BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH --- ∞0∞--- ĐÀO THỊ TRÀ MY KHẢO SÁT TÍNH CHẤT BIỂU HIỆN CỦA microRNA-155 VÀ EBNA-1 TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ VÒM HỌNG Ở VIỆT N
TỔNG QUAN
TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ
1.1 Khái niệm về ung thư
Ung thư là một nhóm bệnh được phát hiện ở hầu hết các cơ quan hoặc mô của cơ thể khi các tế bào của chúng phân chia một cách mất kiểm soát Các tế bào ung thư có khả năng di chuyển, xâm lấn đến các cơ quan khác (National Cancer Institute) Ung thư được bắt nguồn dựa trên sự phân loại của tế bào phân chia bất thường như: Ung thư biểu mô (Carcinoma): ung thư được bắt nguồn trong da hay các mô lót phủ trong các cơ quan của cơ thể, chẳng hạn như ung thư cổ tử cung, ung thư da, ung thư vòm họng, ung thư gan,… (National Cancer Institute); Ung thư mô liên kết (Sarcoma): đây là loại ung thư hiếm gặp, bắt nguồn từ xương, sụn, mạch máu hay các mô liên kết khác (Bartel và cs, 2004); Bệnh bạch cầu (Leukemia): ung thư bắt nguồn từ trong mô máu như tủy xương, sản xuất lượng lớn các tế bào máu bất thường (Barber và cs, 2005); Ung thư hệ thần kinh: ung thư bắt nguồn từ trong các mô hệ thần kinh, não và tủy sống (Bartel và cs, 2009) U lympho bào, tủy (Lymphoma): ung thư bắt nguồn từ các tế bào thuộc hệ miễn dịch của cơ thể (Benson và cs, 2008)
1.2 Tình hình ung thư trên thế giới và Việt Nam
Theo thống kê của cơ quan GBD (Global Burden of Diseases, Injuries, and Risk Factors Study), năm 2020, số ca mắc ung thư trên toàn cầu đã tăng lên 19,3 triệu ca
Hình 1.1 Tỷ lệ ca mắc mới (incidence) và tỷ lệ tử vong (mortality) do ung thư trên cả hai giới tính của từng khu vực trên thế giới
5 trong đó (phụ nữ chiếm hơn 9,2 triệu ca, nam giới chiếm hơn 10 triệu ca) và 10 triệu ca tử vong do ung thư vào năm 2020 (Globocan, 2020) Ung thư vú đại diện cho 1 trong 4 bệnh ung thư được chẩn đoán ở phụ nữ trên toàn cầu Ung thư đại thực tràng, phổi, cổ tử cung và tuyến giáp cũng phổ biến ở phụ nữ Ungqq thư phổi và ung thư tuyến tiền liệt là những bệnh phổ biến nhất ở nam giới, chiếm gần một phần ba tổng số ca ung thư ở nam giới (Globocan, 2020) Đến nay, số lượng ca ung thư trên thế giới ngày càng gia tăng và trở thành một vấn đề cấp thiết toàn cầu Tại Việt Nam, theo thống kê của Bộ Y Tế và Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization, WHO), mỗi năm Việt Nam có khoảng 180.000 ca mắc mới và trên 120.000 trường hợp tử vong do ung thư (Globocan, 2020).
TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ VÒM HỌNG
2.1 Sơ lược về ung thư vòm họng
Ung thư vòm họng là bệnh phổ biến ở Đông Nam Á, Bắc Phi và Nam Trung Quốc, do đặc điểm xâm lấn cao ở giai đoạn cuối và vị trí khối u khó phát hiện Các dấu chứng sinh học như miRNA có vai trò quan trọng trong chẩn đoán và phát hiện sớm ung thư vòm họng, giúp nâng cao cơ hội cứu sống bệnh nhân.
Hình 1.2 Vị trí giải phẫu của ung thư vòm họng
Ung thư vòm họng thường xuất hiện ở phần trên cùng của hầu, nằm sau khoang mũi, có thể lan rộng vào khoang mũi, vòm họng và hộp sọ Khi lan vào nền sọ, khối u gây chèn ép dây thần kinh sọ não Các triệu chứng phổ biến của ung thư vòm họng bao gồm: nổi hạch ở cổ, chảy máu mũi, tắc mũi, nghẹt một bên tai, và khạc ra máu.
2.2 Tình hình ung thư vòm họng trên thế giới và Việt Nam
Theo nghiên cứu của (Yap và cs, 2007), nhóm nghiên cứu nhận thấy rằng ung thư vòm họng là dạng ung thư hiếm trên thế giới Tuy nhiên, ung thư vòm họng lại rất phổ biến tại Trung Quốc, Đông Nam Á (đặc biệt là Việt Nam), Châu Phi, Canada, Alaska và Greenland Eskimos Theo thống kê của cơ quan nghiên cứu ung thư Quốc tế (International Agency for Research on Cancer, IARC), năm 2020, số lượng ca mắc bệnh ung thư vòm họng và tử vong lần lượt là 133.354 và 80.008 trường hợp (Globocan, 2020) Ở Việt Nam, ung thư vòm họng là loại ung thư đứng đầu trong các loại ung thư vùng đầu cổ với tỷ lệ mắc bệnh ung thư vòm họng tính đến năm 2020 là 5,3% và tỷ lệ tử vong hằng năm 3,3% (Globocan, 2020) Ngoài ra, tỷ lệ ca mắc mới
Hình 1.3 Bản đồ về tỷ lệ ung thư vòm họng trên thế giới (Globocan, 2020)
7 ở nam giới và nữ giới ở Việt Nam lần lượt là 8,1% và 2,8%, gấp khoảng 2,89 lần ở nam giới so với nữ giới (Globocan, 2020)
Ba nguyên nhân chính gây nên ung thư vòm họng, bao gồm: (1) sự xâm nhiễm của EBV (Epstein-Barr Virus); (2) yếu tố di truyền, hiện tượng epigenetics; (3) yếu tố môi trường (Zeng và cs, 2010)
Epstein-Barr Virus là một loại herpesvirus hiện diện ở hơn 90% người trưởng thành trên toàn thế giới, có tính chất mạn tính hoặc nhiễm cấp thời Nghiên cứu của (Chou và cs, 2008), cho thấy có khoảng trên 95% các mô ung thư có dương tính với EBV Sự hiện diện của EBV ở giai đoạn đầu dưới dạng tiềm tan và chỉ biểu hiện bệnh khi các gene virus (EBNA-1, LMP, BARTs,…) chuyển sang trạng thái hoạt động (dạng tan) nhằm giúp chúng nhân lên và gây nhiễm Lúc này, chúng sẽ gây biến đổi mô, tế bào của cơ thể, phát triển thành khối u ác tính (Chou và cs, 2008)
Các hiện tượng epigenetics có vai trò rất quan trọng trong việc hình thành và phát triển ung thư (Shenouda và cs, 2009) Hiện tượng epigenetics bao gồm các quá trình: methyl hóa, biến đổi protein histon và miRNA (Shenouda và cs, 2009) Trong đó, miRNA điều hòa biểu hiện gene bằng cách gắn vào vùng 3'-UTR của các mRNA đích (target mRNA) của chúng, kết quả là sự ức chế hoặc giảm chức năng của mRNA đích, được chứng minh là có liên quan đến một loạt các quá trình sinh học như tế bào phân chia, gia tăng, phân biệt, apoptosis, di căn, phản ứng stress, (Bartel và cs, 2009)
Yếu tố môi trường cũng được nhiều công trình nghiên cứu chứng minh có vai trò trong việc hình thành khối u vòm họng Điển hình, sự khác biệt về khu vực địa lý, thói quen sinh hoạt,… dẫn đến ung thư vòm họng tại các khu vực khác nhau trên thế giới Theo (Yu và cs, 2002) các món ăn truyền thống của miền Nam Trung Quốc, chẳng hạn như món cá muối của Quảng Đông và các thực phẩm bảo quản chứa chất dễ bay hơi nitrosamine là yếu tố gây ung thư vòm họng (Mimi và cs, 2002) Các yếu tố khác bao gồm hút thuốc, bụi và các hợp chất hoá học như là formaldehyde cũng
8 được cho là có liên quan đến ung thư vòm họng (Huang và cs, 2018; Zeng và cs, 2010).
MicroRNA (miRNA)
3.1 Quá trình sinh tổng hợp miRNA
MicroRNA (miRNA) là các phân tử RNA không mã hóa, dài 19-25 nucleotide, đóng vai trò điều hòa sau phiên mã, biểu hiện gen ở tế bào eukaryote Ước tính có từ 1-5% bộ gene người mã hóa miRNA, điều hòa ít nhất 30% tổng lượng RNA được tạo ra miRNA được phát hiện vào năm 1993, hiện tại đã có hơn 20.000 miRNA được tìm thấy ở 193 loài khác nhau, trong đó gần 1.000 miRNA ở người Thông tin về miRNA được lưu trữ tại cơ sở dữ liệu miRbase (http://www.mirbase.org/).
Hình 1 4 Con đường sinh tổng hợp của miRNAs
Quá trình sinh tổng hợp miRNA bao gồm các sự kiện xảy ra trong nhân và sau đó xảy ra trong tế bào chất (Khoo và cs, 2013; Kim và cs, 2009) Ở giai đoạn trong nhân, các gene mã hóa cho miRNA hay các vùng intron mã hóa (coding intron) được phiên mã bởi RNA polymerase II tạo thành phân tử miRNA sơ cấp (primary miRNA, pri-miRNA) Về cấu trúc, phân tử pri- miRNA chứa một đến hai cấu trúc kẹp tóc
(Khoo và cs, 2013) Các phân tử pri-miRNA đầu 5’ được gắn mũ chụp và đầu 3’ có cấu trúc dạng poly (A) (Zen và cs, 2012)
Các phân tử pri-miRNA ban đầu được biến đổi thành pre-miRNA (miRNA tiền thân) với cấu trúc thứ cấp dài khoảng 70 nucleotide, có đầu 5' phosphate và đầu 3' nhô ra 2 nucleotide Quá trình này đòi hỏi sự tham gia của enzym Drosha, chỉ hoạt động khi tạo thành phức hợp với protein dsRBD Pasha (ở ruồi giấm) hoặc DGCR8 (ở động vật có vú), cắt pri-miRNA thành pre-miRNA.
Phân tử pre-miRNA được tạo thành, đầu 3’ có 2 nucleotide nhô ra, sẽ được phân tử exportin-5 nhận diện và vận chuyển ra khỏi nhân, vào trong tế bào chất Ở giai đoạn xảy ra trong tế bào chất, pre-miRNA biến đổi tiếp theo thông qua con đường RAN-GTP (RAs-related Nuclear – GTP pathway) (Okada và cs, 2009; Plieskatt và cs, 2014) Khi đi vào trong tế bào chất, pre-miRNA tiếp tục bị cắt bởi phân tử Dicer có tạo thành miRNA dạng mạch đôi có chiều dài khoảng 18 - 25bp (Mimi và cs, 2002) Tiếp theo, phân tử miRNA mạch đôi được tháo xoắn, một trong hai mạch sẽ bị phân hủy nhanh chóng, mạch còn lại chính là miRNA trưởng thành (Cifuentes và cs, 2010; Filipowicz và cs, 2008)
3.2 Cơ chế điều hoà của miRNA
Trong ung thư, cơ chế phân tử của miRNA đóng vai trò ở hai trạng thái: vai trò sinh ung (oncogenic miRNA) và vai trò ức chế khối u (tumor suppressor miRNA) Nếu một miR được biểu hiện dư và ức chế quá trình tổng hợp một hoặc nhiều protein ức chế khối u đó là các miR gây ung thư (oncogenic miR) Nếu một miR được biểu hiện thiếu và ức chế sự tổng hợp một hay nhiều protein gây ung thư đó là miR ức chế khối u (tumor suppressor miR) (Sun và cs, 2013; Zen và cs, 2012)
Các phân tử miRNA tham gia vào quá trình điều hoà âm sự biểu hiện gene bằng gắn vào đầu 3’ vùng không dịch mã (3’UTR) của mRNA, làm cho mRNA bị phân huỷ hoặc sự dịch mã xảy ra trên phân tử mRNA này bị khoá (Zeng và cs, 2010)
Hình 1 5 Sự bắt giữa miRNA và mạch mRNA đích
Giai đoạn đầu tiên, miRNA trưởng thành gắn kết với protein Ago (là nhân tố khởi đầu dịch mã 2C2 – eIF2C2 ở eukaryote) và phức hợp RISC để tạo thành phức hợp miRNA-RISC (RNA-induced silencing complex) (Lao và cs, 2021) Phức hợp miRNA-RISC gắn lên vùng 3’UTR của mRNA thông qua sự bắt cặp bổ sung của các base giữa mRNA với trình tự trên mạch dẫn (guide strand) của phân tử miRNA theo nguyên tắc bổ sung (Sun và cs, 2013) Sự nhận diện này phụ thuộc rất nhiều vào sự bắt cặp bổ sung của base giữa vùng “seed” (vùng trung tâm) trên phân tử miRNA (Filipowicz và cs, 2008; Lao và cs, 2021) Vùng “trung tâm” là vùng trình tự nằm ở đầu 5’ phân tử miRNA có kích thước 2-7 nucleotide (Filipowicz và cs, 2008; Jiang và cs, 2015; Sun và cs, 2013)
Sự bắt cặp giữa các cặp base giữa vùng “trung tâm” với vùng trình tự trên mRNA có thể trùng khớp hoàn toàn hoặc không trùng khớp hoàn toàn và quyết định tính ổn định tương tác giữa miRNA với mRNA (Lao và cs, 2021; Zou và cs, 2019) Một phân tử miRNA có khả năng điều hoà nhiều trình tự mRNA đích (Lao và cs, 2021)
3.3 Sự biểu hiện miRNA-155 trong nhiều loại ung thư khác nhau
Cho đến nay, nhiều nghiên cứu đã chứng minh biểu hiện của miRNA là một đặc điểm đặc trưng cho sự hình thành khối u Sự biểu hiện quá mức của miRNA có vai trò như các gene ức chế khối u, điều hoà làm giảm các protein có hoạt tính sinh ung
11 thư Ngoài ra, miRNA hoạt động như oncogenes, ức chế các hoạt động của các gene ức chế khối u dẫn tới quá trình tăng sinh, hình thành mạch máu và sự xâm lấn (Shenouda và cs, 2009; Zhang và cs, 2007) Trong đó, có nhiều nghiên cứu chứng minh miRNA-155 có liên quan đến các loại ung thư ở người, bao gồm ung thư vòm họng (Faraoni và cs, 2009, Yang và cs, 2015; Zou và cs, 2019), ung thư biểu mô tuyến giáp (Faraoni và cs, 2009; Xue và cs, 2016), ung thư ruột kết (Faraoni và cs, 2009), ung thư cổ tử cung (Faraoni và cs, 2009, Wang và cs, 2016), ung thư biểu mô tuyến tụy (Faraoni và cs, 2009; Huang và cs, 2018), ung thư phổi (Faraoni và cs, 2009, Wang và cs, 2018),… (bảng 1.1) Nó có vai trò kép trong sự hình thành khối u của người: có chức năng như là chất sinh ung thư hoặc ức chế khối u ở các khối u ác tính ở người
Bảng 1 1 Sự biểu hiện của miRNA-155 trong nhiều loại ung thư khác nhau
Loại ung thư Sự biểu hiện / vai trò Gene đích Con đường tín hiệu
(Faraoni và cs, 2009; Yang và cs, 2015; Zou và cs, 2019)
Ung thư biểu mô tuyến giáp
(Faraoni và cs, 2009, Xue và cs, 2016)
(Al-Haidari và cs, 2017; Faraoni và cs, 2009)
Ung thư cổ tử cung
Giảm/ tumor suppressor PDK1 AKT/mTOR
(Faraoni và cs, 2009; Wang và cs, 2016)
Ung thư biểu mô tuyến tụy
Giảm/ tumor suppressor SOCS1 STAT3
(Faraoni và cs, 2009; Huang và cs, 2018)
(Faraoni và cs, 2009; Wang và cs, 2018)
3.4 miRNA-155 biểu hiện trong ung thư vòm họng miRNA-155 do gene không mã hoá dài 65 nucleotide, có định vị trên nhiễm sắc thể số 21, vị trí bắt đầu từ 25.573.980 và kết thúc tại vị trí 25.574044 Sản phẩm pre-miR-155 dài 62 nucleotide; trong khi miRNA-155 trưởng thành dài 23 nucleotide Trình tự miR-155 không tương đồng với hầu hết các trình tự miRNA khác đã được công bố Ngoài ung thư vòm họng, miRNA-155 cũng được ghi nhận biểu hiện cao ở các loại ung thư khác như: ung thư biểu mô tuyến giáp, ung thư ruột kết, ung thư cổ tử cung, ung thư phổi (Faraoni và cs, 2009) Một số chức năng điển hình của miRNA-155 có thể ghi nhận như kháng apoptotic, di căn và xâm lấn trên nhiều khối u miRNA-155 biểu hiện khác biệt có liên quan đến sự tiến triển của ung thư, thúc đẩy sự tăng sinh, ức chế chương trình chết của tế bào Theo Yang và cộng sự,
2015, miRNA-155 có thể làm điều hoà giảm trên gene UBQLN1 Thông qua việc giảm sự biểu hiện của gene UBQLN1, miRNA-155 có thể tăng cường khả năng sống sót của tế bào ung thư vòm họng và thay đổi chu trình tế bào nhằm tăng khả năng
13 kháng phóng xạ Theo Du và cộng sự, 2011, sự điều hoà giảm của 2 gene JMJD1A và BACH1 dự đoán khả năng sống sót kém trong ung thư vòm họng và đây có thể ứng dụng làm dấu chứng sinh học Theo Hui và cộng sự, 2017, trong ung thư vòm họng ở các giai đoạn bệnh lý khác nhau và sự thiếu hụt BCAT1 làm giảm sự tăng sinh tế bào khối u và giảm khả năng di chuyển và xâm lấn của tế bào Sự biểu hiện của miRNA-155 được chứng minh là biểu hiện dư trong các mẫu mô UTVH dương tính với EBV Sự biểu hiện mạnh mẽ của miRNA-155 được quan sát trong các tế bào khối u UTVH, trong khi miRNA-155 có biểu hiện yếu trong các mẫu biểu mô vòm họng bình thường (Thuận và cs, 2019; Du và cs, 2011)
EPSTEIN-BARR VIRUS
Virus Epstein-Barr (EBV) là virus khối u đầu tiên ở người được phát hiện, mang lại sự quan tâm đáng kể về mầm bệnh ung thư và quá trình nhiễm kéo dài của herpesvirus (Cohen và cs, 1991) EBV thuộc nhóm herpesvirus type 4, họ herpesviridae, được phát hiện bởi Epstein và Barr vào năm 1964 ở mô trong khối u của một bệnh nhân bị mắc ung thư hạch Burkitt ở Châu Phi (Epstein và cs, 1964) Năm 1984, Baer và cộng sự cho thấy rằng EBV đã xuất bản bộ gene được giải trình tự hoàn toàn của EBV, đây cũng là virus herpesvirus đầu tiên có bộ gene được giải trình tự hoàn toàn, nó có nguồn gốc từ một bệnh nhân bị mắc bệnh bạch cầu đơn nhân nhiễm trùng (Baer và cs, 1984), công trình này cũng là bước mở đầu tạo ra tiền đề to lớn cho việc nghiên cứu EBV và UTVH sau này Gần đây, việc nhiễm EBV gần như là rất phổ biến, phần lớn bị nhiễm suốt đời và không gây ra triệu chứng, nó ảnh hưởng đến tất cả các nhóm người (Young và cs, 2004; Tao và cs, 2006)
EBV gồm bộ gen ADN sợi đôi, xoắn và mạch hở có kích thước 170.180 kb Virus tồn tại ở hai dạng: episome (dạng vòng) và mạch thẳng Dạng episome xuất hiện khi virus chuẩn bị vào giai đoạn tan và dạng mạch thẳng có mặt sau khi tế bào bị nhiễm Về cấu trúc, EBV có dạng khối cầu với vỏ capsid, vỏ ngoài và bộ gen nằm bên trong.
Trong in vitro, tế bào lymphoblastoid bị nhiễm trùng vĩnh viễn (LCL) được
EBV chuyển đổi hiệu quả các tế bào B đang nghỉ ngơi thành các dòng (Tao và cs,
Các tế bào Lympho B mang gen tiềm ẩn của EBV (LCLs) được đặc trưng bởi sự hiện diện của nhiều bản sao DNA virus hình tròn (episomes) trong mỗi tế bào và biểu hiện bộ gen của virus Các episomes này chứa các kháng nguyên hạt nhân EBNAs (-1, -2, -3A, -3B, -3C, và -LP) và 3 protein màng tế bào tiềm ẩn.
LMPs (-1, -2A và -2B) Ngoài các protein tiềm ẩn, LCL cũng cho thấy sự biểu hiện đa dạng của các RNA nhỏ mã hóa EBV không được polyadenyl hóa (EBER) là
EBER1 và EBER2 và ba protein thuộc họ BARTs là RPMS1, A73, BARF0; những protein này được thể hiện trong tất cả các dạng nhiễm EBV tiềm ẩn và chúng cũng là mục tiêu đáng chú ý để phát hiện EBV trong các khối u (Tao và cs, 2006; Young và cs, 2004, Rickinson và cs, 2001)
Các gene trong EBV đều có chức năng riêng và bổ trợ lẫn nhau Sáu gene mã hóa cho protein kháng nguyên nhân EBNAs có liên quan đến quá trình xâm nhiễm và nhân lên của EBV ở giai đoạn đầu Ngoài ra, sự phối hợp hoạt động của các kháng nguyên hạt nhân giúp kiểm soát biểu hiện gene của virus và vật chủ thông qua việc tương tác trực tiếp với các mạch điều khiển tế bào trong nhân; ba gene mã hóa cho
Hình 1 6 Cấu trúc hệ gene của EBV (Price, A M và cs, 2014)
15 protein màng LMPs chịu trách nhiệm cho việc kích hoạt và sống sót của tế bào B là mô phỏng của các protein tín hiệu tế bào, liên quan đến chu trình tăng trưởng của EBV trong tế bào B và có thể kích thích tạo u, góp phần khiến u lành trở thành u ác tính; ngăn chặn quá trình apoptosis và sản sinh IL-10 (interleukin 10) là chức năng của hai gene không mã hóa RNA EBER (Cohen và cs, 1991; Muray và cs, 2001) và ba protein thuộc họ BARTs liên quan đến đường truyền tín hiệu Notch, điều hòa lượng
Ca 2+ trong tế bào (Al-Mozaini và cs, 2009; Brooks và cs, 1993; Smith và cs, 2000) Ở cơ thể người sau khi bị xâm nhiễm, EBV có 3 hướng tiến triển Hướng đầu tiên, EBV xâm nhập vào tế bào biểu mô, ở đây chúng tìm thấy các điều kiện thích ứng và bắt đầu nhân lên, tạo ra vô số vòng đời sau hoặc EBV có thể chuyển từ sơ nhiễm sang gây nhiễm thứ cấp bằng cách nhân lên mãnh liệt trong lympho B, sau đó giải phóng virus vào nước bọt, hoặc chuyển từ sơ nhiễm sang tàng nhiễm và tiến đến ung thư Hướng thứ hai, EBV gây sơ nhiễm và xâm nhập vào tế bào lympho B, tiếp đó thực hiện sự nhân lên: EBV sơ nhiễm sẽ tìm đến tế bào lympho B vùng họng để xâm nhập và nhân lên trong tế bào này Virus sẽ được giải phóng ra hàng loạt bằng cách dung giải tế bào, chúng xâm nhiễm vào quần thể lympho B và gây nhiễm thứ cấp, kết quả là một lượng virus EBV được giải phóng và có nhiều trong nước bọt Lúc này, EBV quay lại gây nhiễm cho tế bào biểu mô Hướng thứ ba, EBV tàng nhiễm và tiến triển thành ung thư khi có điều kiện: EBV thực hiện gây nhiễm bán sinh sản và tàng nhiễm trong tế bào lympho B, thực hiện quá trình chuyển đổi lympho
B và biệt hóa, khiến chúng tăng sinh và tiến triển thành ung thư (Phúc và cs, 2008)
Hiện nay, nghiên cứu các gene của EBV được xem là mục tiêu nhắm đến để tìm ra các phương pháp sàng lọc, chẩn đoán cho bệnh nhân UTVH bằng phương pháp sinh học phân tử Hướng nghiên cứu hướng tới đa dạng như nghiên cứu đột biến, biểu hiện gene, tính đa hình,…và nhiều dạng khác, giúp cơ sở dữ liệu về EBV ngày càng đầy đủ và làm rõ ràng hơn mối quan hệ giữa EBV và UTVH.
GENE EBNA-1 (Epstein-Barr Nuclear Antigene-1)
Epstein–Barr nuclear antigene 1 (EBNA-1) mã hóa cho kháng nguyên duy nhất biểu hiện ở tất cả những dạng tiềm tan của EBV, trong các tế bào tăng sinh mà có
EBV-1 liên quan đến quá trình sao chép và phân chia nguyên phân của đoạn EBV, đảm bảo sự tồn tại ổn định của đoạn gen EBV trong sự phát triển của khối u EBNA-1 cũng kích hoạt phiên mã các gen EBV tiềm ẩn khác, đóng vai trò quan trọng trong sự bất tử của tế bào Những chức năng này liên quan đến việc liên kết EBNA-1 với các vị trí DNA cụ thể trên đoạn khởi nguồn sao chép DNA EBV (oriP), được xác định bằng cách sàng lọc các đoạn DNA EBV để chúng có thể sao chép và duy trì sự ổn định của plasmid trong tế bào người bị nhiễm EBV.
Cấu trúc của một Protein EBNA-1 bao gồm các Domain: Vùng giàu Gly–Arg
(Gly–Arg-rich regions), hai vùng lặp Gly–Ala (Gly–Ala repeat), Vùng gắn kết USP7 (USP7 binding sites) và vùng nhị hóa và gắn kết với DNA (DNA binding and dimerization domain)
Hình 1 7 Cấu trúc của Protein EBNA-1
Trong đó vị trí của vùng gắn kết với USP7 ở vị trí từ amino acid thứ 442 cho tới amino acid 450 có tác dụng liên kết với gene USP7 một gene có chức năng ức chế tăng trưởng tế bào và điều hòa apoptosis trên oriP và từ đó ức chế khả năng nhân đôi của DNA (Holowaty và cs, 2003) EBNA-1 thực hiện chức năng nhân đôi qua việc liên kết với một oriP (origin of plasmid) Các nghiên cứu sau đó cho thấy rằng protein virus duy nhất cần thiết cho sự sao chép của plasmid oriP là EBNA-1 Cả hai đoạn EBV và plasmid oriP đều được phát hiện sao chép một lần mỗi chu kỳ tế bào và khả năng sao chép DNA của oriP bắt nguồn từ cấu trúc
An oriP consists of two main components: the dyad symmetry (DS) element and the family of repeats (FR) The DS contains four EBNA-1 recognition sites, two of which are located within the first 65 bp of the DS The DS serves as the origin of replication within oriP.
17 cs, 1989) và đã được chứng minh là cần thiết để sao chép plasmid với sự hiện diện của EBNA-1 Phần thứ 2 là family of repeats (FR) mỗi FR sẽ bao gồm 20 EBNA-1 binding site, với mỗi EBNA-1 binding site sẽ là một đoạn trình tự dài 30 bp chức năng chính của FR là duy trì sự phiên mã của EBV (Hodin và cs, 2013)
Hình 1 8 Cấu trúc của 1 oriP
Trong khi EBNA-1 là protein EBV duy nhất tham gia vào quá trình sao chép
DNA ở pha tiềm tan thì nó thiếu bất kỳ hoạt động nào của enzyme, bao gồm cả DNA helicase thường được tìm thấy trong các loại Virus khác, việc này làm cho EBV phải dựa vào các protein tế bào vật chủ để tái tạo các episomes của nó
Các nghiên cứu sau này đã cho thấy chức năng của USP7 đến các protein như P53,
MDM2 và EBNA-1 có chức năng điều hòa các Protein như P53, MDM2 và EBNA-1, phần đầu TRAF của USP7 có khả năng liên kết với cả 3 Protein P53, MDM2 và
EBNA-1 làm gia tăng sự ổn định của các Protein bằng cách loại bỏ các chuỗi polyubiquitin thường báo hiệu sự suy thoái, tuy nhiên do ái lực của EBNA-1 lớn 2 Protein còn lại nên EBNA-1 thường xảy ra liên kết với USP7, điều này dẫn tới việc thiếu ổn định của Protein ức chế khối u P53 và MDM2 và làm khối u phát triển hơn so với các mẫu chứng ở các thực nghiệm có liên quan tới 3 Protein P53, MDM2 và
Hình 1 9 Cấu trúc của USP7
CHỨNG NỘI
Housekeeping gene là một nhóm các gene thiết yếu để duy trì các chức năng cơ bản của tế bào, cần thiết cho sự tồn tại của một tế bào, bất kể vai trò cụ thể của nó trong mô và sinh vật cụ thể Chúng được thể hiện trong tất cả các tế bào của sinh vật trong điều kiện bình thường, không phân biệt loại mô, giai đoạn phát triển, trạng thái chu trình tế bào hoặc các tác động bên ngoài (Koonin và cs, 2000; Fraser và cs, 1995; Eisenberg và cs, 2013)
Housekeeping gene được sử dụng rộng rãi như là chứng nội cho các nghiên cứu thực nghiệm (northern blotting, western blotting, PCR, qPCR,…) (Thellin và cs, 1999) Nó thường được cho là có tính tương đối ổn định ở trong tất cả các loại tế bào của cơ thể và duy trì các chức năng cơ bản của tế bào (Lin và cs, 2012)
U6 snRNA là loại snRNA không mã hóa, có cấu trúc là U6 snRNP U6 snRNP tập hợp một nhóm các RNA nhỏ nằm trong "splicing speckles" và "Cajal bodies" trong nhân của tế bào nhân chuẩn Trình tự chuỗi U6 snRNA là trình tự được bảo tồn cao nhất trong số năm trình tự snRNA liên quan đến spliceosome, cho thấy rằng U6 snRNA không thay đổi đáng kể trong quá trình tiến hóa.
Các chứng nội của phân tử RNA có biểu hiện cao và ổn định trong các mẫu nghiên cứu chủ yếu là 5S rRNA, 5,8S rRNA, 18S rRNA, U6 snRNA, U87scaRNA
Do đó, nhóm nghiên cứu chọn U6 snRNA là chứng nội trong qPCR (Copela và cs, 2008; Michael và cs, 2003; Hellwig và cs, 2008; Fok và cs, 2006).
PHƯƠNG PHÁP PCR VÀ RT-PCR
Polymerase Chain Reaction (PCR) là phương pháp tạo dòng DNA in vitro để tổng hợp nhanh một đoạn DNA với độ nhạy rất cao Phương pháp PCR dựa trên hoạt động của DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA mới từ mạch khuôn Enzyme DNA polymerase xúc tác phản ứng tổng hợp mạch DNA mới từ mạch khuôn với sự hiện diện của mồi chuyên biệt Đó là những đoạn oligonucleotide ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với DNA mạch khuôn Hai mồi bắt cặp bổ sung với hai đầu của trình tự DNA mạch khuôn: mồi xuôi (forward primer) và mồi ngược (reverse primer) DNA polymerase sẽ kéo dài đoạn trình tự giữa hai mồi để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh (Saiki và cs, 1985; Vân, 2009)
Hình 1 10 Nguyên tắc của phương pháp PCR
Một phản ứng PCR là một chuỗi lặp lại liên tục của nhiều chu kì, mỗi chu kì gồm 3 giai đoạn: (1) Giai đoạn biến tính (denaturation): tách chuỗi DNA từ mạch đôi thành mạch đơn (2) Giai đoạn bắt cặp (annealing): mồi được bắt cặp với trình tự theo nguyên tắc bổ sung (3) Giai đoạn kéo dài (extension): tổng hợp chuỗi DNA mới, Sau n chu kỳ tạo được một lượng lớn bản sao 2 n giống chuỗi DNA gốc (Saiki và cs, 1985)
7.2 Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
RT-PCR là phương pháp PCR mà trình tự nucleotide đích cần phải phát hiện là RNA Thực hiện được phương pháp này trước hết RNA đích phải được phiên mã ngược (RT, reverse transcription) thành cDNA, dùng PCR để khuếch đại trình tự đích trong cDNA bằng cặp mồi đặc hiệu hoặc ngẫu nhiên Enzyme được làm trong giai đoạn này là Reverse transcriptase, sử dụng mạch đơn RNA làm sợi khuôn để tổng hợp nên sợi DNA bổ sung (cDNA, complementary DNA), giai đoạn RT còn được gọi là giai đoạn tổng hợp cDNA Để enzyme reverse transcriptase có thể tổng hợp mạch đơn RNA từ sợi khuôn thành cDNA, cần phải có mồi (đặc hiệu hoặc ngẫu nhiên), tiếp đến mồi sẽ bắt cặp bổ sung trên sợi khuôn RNA để enzyme reverse trancriptase trượt trên mạch khuôn RNA và kéo dài được mạch cDNA (Haddad và cs, 2010)
Hình 1 11 Nguyên tắc của phương pháp RT-PCR
21 Để khuếch đại cDNA này, mồi được sử dụng trong giai đoạn RT có thể là mồi đặc hiệu cho trình tự RNA, mồi sẽ được thiết kế chuyên biệt cho trình tự RNA nhất định và khuếch đại được đoạn RNA mong muốn (Haddad và cs, 2010).
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
VẬT LIỆU
1.1 Các trang web và phần mềm được sử dụng
Cơ sở dữ liệu NCBI (National Center for Biotechnology Information) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/): là một cơ sở dữ liệu về sinh học dùng cho việc khai thác thông tin
Cơ sở dữ liệu miRBase (https://mirbase.org/): là một cơ sở dữ liệu về sinh học lưu trữ các chú thích và trình tự các chuỗi microRNA công khai Mỗi một thành phần trong cơ sở dữ liệu miRBase đại diện cho một trình tự hairpin (trình tự cấu trúc kẹp tóc) dự đoán của một phiên mã, kèm theo các thông tin về vị trí và thứ tự của chuỗi miRNA trưởng thành
Phần mềm trực tuyến TargetScan 8.0 hỗ trợ dự đoán các vị trí bắt cặp bổ sung của miRNA trên phân tử mRNA đích của chúng.
Pictar (http://www.pictar.mdc-berlin.ed/); miRTarBase
(https://mirtarbase.cuhk.edu.cn/~miRTarBase/miRTarBase_2022/php/index.php): là các phần mềm trực tuyến, nhằm dự đoán các trình tự đích (mRNA) của miRNA
Phần mềm Annhyb phiên bản 4.946 (Olivier Faird, 2012): là phần mềm dùng thực hiện các thao tác xử lý trên các trình tự nucleotide, bao gồm các tính năng như đọc trình tự, chú thích trình tự, tìm kiếm và sắp xếp các trình tự oligonucleotide,…
Phần mềm Clustal X 2.0: là phần mềm dùng để so sánh nhiều trình tự nucleotide hay amino acid, kết quả của việc so sánh này giúp cho người nghiên cứu có thể tìm ra các vùng bảo tồn hay biến động giữa các trình tự với nhau
Cơ sở dữ liệu miRDB (http://mirdb.org/): là một trang cơ sở dữ liệu trực tuyến cho dự đoán mục tiêu miRNA và các chức năng của chúng
Mẫu bệnh phẩm lấy từ sinh thiết mô vòm họng được thu nhận từ các bệnh nhân đến khám và mẫu lành lấy từ dịch phết vòm họng thu nhận từ các tình nguyện viên
24 khỏe mạnh, không mắc bệnh ung thư vòm họng tại Bệnh viện Chợ Rẫy, Thành phố
Hồ Chí Minh, được chẩn đoán là mắc bệnh ung thư vòm họng (Được sự cho phép của hội đồng y đức Bệnh viện Chợ Rẫy, Thành phố Hồ Chí Minh) Bộ mẫu gồm 10 mẫu mô được chẩn đoán chính xác bằng giải phẫu bệnh là ung thư vòm họng thông qua các phương pháp nhuộm Hematoxylin và Eosin (HE) Đồng thời, 10 mẫu ở dạng dịch phết được thu nhận và kiểm tra âm tính với kết quả nhuộm HE Các mẫu sau khi thu nhận được bảo quản trong dung dịch PBS (Phosphate Buffer Saline), dùng để đối chứng Bộ mẫu này được bảo quản trong dung dịch PBS, ở nhiệt độ thấp và chuyển về phòng thí nghiệm tiến hành các phương pháp thực hiện sau này
1.3 Dụng cụ - thiết bị - hóa chất
Các dụng cụ thông thường được sử dụng trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử, bao gồm các dụng cụ chính như: kẹp lấy mẫu, đèn cồn, eppendorf, micro pipette, đầu tip, ống đong, erlen,…
Máy vortex (Vortex ZX3, Velp Ý), máy ly tâm lạnh (Hettich Universal 320R, Đức), bộ điện di DNA (Biorad), tủ lạnh (LG), tủ đông (Sanyo), tủ ủ nhiệt (Multitemp III), cân kỹ thuật (Satorious, Đức), tủ hút khí độc (Ascent Max), máy quang phổ kế (Scanning UV/VIS), máy luân nhiệt (My-cycle Thermal, Biorad), lò vi sóng (Sharp), Máy realtime PCR MyGo Mini ITIS (Anh)
1.3.3.1 Hóa chất sử dụng cho quy trình tách chiết DNA
Tris HCl, EDTA, SDS 10%, NaCl, ddH2O, Proteinase K, Phenol, Chloroform, Isoamylalcohol, NaOAc, Isopropanol, TE 1X
1.3.3.2 Hóa chất sử dụng cho quy trình tách chiết miRNA
Sử dụng bộ Kit tách miRNA mirVana™ miRNA Isolation Kit
1.3.3.3 Hóa chất sử dụng cho quy trình chuyển đổi mRNA thành cDNA
Sử dụng bộ Kit chuyển đổi SensiFAST™ cDNA Synthesis Kit, Master Mix (2X)
1.3.3.4 Hóa chất sử dụng cho quy trình Realtime PCR
SensiMix II Probe Mix (2X), mồi Taqman cho từng miRNA, nuclease-free water
1.4 Quy trình nghiên cứu thực nghiệm
Hình 2 1 Sơ đồ quy trình thực nghiệm
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Khai thác cơ sở dữ liệu
2.1.1 Tiêu chuẩn thu nhận, chọn lọc, loại bỏ các công trình nghiên cứu khoa học đã công bố
Tiến hành tìm kiếm các thông tin về cấu trúc, cơ chế gây bệnh và tình trạng bệnh do miRNA-155 gây ra ung thư vòm họng được thu nhận trên các cơ sở dữ liệu, bao gồm: PUBMED, Google Scholar, NCBI, miRBase được cập nhật đến năm 2021 bằng một số từ khóa như: Nasopharyngeal carcinoma, microRNA, miRNA-155,…
Các công bố khoa học được chọn vào phân tích tổng hợp theo một số tiêu chuẩn như sau: (1) Nghiên cứu ca-chứng (case-control study)/ hoặc nghiên cứu đoàn hệ (cohort study) trong khảo sát sự biểu hiện của miRNA-155; (2) Mối quan hệ giữa tính chất biểu hiện của miRNA-155 khảo sát ở bệnh UTVH; (3) Các bài báo liên quan đến phương pháp phân tích, phát hiện sự biểu hiện của các miRNA khảo sát
Tiêu chí loại bỏ: các công bố khoa học không trình bày dưới ngôn ngữ Anh; các công bố chỉ có phần tóm tắt (abstract), các bài tổng quan (review), các bài thư gửi tạp chí (letter to editor), đều không được đưa vào dữ liệu thống kê
Hình 2 2 Sơ đồ mô tả quy trình chọn lọc công trình nghiên cứu
Từ nguồn cơ sở dữ liệu đã khai thác, tiến hành trích xuất dữ liệu Dữ liệu trích xuất bao gồm: tác giả, năm xuất bản, chủng tộc, phương pháp phân tích sự biểu hiện, đặc điểm điều hoà Các dữ liệu được trích xuất được trình bày dưới dạng bảng 2.1
Bảng 2 1 Mẫu bảng ghi nhận trích xuất dữ liệu từ công bố trên thế giới
Mẫu bệnh Mẫu chứng Đặc điểm mẫu
Mẫu biểu hiện Tổng mẫu
2.1.3 Khảo sát, đánh giá cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu
Các cặp mồi được sử dụng trong việc phát hiện sự biểu hiện của miRNA-155 và gene EBNA-1, chứng nội U6 và chứng nội beta-actin được nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát đánh giá đặc tính, thông số vật lý, tính tương đồng, tính chuyên biệt,… bằng cách sử dụng các công cụ tin sinh học như: BLAST, IDT, Annhyb,… để kiểm tra kích thước sản phẩm dự đoán được khuếch đại
Quy trình thực nghiệm tách chiết DNA virus bằng phương pháp Phenol/Chloroform được thực hiện theo các bước sau:
Bước 1: Ly giải tế bào
Trường hợp tách chiết DNA từ mẫu mô:
Dùng kéo (vô trùng) cắt một phần mô nhỏ (khối 1mm 2 ), cho mẫu mô vào eppendorf sạch và cắt nhuyễn mẫu mô (càng nhỏ càng tốt) Thêm 100 μl dung dịch trữ mẫu vào eppendorf Vortex ống mẫu trong 10 phút Tiến hành ly tâm 13.000 vòng/phút trong 20 phút
Loại bỏ dịch nổi, bổ sung 700 μl dung dịch lysis buffer (14 μl Tris HCl 1M, 14 μl EDTA 0,5M, 33 μl SDS10%, 14 μl NaCl 0,5M, 618 μl dd H2O, 7μl Proteinase K (1mg/ml), đảo ống đều Ủ qua đêm ở nhiệt độ 56oC
Trường hợp tách chiết DNA từ mẫu dịch phết:
Dùng kẹp vô trùng kẹp que tăm bông, rũ nhẹ để mẫu rớt ra khỏi que tăm hoặc vortex nhẹ
Hút 5 μl, bổ sung 700 μl dung dịch lysis buffer (14 μl Tris HCl 1M, 14 μl EDTA 0,5M, 33 μl SDS10%, 14 μl NaCl 0,5M, 618 μl dd H2O, 7 μl Proteinase K 1mg/ml), đảo ống đều Ủ qua đêm ở nhiệt độ 56 o C
Bước 2: Tách chiết DNA bộ gene bằng phương pháp Phenol/Chloroform
Tiến hành ly tâm 13.000 vòng/phút trong 20 phút
Loại bỏ phần cặn, thu dịch nổi, bổ sung 700 μl dung dịch PCI (Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol với tỷ lệ 25:24:1), lắc đều ống và ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút
Thu V μl dịch nổi, bổ sung V μl dung dịch PCI (như trên) lắc đều ống và ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút (lặp lại cho đến khi không còn protein)
Thu V1 μl dịch nổi, bổ sung V1 μl Chloroform, lắc đều Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút
Thu V2 μl dịch nổi, tiến hành bổ sung 1/10 V2 μl dung dịch NaOAc 3M, lắc đều Bổ sung V2 μl Isopropanol, lắc đều và ủ ở nhiệt độ 4oC trong vòng 2 giờ
Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 20 phút Loại bỏ dịch nổi, thu tủa
Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC, loại bỏ dịch nổi
Loại bỏ ethanol và làm khô cặn bằng cách phơi qua đêm ở nhiệt độ phòng
Lưu giữ mẫu tại -20oC
Các quy trình thực nghiệm liên quan đến tách chiết miRNA, chuyển đổi miRNA thành cDNA được thực hiện theo sự hướng dẫn của nhà sản xuất Cụ thể như sau:
2.2.1 Tách chiết miRNA bằng bộ kit mirVana™ miRNA Isolation Kit
Bước 1: Chuẩn bị các hóa chất
Thêm 21 ml ethanol 100% vào chai có nhãn miRNA Wash Soln 1, sau đó trộn đều Thêm 40 ml ethanol 100% vào chai có nhãn Wash Solution 2/3, sau đó trộn đều Làm nóng dung dịch Elution Solution hoặc nước nuclease-free tới 95°C để sử dụng để tách RNA ra từ bộ lọc ở cuối quy trình Ethanol 100% sử dụng cho quy trình này được giữ lạnh, sau đó làm nóng đến nhiệt độ phòng trước khi sử dụng
Bước 2: Phá màng tế bào và màng nhân Đo lường hoặc ước tính trọng lượng của mẫu Cho vào 10 lần thể tích Lysis Buffer (ví dụ, 1ml Lysis Buffer cho 0,1g mẫu), sau đó ủ lạnh
Bước 3: Tách chiết chất hữu cơ (protein, carbohydrate,…)
Thêm 1/10 thể tích miRNA Homogenate Additive và trộn đều bằng cách vortex hoặc đảo ngược ống nhiều lần (Ví dụ, nếu tổng thể tích là 300 μl, thêm 30 μl miRNA Homogenate Additive) Để hỗn hợp ở nhiệt độ lạnh trong 10 phút Thêm một lượng Phenol: Chloroform tương đương với thể tích trước khi thêm hỗn hợp Homogenate miRNA Sau đó, vortex trong 30 – 60 giây Ly tâm trong 5 phút ở tốc độ 10.0000 vòng/phút Thu V μl dịch nổi sang một eppendorf mới
Thêm 1/3 thể tích 100% ethanol vào dịch nổi thu được từ các bước ở trên Trộn đều bằng cách vortex hoặc đảo ngược ống nhiều lần Đối với mỗi mẫu, đặt bộ lọc Filter Cartridge vào một trong Collection Tube (được cung cấp theo bộ kit) Cho hỗn hợp dung dịch (dịch nổi và ethanol từ bước trước) vào bộ lọc Filter Cartridge Bổ sung dung dịch lên đến 700 μl cho mỗi lần Ly
31 tâm khoảng 15 giây với 10.000 vòng/phút cho hỗn hợp qua màng lọc, sau đó đưa phần dung dịch qua màng lọc qua một eppendorf mới (Nếu hỗn hợp dung dịch lớn hơn 700 μl, tiếp tục cho phần dung dịch còn lại vào Filter Cartridge, ly tâm khoảng
15 giây với 10.000 vòng/phút cho hỗn hợp qua màng lọc, sau đó đưa phần dung dịch qua màng lọc qua một eppendorf mới)
Có thể lặp lại các bước trên với phần dung dịch đã qua bộ lọc để thu nhận tối đa miRNA Thêm 700 μl miRNA Wash Solution 1 (đã bổ sung ethanol 100%) vào Filter Cartridge và ly tâm 5 – 10 giây với 10.000 vòng/phút Loại bỏ dung dịch qua màng lọc, đưa Filter Cartridge và một Collection Tube mới Thêm 500 μl dung dịch Wash Solution 2 (đã bổ sung ethanol 100%) và ly tâm 5 – 10 giây với 10.000 vòng/phút sao cho dung dịch qua bộ lọc Lặp lại bước trên với lượng Wash Solution 2 đã qua bộ lọc một lần nữa Chuyển bộ lọc Filter Cartridge sang một Collection Tube mới (cung cấp bởi bộ kit) Thêm 100 μl dung dịch Elution Solution hoặc nước nuclease-free (95oC) và bộ lọc và đóng nắp Spin khoảng 20 – 30 giây với tốc độ quay 10.000 vòng/phút Thu nhận cột lọc Filter Cartridge và lưu trữ ở -20oC hoặc thấp hơn
2.2.2 Kiểm tra độ tinh sạch của sản phẩm DNA và miRNA đã tách chiết
Tiến hành đo OD (Optimal Density) ở các bước sóng 260 và 280 nm để các định độ tinh sạch, nồng độ và các thông số liên quan Tỷ số A260/A280 dùng để đánh giá độ tinh sạch của RNA Tỷ số A260/A280 năm trong khoảng từ 1,8 đến 2,0 cho thấy RNA đã tinh sạch Trường hợp tỷ số nhỏ hơn 1,8 thì mẫu bị nhiễm protein
Mẫu đo OD phải được pha loãng 50 lần
2.2.3 Chuyển đổi trình tự miRNA thành cDNA bằng bộ kit chuyển SensiFAST™ cDNA Synthesis Kit
Bước 1: Chuẩn bị Mastermix được ủ lạnh
Bước 2: Lắc đều dung dịch, sau đó ly tâm dung dịch trong 5 giây
Bước 3: Cho vào 1 eppendorf (0,2 ml) các thành phần sau:
Bảng 2 2 Thành phần và thể tích các hóa chất cho quá trình chuyển đổi miRNA thành cDNA
Thành phần Thể tích miRNA n àl
DNase/RNase free-water Cho tới 20 àl
Bước 4: Trộn đều bằng pipet
Bước 5: Chạy chu trình nhiệt
Bước 6: Bảo quản ở nhiệt độ 4 o C trong một tuần hoặc -20 o C cho bảo quản dài hạn
2.2.4 Khuếch đại trình tự miRNA mong muốn
Sau khi tách chiết miRNA và chuyển đổi miRNA sang cDNA thành công, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng Realtime PCR nhằm khảo sát mức độ biểu hiện của miRNA-155 và EBNA-1
Hình 2 3 Chu trình nhiệt của phản ứng Reverse Transcriptase PCR
Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt tham khảo khuếch đại miRNA-155 và EBNA-1 khảo sát bằng realtime PCR:
Bảng 2 3 Thành phần phản ứng định lượng cho miRNA
SensiMIX TM II Probe kit 5 àl
Advance miRNA Assay (20X) – Mồi 0,5 àl cDNA (∼200 ng) n àl
Dnase/Rnase free-water 2,5 àl
Bảng 2 4 Thành phần phản ứng Realtime PCR
Mồi ngược 0,25 àl cDNA (∼200 ng) n àl
Dnase/Rnase free-water 3 àl
2.3.1 Phân tích tần số biểu hiện của miRNA-155
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
KẾT QUẢ KHẢO SÁT CƠ SỞ DỮ LIỆU
1.1 Kết quả thu nhận dữ liệu từ các công trình nghiên cứu liên quan đến miRNA-155 và bệnh UTVH
Sau khi khai thác, chúng tôi đã thu nhận các công trình nghiên cứu khoa học đã công bố liên quan đến các miRNA đang khảo sát và bệnh ung thư vòm họng, tổng số công trình nghiên cứu thu nhận ban đầu là 8 công trình Dựa vào các tiêu chí chọn lọc, các công trình không phù hợp với tiêu chí sẽ được loại bỏ, tổng số công trình phù hợp chỉ tiêu chọn lọc cho cả bốn miRNA nghiên cứu là 7 công trình Quy trình chọn lọc được trình bày chi tiết ở hình 3.1
Hình 3 1 Sơ đồ quy trình chọn lọc công trình nghiên cứu
1.2 Kết quả trích xuất dữ liệu từ các công trình nghiên cứu phù hợp tiêu chí chọn lọc
Sau khi loại trừ các nghiên cứu không đáp ứng các tiêu chí chọn lọc, chọn ra 07 công trình cho phân tích sự biểu hiện của miRNA-155 thực hiện nghiên cứu ca-chứng trên bệnh ung thư vòm họng Các thông tin liên quan đến đặc điểm bộ dữ liệu cho sự biểu hiện của bốn miRNA này được trình bày ở bảng 3.1 Từ bảng cho thấy được miRNA-155 có biểu hiện tăng cao trong các mẫu bệnh UTVH từ các nghiên cứu trên thế giới và loại mẫu tập trung được sử dụng trong nghiên cứu là mẫu mô và mẫu máu
Bảng 3 1 Đặc điểm bộ dữ liệu nghiên cứu liên quan đến miRNA-21, miRNA-144, miRNA-155, miRNA-214 với bệnh UTVH
Mẫu bệnh Mẫu chứng Đặc điểm
Trung Quốc Châu Á qPCR Tăng
Trung Quốc Châu Á qPCR Tăng ZDHHC2 124
Quốc Châu Á qPCR Tăng PTEN Dòng tế bào
Từ kết quả khai thác dữ liệu cho thấy:
(1) Số lượng các công trình nghiên cứu liên quan đến mIRNA-155 trên bệnh ung thư vòm họng vẫn còn rất hạn chế và chỉ tập trung ở chủng tộc Châu Á, trong đó cho thấy các công trình nghiên cứu hầu hết đều được thực hiện trên cộng đồng người Trung Quốc Tại Việt Nam, hiện tại các công trình nghiên cứu nào về miRNA-155 liên quan đến bệnh UTVH có số lượng khá hạn chế Do đó, việc thực hiện nghiên cứu trên miRNA-155 còn mới mẻ trên cộng đồng người Việt Nam
(2) Các công trình nghiên hiện nay trên thế giới hầu hết đều tập trung sử dụng mô (tissue) cho việc nghiên cứu về miRNA Đối với bệnh ung thư vòm họng, các mẫu khối mô (sinh thiết) được thu nhận trực tiếp từ mô ung thư hoặc mô nghi ngờ ung thư bằng cách sinh thiết nội soi, hay chọc hút bằng kim sinh thiết, v.v… Bảng 3.1 cho thấy mẫu mô được sử dụng nhiều nhất để nghiên cứu về miRNA-155 (chiếm 71,43%, 05/07), còn lại là mẫu sinh thiết (chiếm 14,29%, 01/07) và mẫu nuôi cấy dòng tế bào (chiếm 14,29%, 01/07) So với các loại mẫu khác, mẫu mô có ưu điểm là được lấy trực tiếp từ vùng mô bị bệnh, có thể nghiên cứu trực tiếp trên các tế bào bị nhiễm bệnh Đối với các phương pháp chẩn đoán UTVH hiện nay, các mô sinh thiết đều được sử dụng để kiểm tra và chẩn đoán Do đó, trong nghiên cứu về miRNA trên bệnh UTVH ở người Việt Nam, chúng tôi tiến hành nghiên cứu sự phát hiện biểu hiện của miRNA-155 dựa trên các mẫu mô sinh thiết từ bệnh nhân UTVH
(3) Phương pháp được sử dụng cho việc nghiên cứu về miRNA trên thế giới hiện nay là phương pháp qRT-PCR (Quantitative Real-Time Reverse Transcription PCR), là loại phương pháp có tính nhạy cao, có thể định lượng và thực hiện đơn giản hơn so với các phương pháp khác như microarray, IHC (nhuộm hóa mô miễn dịch), v.v… cho việc phát hiện sự biểu hiện của miRNA lên bệnh các loại bệnh ung thư Ưu điểm của loại phương pháp này là có độ nhạy, độ chính xác và độ đặc hiệu cao, cùng với việc hạn chế khả năng ngoại nhiễm và âm tính giả so với các phương pháp khác, đồng thời còn tiết kiệm thời gian trong việc phân tích và đánh giá được mối tương quan biểu hiện (tăng hoặc giảm) giữa mẫu ung thư vòm họng so với mẫu lành thông qua giá trị ngưỡng của Real-time PCR Do đó, trong nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi
40 lựa chọn quy trình phát hiện miRNA-155 dựa trên kỹ thuật qRT-PCR thông qua mồi chuyên biệt cho việc phản hiện sự biểu hiện của các miRNA-155
Thông qua việc khai thác dữ liệu, các thông tin về miRNA-155 trên bệnh UTVH sẽ là một cơ sở khoa học cho việc tìm hiểu vai trò của chúng trong quá trình hình thành ung thư và ứng dụng trong việc chẩn đoán và tiên lượng sớm bệnh ung thư vòm họng
1.3 Kết quả khảo sát mồi
1.3.1 Kết quả khảo sát mồi của miRNA-155
Mồi được sử dụng cho việc phát hiện sự biểu hiện của miRNA-155 bằng phương pháp qRT-PCR được sử dụng từ bộ kit Advance miRNA Assay (20X) hsa-miR-155, Thermo Fisher Scientific
1.3.2 Kết quả khảo sát cặp mồi cho gene EBNA-1, chứng nội U6 và chứng nội Beta- actin
Trình tự các cặp mồi được thu nhận trong quá trình khai thác cơ sở dữ liệu Các cặp mồi đã được nhóm nghiên cứu thực hiện, ghi nhận cặp mồi và kiểm tra các kiểm tra thông số cũng như độ đặc hiệu của mồi Cặp mồi khuếch đại cho EBNA-1- F-R được thu nhận từ công trình nghiên cứu của Telenti A và cộng sự năm 1990 Cặp mồi cho chứng nội U6-F-R được thu nhận từ công trình nghiên cứu của Chang và cộng sự năm 2014 và cặp mồi Beta-actin-F-R được thừa kế từ nghiên cứu của Yap và cộng sự 2017
1.3.2.1 Kết quả kiểm tra các thông số vật lý của mồi
Bảng 3 2 Các thông số vật lý của các cặp mồi
Chuỗi mồi PCR đặc hiệu là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất khuếch đại Các thông số đặc trưng của mồi bao gồm: - Chiều dài mồi (L): Số lượng base trong mồi - Nội dung %GC: Phần trăm base Guanine (G) và Cytosine (C) trong mồi - Nhiệt độ nóng chảy mồi (Tm): Nhiệt độ khi một nửa số phân tử mồi chuyển sang trạng thái sợi đơn - Mức năng lượng liên kết tự do (∆G): ∆G càng âm thì mồi càng ổn định ở dạng sợi đơn ∆G (1), (2), (3) lần lượt tương ứng với năng lượng liên kết tự do cho cấu trúc kẹp tóc, tự bắt cặp của mồi, mồi xuôi-mồi ngược tự bắt cặp.
Dựa vào phần mềm phân tích IDT, các thông số vật lý của các cặp mồi tham khảo được đánh giá về chiều dài mồi, %GC, nhiệt độ nóng chảy, khả năng hình thành cấu trúc kẹp tóc, primer-dimer của hệ thống mồi với một số tiêu chí sau: chiều dài của một cặp mồi tốt nhất là ở khoảng 18 – 25 bp; Thiết kế các cặp mồi có %GC nằm trong khoảng 45 – 60%; nhiệt độ nóng chảy của cặp mồi nằm trong khoảng 55 – 65 o C, nhiệt độ chênh lệch giữa hai mồi không quá 5 o C (lý tưởng là 2 – 3 o C) ; giá trị ∆G ≥ -9 Kcal/mole (Álvarez-Fernández và cs, 2013)
Nhận xét cặp mồi EBNA1-F-R: chiều dài của trình tự mồi xuôi và mồi ngược đều là 20bp, giá trị này phù hợp với thông số vật lý cho phép của mồi và đạt yêu cầu về chiều dài Nhiệt độ nóng chảy Tm của mồi xuôi và mồi ngược lần lượt là 54,9 o C và 57,3 o C, sự chênh lệch nhiệt độ giữa hai mồi là 2,4 o C, nằm trong khoảng giá trị cho phép %GC của mồi xuôi và mồi ngược đều là 55,0%, nằm trong khoảng 45 – 60% nên %GC của cặp mồi đạt yêu cầu Năng lượng liên kết tự do để hình thành các cấu trúc thứ cấp đều lớn hơn hoặc bằng -9 Kcal/mol-1 Do đó, cặp mồi EBNA1-F-R đạt yêu cầu
Nhận xét cặp mồi U6-F-R: chiều dài của trình tự mồi xuôi và mồi ngược lần lượt là 23bp và 19bp, giá trị này phù hợp với thông số vật lý cho phép của mồi và đạt yêu cầu về chiều dài Nhiệt độ nóng chảy Tm của mồi xuôi và mồi ngược lần lượt là 51,7 o C và 52,3 o C, sự chênh lệch nhiệt độ giữa hai mồi là 0,6 o C, nằm trong khoảng giá trị cho phép %GC của mồi xuôi là 34,8%, số lượng base G và C của mồi xuôi khá thấp, điều này không ảnh hưởng đến kết quả sản phẩm khuếch đại PCR vì sự bắt cặp của các cặp mồi còn có khả năng phụ thuộc vào nồng độ muối của môi trường
Mồi ghép ngược có tỷ lệ %GC là 47,4%, nằm trong phạm vi giá trị cho phép Năng lượng liên kết tự do để hình thành các cấu trúc thứ cấp đều lớn hơn hoặc bằng -9 Kcal/mol-1 Do đó, sự ghép cặp mồi U6-F-R đáp ứng các yêu cầu về năng lượng và thành phần trình tự nucleotit, đảm bảo độ bền và tính đặc hiệu của liên kết.
Cặp mồi Beta-F,R đáp ứng các thông số vật lý về chiều dài (23bp cho mồi xuôi, 21bp cho mồi ngược) và nhiệt độ nóng chảy (53,4°C cho mồi xuôi, 55,2°C cho mồi ngược, chênh lệch 0,8°C nằm trong ngưỡng cho phép) Hàm lượng %GC của mồi xuôi (39,1%) thấp nhưng không ảnh hưởng đến kết quả PCR do phụ thuộc vào nồng độ muối Mồi ngược có %GC (52,4%) nằm trong phạm vi chấp nhận được Cả hai mồi đều có năng lượng liên kết tự do âm lớn hơn hoặc bằng -9 Kcal/mol, đảm bảo sự ổn định của cấu trúc.
1 Do đó, cặp mồi Beta-F-R đạt yêu cầu
Cấu trúc thứ cấp ổn định của cặp mồi, bao gồm kẹp tóc, tự bắt cặp và bắt cặp ngược chiều, có thể cản trở liên kết với trình tự đích, ảnh hưởng đến hiệu quả PCR Độ bền vững của các cấu trúc này được đo bằng biến đổi năng lượng tự do Gibbs (ΔG) Theo IDT, ΔG tuyệt đối lớn hơn -9 Kcal/mol chỉ ra liên kết kém bền vững, không ảnh hưởng đến PCR Do đó, cần thiết kế mồi tránh các cấu trúc thứ cấp, đặc biệt ở đầu 3'.
1.3.2.2 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của mồi bằng phần mềm ANNHYB
KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM
Sau khi tách chiết miRNA-155 từ 10 mẫu bệnh phẩm và 10 mẫu dịch phết lành và được chuyển đổi thành cDNA, tiến hành kiểm tra sự biểu hiện kết quả như sau:
2.1 Kết quả khuếch đại trình tự miRNA-155
Tiến hành chạy thực nghiệm trên 10 mẫu bệnh phẩm và 10 mẫu lành, có kết quả các mẫu dương tính với miRNA-155 khảo sát được thu nhận như bảng 3.3, hình 3.13 trình bày
Bảng 3 3 Sự biểu hiện dương tính của miRNA-155 lên các mẫu khảo sát
Hình 3 13 Sự biểu hiện của miRNA-155 được phát hiện trên các mẫu đại diện
2.2 Kết quả khuếch đại trình tự chứng nội U6
Chu trỡnh nhiệt sử dụng cho cặp mồi U6 với nồng độ cDNA 200ng/àl cDNA Tiến hành thực nghiệm trên 10 mẫu bệnh phẩm và 10 mẫu có kết quả các mẫu dương tính với các khảo sát được thu nhận như bảng 3.4, hình 3.14 trình bày
Bảng 3 4 Sự biểu hiện dương tính của chứng nội U6 lên các mẫu khảo sát
Hình 3 14 Sự biểu hiện của chứng nội U6 được phát hiện trên các mẫu đại diện
2.3 Kết quả khuếch đại trình tự EBNA-1
Tiến hành chạy thực nghiệm trên 10 mẫu bệnh phẩm và 10 mẫu lành, có kết quả các mẫu dương tính với các khảo sát được thu nhận như bảng 3.5, hình 3.15 trình bày
Bảng 3 5 Sự biểu hiện dương tính của EBNA-1 lên các mẫu khảo sát
Hình 3 15 Sự biểu hiện của EBNA-1 được phát hiện trên các mẫu đại diện
2.4 Kết quả khuếch đại trình tự chứng nội Beta-actin
Tiến hành chạy thực nghiệm trên 10 mẫu bệnh phẩm và 10 mẫu lành, có kết quả các mẫu dương tính với các khảo sát được thu nhận như bảng 3.6, hình 3.16 trình bày
Bảng 3 6 Sự biểu hiện dương tính của chứng nội Beta-actin lên các mẫu khảo sát
Hình 3 16 Sự biểu hiện của Beta-actin được phát hiện trên các mẫu đại diện
KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ
Bảng 3 7 Bảng kết quả phân tích thống kê sự biểu hiện của miRNA-155 và
Chú thích: giá trị thống kê được thực hiện bằng phần mềm Medcalc 2020 P: positive, dương tính; N: negative, âm tính p-value (Probability value): giá trị tin cậy;
Sp (Specificity): độ đặc hiệu;
Pp (Positive Predictive value): giá trị tiên đoán dương tính;
Np (Negative Predictive value): giá trị tiên đoán âm tính;
LR- (Negative likelihood ratio): tỷ lệ khả năng âm tính;
LR+ (Positive likelihood ratio): tỷ lệ khả năng dương tính; κ (kappa): chỉ số đồng thuận giả thuyết;
OR (Odd ratio): tỷ suất chênh;
RR (Risk relative): chỉ số nguy cơ tương đối
Bằng kỹ thuật Realtime PCR với cặp mồi đặc hiệu và dựa vào kết qủa thống kê bằng phần mềm Medcalc2020, cho thấy miRNA-155 và EBNA-1 biểu hiện trong mẫu ung thư lần lượt 60% (6/10), 80% (8/10) cao hơn so với mẫu lành 10% (1/10), 10% (1/10)
Giá trị p (miRNA-155: p = 0,002; EBNA-1: p = 0,0024) đều nhỏ hơn 0,05 điều này cho thấy sự biểu hiện của miRNA-155 và EBNA-1 có mối liên hệ chặt chẽ với ung thư vòm họng Kết quả phân tích cho độ nhạy, độ đặc hiệu, Pp, Np đều từ 60% đến 90% Điều này có nghĩa phương pháp xét biểu hiện gene mục tiêu bằng Realtime PCR so với phương pháp chẩn đoán lâm sàng và có thể áp dụng trong việc tiên lượng, sàng lọc và chẩn đoán sớm bệnh ung thư vòm họng Với độ đặc hiệu của miR-155 và EBNA-1 lần lượt là 90% và 90% có nghĩa là phép xét nghiệm có thể nhận ra phần lớn các trường hợp âm tính giả Ngược lại, trong nghiên cứu này, độ nhạy phương pháp của miR-155 và EBNA-1 lần lượt là 60% và 80%; khi đó phương pháp này có thể nhận ra các trường hợp dương tính thật và những trường hợp khi kết quả âm tính từ một phương pháp có độ nhạy cao sẽ giúp chúng ta sàng lọc bệnh, tăng khả năng chẩn đoán và hạn chế việc dương tính thật Các giá trị Pp và Np ở đây lần lượt ở miR-
155 và EBNA-1 là 80,71%, 88,89% và 69,23%, 81,82% chứng tỏ phương pháp phát hiện phân tử có thể giúp chẩn đoán đối tượng bị bệnh ung thư vòm họng chắc chắn hơn Với giá trị chỉ số κ của miR-155 và EBNA-1 lần lượt là 0,5 và 0,7 cho thấy mức độ phù hợp giữa sự hiện diện của mỗi gene với các phương pháp xác định khác của bệnh ung thư vòm họng là trung bình và chặt chẽ Vì vậy, cần tiến hành song song với kết quả một số thông số lâm sàng khác, từ đó đưa ra các chẩn đoán chính xác và
55 có liệu pháp điều trị thích hợp Tính chất biểu hiện của miR-155 và EBNA-1 ở mẫu bệnh so với mẫu lành cho thấy tăng nguy cơ mắc bệnh ung thư vòm họng với chỉ số miR-155 và EBNA-1: OR = 13,50 và OR = 36,00 cho thấy nhóm có sự biểu hiện miRNA-155 và EBNA-1 với nguy cơ mắc bệnh UTVH lần lượt cao gấp 13,50 và 36,00 lần so với nhóm không có sự biểu hiện, tuy nhiên giá trị này có sự khác biệt có ý nghĩa qua thống kê (p = 0,04 < 0,05) và (p = 0,007 < 0,01) Tương tự, tính chất biểu hiện của miR-155 và EBNA-1 ở mẫu bệnh so với mẫu lành cho thấy tăng nguy cơ mắc bệnh ung thư vòm họng với chỉ số miR-155 và EBNA-1: RR = 6,00 và RR 8,00 cho thấy nhóm có sự biểu hiện miRNA-155 và EBNA-1 với nguy cơ mắc bệnh UTVH lần lượt cao gấp 6,00 và 8,00 lần so với nhóm không có sự biểu hiện, tuy nhiên giá trị này không có sự khác biệt có ý nghĩa qua thống kê (p = 0,07 > 0,05) đối với miRNA-155 và (p = 0,03 < 0,05) có sự khác biệt có ý nghĩa qua thống kê đối với
EBNA-1 Do số lượng mẫu ngẫu nhiên của miR-155 còn quá nhỏ
Hình 3 17 Giá trị trung bình chu kỳ ngưỡng của miRNA-155 (A), U6 (B) trong mẫu bệnh và mẫu lành
Chú thích: Chấm tròn thể hiện giá trị chu kỳ ngưỡng (Ct value)
Theo giá trị trung bình chu kỳ ngưỡng (mean ΔCt) (hình 3.17 A), trung bình chu kỳ ngưỡng của miRNA-155 trong mẫu bệnh không thay đổi nhiều trong hầu hết so với giá trị trung bình của mẫu lành, các nghiệm thức có sự khác biệt có ý nghĩa
56 qua thống kê p = 0,002, được biểu hiện bằng giá trị Mean ± SD trong nghiệm thức bằng t-test
Theo giá trị trung bình chu kì ngưỡng (mean ∆Ct) (hình 3.17 B), U6 biểu hiện trong mẫu bệnh không thay đổi nhiều trong hầu hết so với giá trị trung bình chu kì ngưỡng ở mẫu lành Như kỳ vọng ban đầu, nghiệm thức không có sự khác biệt có ý nghĩa qua thống kê (p > 0,05), kết quả được biểu hiện bằng giá trị Mean ± SD trong nghiệm thức bằng t-test
Hình 3 18 Giá trị trung bình chu kỳ ngưỡng của EBNA-1 (A) và Beta-actin (B) trong mẫu bệnh và mẫu lành
Chú thích: Chấm tròn thể hiện giá trị chu kì ngưỡng
Theo giá trị trung bình chu kỳ ngưỡng ( mean ΔCt) (hình 3.18 A), trung bình chu kì ngưỡng trong mẫu bệnh thấp hơn so với giá trị trung bình của mẫu lành, các nghiệm thức có sự khác biệt có ý nghĩa qua thống kê p = 0,0024, được biểu hiện bằng giá trị Mean ± SD trong nghiệm thức bằng t-test
Theo giá trị trung bình chu kì ngưỡng (mean ∆Ct), sự biểu hiện của Beta-actin trong mẫu bệnh gần như không thay đổi so với mẫu lành Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) giữa hai nhóm, được biểu diễn bằng giá trị Mean ± SD và xác nhận thông qua t-test.
Để đánh giá tính chất biểu hiện của phân tử miRNA-155 và EBNA-1 ở mẫu bệnh so với mẫu lành, nghiên cứu đã tiến hành tính toán giá trị 2-ΔΔCt Kết quả phân tích được thể hiện trong Bảng 3.8 và Hình 3.19.
Bảng 3 8 Giá trị trung bình Ct của các mẫu sinh thiết mô UTVH và mẫu lành cùng với giá trị 2 -ΔΔCt trong đánh giá biểu hiện của miRNA-155 và EBNA-1 so với chứng nội U6snRNA và Beta-actin
Mẫu bệnh (Ct) Mẫu lành (Ct) miRNA-155 27,33 ± 0,52 26,98 ± 0,00
Giá trị 2 -ΔΔCt của miR-155/EBNA-1/U6snRNA/Beta-actin (bệnh:lành)
∆∆Ct = (∆Ctgen mục tiêu - ∆Ctchứng nội) bệnh - (∆Ctgen mục tiêu - ∆Ctchứng nội) lành
Hình 3 19 Sự biểu hiện của miR-155 (A) và EBNA-1 (B) trong mẫu bệnh và mẫu lành
Từ kết quả phân tích cho thấy, miRNA-155 và EBNA-1 có sự biểu hiện ở mẫu bệnh cao hơn lần lượt 1,04 và 5,2 lần khi so với mẫu lành (2 -ΔΔCt miR-155 = 1,04 với giá trị p
= 0,002; 2 -ΔΔCt EBNA-1 = 5,2 với giá trị p = 0,0024)
Nghiên cứu của nhóm tác giả hoàn toàn nhất quán với các công trình nghiên cứu trước đây về biểu hiện của các miRNA này trong u lympho thể vú (UTVH) (Bảng 3.1) Điều này cho thấy miRNA-155 và EBNA-1 đóng vai trò như những oncogene trong quá trình hình thành và phát triển UTVH.
