Phân tích tổng hợp tần suất xuất hiện biến thể gen MTHFR A1298C và MTRR A66G liên quan đến nguy cơ mắc bệnh tăng cholesterol máu và các bệnh lý tim mạch ở người Việt Nam

PHƯƠNG PHÁP

Đưa bộ dữ liệu vào phân tích tổng hợp nhằm tìm hiểu sự tương quan giữa đặc điểm phân tử và tần suất xuất hiện của các dạng biến thể (tính chất biến thể hoặc tính chất đột biến điểm) trên gen mục tiêu: MTHFR (biến thể A1298C), MTRR (biến thể A66G) và bệnh tăng cholesterol trong máu có tính gia đình hoặc một số bệnh lý về tim mạch, bệnh xơ vữa động mạch, bệnh mạch vành. Quá trình phân tích tổng hợp dựa vào phân tích tần suất đột biến (Proportion), chỉ số tỷ suất chênh (Odds ratio-OR) và chỉ số nguy cơ (Relative risk-RR) với khoảng tin cậy 95% (Confidence intervals-CIs) và giá trị p<0,05 trên mô hình ảnh hưởng ngẫu nhiên hoặc mô hình ảnh hưởng bất biến, bằng công cụ Medcalc (phiên bản 18.2.1). − Để đánh giá các cặp mồi, sử dụng phần mềm trực tuyến IDT analyzer (http://www.idtdna.com/analyzer/applications/oligoanalyzer/) nhằm xác định các thông số của mồi: chiều dài mồi, nhiệt độ nóng chảy,.

(1) Xác định chất lượng DNA bộ gen bằng phương pháp đo quang phổ: Hàm lượng DNA có thể xác định được nhờ sự hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260nm. Chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng PCR trong tổng thể tích 50 μl khuếch đại vùng trình tự exon 7 gen MTHFR bằng cặp mồi MTHFR_F2&MTHFR_R2 được tham khảo bởi nghiên cứu của Van der Put và cộng sự (1998), Li và cộng sự (2015) và vùng trình tự gen MTRR bằng cặp mồi MTRR_F5&MTRR_R5 được tham khảo bởi nghiên cứu của Gaughan và công sự (2001). - Đọc kết quả bằng máy đọc gel (Gel Doc XR, BioRad) với tác động của tia UV để quan sát sự hiện diện của các băng sản phẩm PCR và so sánh kích thước với thang chuẩn 50 bp.

Các mẫu sau khi điện di được các băng sản phẩm được tiến hành gửi mẫu giải trình tự đến công ty cổ phần công nghệ TBR với lựợng sản phẩm là 40 μl tương ứng với cặp mồi phù hợp.

PHẦN III. KẾT QUẢ-THẢO LUẬN

• KẾT QUẢ KHAI THÁC DỮ LIỆU VÀ PHÂN TÍCH TỔNG HỢP Chúng tôi thu thập được 168 công bố khoa học (93 công bố gen MTHFR A1298C và 75

Hơn nữa, nhằm làm rừ sự tương quan giữa tớnh chất đột biến A1298C trên gen MTHFR và các bệnh lý rối loạn chuyển hóa, chúng tôi phân tích chỉ số OR và RR về sự xuất hiện dạng biến thể (đột biến) A1298C trên gen MTHFR trên bộ mẫu bệnh phẩm so với bộ mẫu đối chứng đối với một số phân hạng: quần thể người bệnh, dạng biến thể,…. Do đú, cần để làm rừ mối tương quan giữa tớnh chất xuất hiện biến thể A1298C trên gen MTHFR và các dạng bệnh lý bệnh đột quỵ do xuất huyết, đột quỵ thiếu máu cục bộ, bệnh tiểu đường,…chúng tôi tiếp tục thực hiện phân tích tổng hợp với tiêu chí sử dụng phương pháp xác định chỉ số Proportion, OR và RR. Hơn nữa, có thể thấy được chỉ số OR và RR xét trên quần thể người châu Á đều biểu thị giá trị xấp xỉ> 1 nhưng có ý nghĩa thống kê, do vậy, các kết quả này phản ánh một phần liên quan của sự xuất hiện của dạng biến thể A1298C ở thể đột biến (AC và CC) và khả năng mắc các bệnh lý rối loạn chuyển hóa so với sự xuất hiện dạng biến thể A1298C ở thể hoang dại đối với quần thể người châu Á.

Nhằm mục đớch làm rừ hơn về sự tương quan của sự xuất hiện của dạng biến thể A1298C ở thể đột biến (AC và CC) và khả năng mắc các dạng bệnh lý rối loạn chuyển hóa chuyển hóa khác nhau, nội dung phân tích tổng hợp được thực hiện tập trung trên phân hạng bệnh lý được mô tả trong từng công bố khoa học, gồm có: huyết khối (Homocysteine), tim mạch, tiểu đường loại 2 (Tuýp 2), nhồi máu não, vô sinh nam và các bệnh lý khác (tiểu đường loại 2, tim mạch…). Đồng thời, dữ liệu về các trường hợp bệnh nhân mắc các bệnh lý khác (tiểu đường loại 2, nhồi máu não,..) được ghi nhận trong rất ít công bố khoa học (khoảng 1 công bố/nhóm phân hạng bệnh lý), do đó chỉ số Proportion xét trên các dạng bệnh lý này không có đủ dữ liệu (mô hình phân tích, tính bất đồng nhất của bộ dữ liệu,..). − Biến thể A1298C là dạng đột biến có tính trội, do đó với kết quả OR và RR xét giữa thể AC và CC có thể cho thấy số trường hợp bệnh nhân mắc các bệnh lý rối loạn chuyển hóa do mang biến thể dị hợp AC cao hơn 4,788 lần nhóm mang biến thể CC cũng như nguy cơ mắc các bệnh lý rối loạn ở các trường hợp mang thể dị hợp AC cao hơn thể đồng hợp CC là 3,408 lần.

Tuy nhiên, kết quả phân tích tổng hợp đã phản ánh khái quát được về sự khác biệt về độ chênh (1<OR<2) của sự xuất hiện biến thể (đột biến) A1298C gen MTHFR trên quần thể người bệnh rối loạn chuyển hóa so với người khỏe manh và nguy cơ mắc bệnh lý rối loạn chuyển hóa (1<RR<2) đối với các trường hợp mang biến thể (đột biến) A1298C gen MTHFR. Do đú, cần để làm rừ mối tương quan giữa tớnh chất xuất hiện biến thể A66G trờn gen MTRR và các dạng bệnh lý bệnh đột quỵ do xuất huyết, đột quỵ thiếu máu cục bộ, bệnh tiểu đường,…chúng tôi tiếp tục thực hiện phân tích tổng hợp với tiêu chí sử dụng phương pháp xác định chỉ số OR và RR trên bộ dữ liệu thuộc các nghiên cứu ca chứng. Hơn nữa, có thể thấy được chỉ số OR và RR xét trên quần thể người châu Á đều biểu thị giá trị xấp xỉ> 1 nhưng không có ý nghĩa thống kê, do vậy, các kết quả này phản ánh một phần liên quan của sự xuất hiện của dạng biến thể A66G ở thể đột biến (AG và GG) và khả năng mắc các bệnh lý rối loạn chuyển hóa so với sự xuất hiện dạng biến thể A66G ở thể hoang dại đối với quần thể người châu Á.

Nhằm mục đớch làm rừ hơn về sự tương quan của sự xuất hiện của dạng biến thể A66G ở thể đột biến (AG và GG) và khả năng mắc các dạng bệnh lý rối loạn chuyển hóa chuyển hóa khác nhau, nội dung phân tích tổng hợp được thực hiện tập trung trên phân hạng bệnh lý được mô tả trong từng công bố khoa học, gồm có: huyết khối (Homocysteine), tim mạch, tiểu đường loại 2 (Tuýp 2), nhồi máu não, vô sinh nam và các bệnh lý khác (tiểu đường loại 2, tim mạch…). Đồng thời, dữ liệu về các trường hợp bệnh nhân mắc các bệnh lý khác (tiểu đường loại 2, nhồi máu não,..) được ghi nhận trong rất ít công bố khoa học (khoảng 1 công bố/nhóm phân hạng bệnh lý), do đó chỉ số Proportion xét trên các dạng bệnh lý này không có đủ dữ liệu (mô hình phân tích, tính bất đồng nhất của bộ dữ liệu,..). Tuy nhiên, kết quả phân tích tổng hợp đã phản ánh khái quát được về sự khác biệt về độ chênh (1<OR<2) của sự xuất hiện biến thể (đột biến) A66G gen MTRR trên quần thể người bệnh rối loạn chuyển hóa so với người khỏe manh và nguy cơ mắc bệnh lý rối loạn chuyển hóa (1<RR<2) đối với các trường hợp mang biến thể (đột biến) A66G gen MTRR.

Dựa vào điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm của thuộc Khoa Công nghệ Sinh học, nhóm nghiên cứu chúng tôi lựa chọn phương pháp PCR kết hợp giải trình tự để dự kiến đưa vào nội dung phân tích thực nghiệm, nhằm mô tả đặc điểm vùng trình tự MTHFR bao quanh vị trí biến thể A1298C trên một số mẫu bệnh phẩm ở Việt Nam. Công bố khoa học của Van der Put và cộng sự (1998), Li và cộng sự (2015) xác định trên sản phẩm gen mục tiêu MTHFR A1298C và công bố khoa học của Gaughan và cộng sự (2001) xác định sản phẩm gen mục tiêu MTRR A66G thuộc các bộ mẫu bệnh phẩm có liên quan đến bệnh lý rối loạn chuyển hóa như: khuyết tật ống thần kinh, huyết khối,…thực hiện bằng phương pháp PCR-RPLF. Các công bố khoa học của Van der Put và cộng sự (1998), Li và cộng sự (2015), Gaughan và cộng sự (2001) đều sử dụng phương pháp PCR-RPLF để ghi nhận đặc điểm biến thể trên trình tự mục tiêu: gen MTHFR với biến thể A1298C hoặc gen mục tiêu MTRR với biến thể A66G trên nguồn bệnh phẩm máu của các bệnh nhân mắc bệnh lý thuộc nhóm rối loạn chuyển hóa: khuyết tật ống thần kinh, huyết khối,… Kế thừa kết.

Tuy nhiên, để thích ứng với điều kiện khách quan và hướng chung của nhóm nghiên cứu, chuyên đề khóa luận này tập trung khảo sát đặc điểm biến thể trên trình tự gen MTHFR với biến thể A1298C hoặc gen mục tiêu MTRR với biến thể A66G bằng quy trình PCR kết hợp giải trình tự đối với một số mẫu bệnh phẩm có chỉ số cholesterol tổng số >5mmol/L máu.