoảng 100-600 bp − Tần suất GC (%) nên nằm trong khoảng 40–60%

− Nhiệt độ nóng chảy của hai mồi khác biệt không quá 5ºC, giới hạn thường gặp từ 50ºC đến 65ºC

II.2.4 Khảo sát thực nghiệm

Thiết bị và hoá chất:

(1) Thiết bị:

− Bể ổn nhiệt − Máy ly tâm lạnh − Tủ thao tác − Tủ lạnh − Máy vortex

− Máy đo quang phổ − Máy PCR

(2) Hóa chất: − Phenol − Chloroform

− Sodium dodecyl sulfate (SDS) 10% − NaCl 0,45M

− Tris HCl 10mM (pH = 8,2)

− Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 1M (pH = 8) − Ammonium acetate (NH4OAc) 5M

− Ethanol 100% − Ethanol 70%

Trang 15

− Proteinase K (18,5 mg/ml) − Master mix 2X

− Bộ mồi

Xác định sự tương quan giữa tính chất đột biến điểm nổi trội trên vùng exon 7 tính chất

đột biến A1298C gen MTHFR và tính chất đột biến A66G gen MTRR với khả năng mắc

bệnh/không mắc bệnh tăng cholesterol máu có tính gia đình hoăc các bệnh lý có liên quan trên người Việt Nam, gồm một số nội dung thực nghiệm:

− Tách chiết DNA bộ gen của bộ mẫu bệnh phẩm (mẫu máu) bằng phương pháp Phenol/Chloroform (Chomczynski & Sacchi, 1987)

− Thu nhận 50μl mẫu bệnh phẩm máu (huyết thanh) vào một eppendorf (1,5 ml) − Thêm 1ml H2O, vortex nhẹ, ly tâm 13.000 vòng trên phút trong 3 phút, thu tủa − Bổ sung 500µl dung dịch ly giải, gồm có NaCl 0,45M, Tris HCl 10mM (pH=8,2),

EDTA 1M (pH=8), SDS 10%

− Bổ sung 5μl proteinase K (20 mg/ml), trộn đều Ủ ở nhiệt độ 56oC trong 1 giờ − Bổ sung một thể tích dung dịch Phenol: Chloroform (tỉ lệ 1:1), trộn đều Ly tâm

ở nhiệt độ phòng, 13.000 vòng/phút trong 3 phút và thu dịch nổi

− Bổ sung một thể tích Chloroform tương đương với thể tích mẫu Ly tâm ở nhiệt độ phòng, 13.000 vòng/ phút trong 3 phút và thu dịch nổi

− Bổ sung 0,25 lần thể tích Amonium Acetate 5M và 2,5 lần thể tích Ethanol tuyệt đối (trữ lạnh) Ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút ở 4oC và thu tủa

− Bổ sung một thể tích Ethanol 70%, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC − Thu cặn, xử lý để làm khô mẫu DNA bộ gen và bảo quản trong 20 - 50 μl dung

Chú thích:

Trang 16

C: giá trị nồng độ DNA (μg/ml)

A260: độ hấp thụ của dung dịch DNA ở bước sóng 260 nm A280: độ hấp thụ cực đại của protein ở bước sóng 280 nm d: độ pha loãng (thường từ 30-50 lần)

(2) Phương pháp PCR

Chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng PCR trong tổng thể tích 50 μl khuếch đại vùng

trình tự exon 7 gen MTHFR bằng cặp mồi MTHFR_F2&MTHFR_R2 được tham khảo

bởi nghiên cứu của Van der Put và cộng sự (1998), Li và cộng sự (2015) và vùng trình

tự gen MTRR bằng cặp mồi MTRR_F5&MTRR_R5 được tham khảo bởi nghiên cứu

của Gaughan và công sự (2001)

Bảng II.1 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại trình tự mục tiêu

Bảng II.2 Chương trình nhiệt của phản ứng PCR

(3) Các bước chính trong kỹ thuật điện di trên gel agarose 1,5%

- Chuẩn bị khuôn gel và đun gel tan

- Rót gel vào khuôn, chờ gel đông, rút lược

Trang 17

- Nạp mẫu vào giếng (khoảng 5 - 10 μl sản phẩm PCR hoặc DNA bộ gen sau tách chiết) với chất nhuộm là GelRed có trong dung dịch nạp mẫu (6X, công ty cổ phần công nghệ TBR)

- Tiến hành điện di bản gel agarose 1,5% ở hiệu điện thế 70V trong 30 phút - Đọc kết quả bằng máy đọc gel (Gel Doc XR, BioRad) với tác động của tia UV để quan sát sự hiện diện của các băng sản phẩm PCR và so sánh kích thước với thang chuẩn 50 bp

(4) Giải trình tự và phân tích kết quả giải trình tự

Các mẫu sau khi điện di được các băng sản phẩm được tiến hành gửi mẫu giải trình tự đến công ty cổ phần công nghệ TBR với lựợng sản phẩm là 40 μl tương ứng với cặp mồi phù hợp Sau đó, chúng tôi thực hiện phân tích các kết quả giải trình tự với trình tự tham chiếu: NC_000001.11 (11.806.103 – 11.785.730), NM_005957.4 (CDS-coding sequence), NC_000005.10 (7.851.186 – 7.901.124), NM_002454.2 và sử dụng phần mềm CodonCode Aligner phiên bản 8.0.2 nhằm xác định các dạng biến thể (tính đa hình/ đột biến) xuất hiện trên các sản phẩm PCR khuếch đại vùng trình tự mục tiêu thuộc một số mẫu bệnh phẩm máu của người Việt Nam

PHẦN III

KẾT QUẢ-THẢO LUẬN

PHẦN III KẾT QUẢ-THẢO LUẬN

III.1 KẾT QUẢ KHAI THÁC DỮ LIỆU VÀ PHÂN TÍCH TỔNG HỢP

Chúng tôi thu thập được 168 công bố khoa học (93 công bố gen MTHFR A1298C và 75 công bố khoa học gen MTRR A66G) liên quan đến bệnh lý rối loạn chuyển hóa (cập

nhật đến tháng 5 năm 2019) Dựa theo tiêu chí trích xuất dữ liệu (Nội dung II.2) và tiến trình trích xuất tổng hợp được thể hiện ở Hình III.1, chúng tôi chọn lọc được hai bộ dữ liệu đưa vào phân tích tổng hợp (Bảng III.1 và Bảng III.2):

− Xét về biến thể A1298C trên gen MTHFR, tổng số 17 công bố khoa học gồm có

16 công bố khoa học “Ca chứng” (Case-control study) và 1 công bố khoa học “Đoàn hệ” (Cohort study)

− Xét về biến thể A66G trên gen MTRR, tổng số 15 công bố khoa học gồm có 14

công bố khoa học “Ca chứng” (Case-control study) và 1 công bố khoa học “Đoàn hệ” (Cohort study)

Các dữ liệu được chọn lọc và trích xuất dữ liệu để thực hiện phân tích tổng hợp theo

một số chỉ số như sau:

− Chỉ số Proportion (Pr, đơn vị: %) thể hiện tần số xuất hiện tính chất biến thể (đột

biến) A1298C trên gen MTHFR và biến thể (đột biến) A66G gen MTRR trên bộ

mẫu khảo sát

− Chỉ số Odds radio (OR) thể hiện độ chênh về sự xuất hiện tính chất biến thể

A1298C trên gen MTHFR và biến thể A66G gen MTRR trên bộ mẫu khảo sát (bộ

mẫu bệnh phẩm) và bộ mẫu đối chứng

− Chỉ số Relative risk (RR) thể hiện mức nguy cơ mắc bệnh lý (bệnh lý huyết khối, huyết khối, khuyết tật ống thần kinh, đột quỵ, huyết khối, tiểu đường loại 2 )

khi bộ gen mang biến thể A1298C trên gen MTHFR và biến thể A66G gen MTRR

Trang 20 Bảng III.1 Bộ dữ liệu khoa học về dạng biến thể A1298C trên gen MTHFR

Trang 21 Bảng III.2 Bộ dữ liệu khoa học về dạng biến thể A66G trên gen MTRR