Đặc tính biểu hiện của microRNA 155 và EBNA 1 trên bệnh nhân ung thư vòm họng ở Việt Nam

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

VẬT LIỆU

Cơ sở dữ liệu NCBI (National Center for Biotechnology Information) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/): là một cơ sở dữ liệu về sinh học dùng cho việc khai thác thông tin. Cơ sở dữ liệu miRBase (https://mirbase.org/): là một cơ sở dữ liệu về sinh học lưu trữ các chú thích và trình tự các chuỗi microRNA công khai. Mỗi một thành phần trong cơ sở dữ liệu miRBase đại diện cho một trình tự hairpin (trình tự cấu trúc kẹp tóc) dự đoán của một phiên mã, kèm theo các thông tin về vị trí và thứ tự của chuỗi miRNA trưởng thành.

Phần mềm trực tuyến TargetScan 8.0 (http://www.targetscan.org/vert_80/): là một phần mềm nhằm dự đoán các vị trí bắt cặp bổ sung của miRNA trên phân tử mRNA đích. (https://mirtarbase.cuhk.edu.cn/~miRTarBase/miRTarBase_2022/php/index.php): là các phần mềm trực tuyến, nhằm dự đoán các trình tự đích (mRNA) của miRNA. Phần mềm Annhyb phiên bản 4.946 (Olivier Faird, 2012): là phần mềm dùng thực hiện các thao tác xử lý trên các trình tự nucleotide, bao gồm các tính năng như đọc trình tự, chú thích trình tự, tìm kiếm và sắp xếp các trình tự oligonucleotide,….

Phần mềm Clustal X 2.0: là phần mềm dùng để so sánh nhiều trình tự nucleotide hay amino acid, kết quả của việc so sánh này giúp cho người nghiên cứu có thể tìm ra các vùng bảo tồn hay biến động giữa các trình tự với nhau. Mẫu bệnh phẩm lấy từ sinh thiết mô vòm họng được thu nhận từ các bệnh nhân đến khám và mẫu lành lấy từ dịch phết vòm họng thu nhận từ các tình nguyện viên. 24 khỏe mạnh, không mắc bệnh ung thư vòm họng tại Bệnh viện Chợ Rẫy, Thành phố Hồ Chí Minh, được chẩn đoán là mắc bệnh ung thư vòm họng (Được sự cho phép của hội đồng y đức Bệnh viện Chợ Rẫy, Thành phố Hồ Chí Minh).

Bộ mẫu gồm 10 mẫu mô được chẩn đoán chính xác bằng giải phẫu bệnh là ung thư vòm họng thông qua các phương pháp nhuộm Hematoxylin và Eosin (HE). Các dụng cụ thông thường được sử dụng trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử, bao gồm các dụng cụ chính như: kẹp lấy mẫu, đèn cồn, eppendorf, micro pipette, đầu tip, ống đong, erlen,…. Máy vortex (Vortex ZX3, Velp Ý), máy ly tâm lạnh (Hettich Universal 320R, Đức), bộ điện di DNA (Biorad), tủ lạnh (LG), tủ đông (Sanyo), tủ ủ nhiệt (Multitemp III), cân kỹ thuật (Satorious, Đức), tủ hút khí độc (Ascent Max), máy quang phổ kế (Scanning UV/VIS), máy luân nhiệt (My-cycle Thermal, Biorad), lò vi sóng (Sharp), Máy realtime PCR MyGo Mini ITIS (Anh).

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Khai thác cơ sở dữ liệu

Dữ liệu trích xuất bao gồm: tác giả, năm xuất bản, chủng tộc, phương pháp phân tích sự biểu hiện, đặc điểm điều hoà. Các cặp mồi được sử dụng trong việc phát hiện sự biểu hiện của miRNA-155 và gene EBNA-1, chứng nội U6 và chứng nội beta-actin được nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát đánh giá đặc tính, thông số vật lý, tính tương đồng, tính chuyên biệt,…. Bước 2: Tách chiết DNA bộ gene bằng phương pháp Phenol/Chloroform Tiến hành ly tâm 13.000 vòng/phút trong 20 phút.

Các quy trình thực nghiệm liên quan đến tách chiết miRNA, chuyển đổi miRNA thành cDNA được thực hiện theo sự hướng dẫn của nhà sản xuất. Làm nóng dung dịch Elution Solution hoặc nước nuclease-free tới 95°C để sử dụng để tách RNA ra từ bộ lọc ở cuối quy trình. Ethanol 100% sử dụng cho quy trình này được giữ lạnh, sau đó làm nóng đến nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.

31 tâm khoảng 15 giây với 10.000 vòng/phút cho hỗn hợp qua màng lọc, sau đó đưa phần dung dịch qua màng lọc qua một eppendorf mới. (Nếu hỗn hợp dung dịch lớn hơn 700 μl, tiếp tục cho phần dung dịch còn lại vào Filter Cartridge, ly tâm khoảng 15 giây với 10.000 vòng/phút cho hỗn hợp qua màng lọc, sau đó đưa phần dung dịch qua màng lọc qua một eppendorf mới). Tiến hành đo OD (Optimal Density) ở các bước sóng 260 và 280 nm để các định độ tinh sạch, nồng độ và các thông số liên quan.

Sau khi tách chiết miRNA và chuyển đổi miRNA sang cDNA thành công, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng Realtime PCR nhằm khảo sát mức độ biểu hiện của miRNA-155 và EBNA-1. Tần số biểu hiện của các phân tử miRNA-155 được tính toán và sử dụng phép tính chi bình phương (Chi- square test) để so sánh tần số biểu hiện giữa các nhóm bệnh và lành. Ngoài ra, phân tích dữ liệu còn xác định được độ nhạy (sensitivity), độ đặc hiệu (specificity), chỉ số κ (Kappa),….

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

KẾT QUẢ KHẢO SÁT CƠ SỞ DỮ LIỆU

Sau khi khai thác, chúng tôi đã thu nhận các công trình nghiên cứu khoa học đã công bố liên quan đến các miRNA đang khảo sát và bệnh ung thư vòm họng, tổng số công trình nghiên cứu thu nhận ban đầu là 8 công trình. Dựa vào các tiêu chí chọn lọc, các công trình không phù hợp với tiêu chí sẽ được loại bỏ, tổng số công trình phù hợp chỉ tiêu chọn lọc cho cả bốn miRNA nghiên cứu là 7 công trình. Sau khi loại trừ các nghiên cứu không đáp ứng các tiêu chí chọn lọc, chọn ra 07 công trình cho phân tích sự biểu hiện của miRNA-155 thực hiện nghiên cứu ca-chứng trên bệnh ung thư vòm họng.

Từ bảng cho thấy được miRNA-155 có biểu hiện tăng cao trong các mẫu bệnh UTVH từ các nghiên cứu trên thế giới và loại mẫu tập trung được sử dụng trong nghiên cứu là mẫu mô và mẫu máu. (1) Số lượng các công trình nghiên cứu liên quan đến mIRNA-155 trên bệnh ung thư vòm họng vẫn còn rất hạn chế và chỉ tập trung ở chủng tộc Châu Á, trong đó cho thấy các công trình nghiên cứu hầu hết đều được thực hiện trên cộng đồng người Trung Quốc. So với các loại mẫu khác, mẫu mô có ưu điểm là được lấy trực tiếp từ vùng mô bị bệnh, có thể nghiên cứu trực tiếp trên các tế bào bị nhiễm bệnh.

Do đó, trong nghiên cứu về miRNA trên bệnh UTVH ở người Việt Nam, chúng tôi tiến hành nghiên cứu sự phát hiện biểu hiện của miRNA-155 dựa trên các mẫu mô sinh thiết từ bệnh nhân UTVH. (3) Phương pháp được sử dụng cho việc nghiên cứu về miRNA trên thế giới hiện nay là phương pháp qRT-PCR (Quantitative Real-Time Reverse Transcription PCR), là loại phương pháp có tính nhạy cao, có thể định lượng và thực hiện đơn giản hơn so với các phương pháp khác như microarray, IHC (nhuộm hóa mô miễn dịch), v.v… cho việc phát hiện sự biểu hiện của miRNA lên bệnh các loại bệnh ung thư. Ưu điểm của loại phương pháp này là có độ nhạy, độ chính xác và độ đặc hiệu cao, cùng với việc hạn chế khả năng ngoại nhiễm và âm tính giả so với các phương pháp khác, đồng thời còn tiết kiệm thời gian trong việc phân tích và đánh giá được mối tương quan biểu hiện (tăng hoặc giảm) giữa mẫu ung thư vòm họng so với mẫu lành thông qua giá trị ngưỡng của Real-time PCR.

Thông qua việc khai thác dữ liệu, các thông tin về miRNA-155 trên bệnh UTVH sẽ là một cơ sở khoa học cho việc tìm hiểu vai trò của chúng trong quá trình hình thành ung thư và ứng dụng trong việc chẩn đoán và tiên lượng sớm bệnh ung thư vòm họng. Mồi được sử dụng cho việc phát hiện sự biểu hiện của miRNA-155 bằng phương pháp qRT-PCR được sử dụng từ bộ kit Advance miRNA Assay (20X) hsa-miR-155, Thermo Fisher Scientific. Cặp mồi cho chứng nội U6-F-R được thu nhận từ công trình nghiên cứu của Chang và cộng sự năm 2014 và cặp mồi Beta-actin-F-R được thừa kế từ nghiên cứu của Yap và cộng sự 2017.

Tiếng Anh

Competition between the Rex1 exonuclease and the La protein affects both Trf4p-mediated RNA quality control and pre-tRNA maturation. Epstein-Barr virus-encoded LMP1 increases miR- 155 expression, which promotes radioresistance of nasopharyngeal carcinoma via suppressing UBQLN1. Epstein-Barr virus noncoding RNAs are confined to the nucleus, whereas their partner, the human La protein, undergoes nucleocytoplasmic shuttling.

64 Gahn TA, Schildkraut CL (1989) The Epstein-Barr virus origin of plasmid replication, oriP, contains both the initiation and termination sites of DNA replication. Hodin TL, Najrana T, Yates JL (2013) Efficient replication of Epstein-Barr virus- derived plasmids requires tethering by EBNA-1 to host chromosomes. Protein profiling with Epstein-Barr nuclear antigen- 1 reveals an interaction with the herpesvirus-associated ubiquitin-specific protease HAUSP/USP7.

Interplay of viral infection, host cell factors and tumor microenvironment in the pathogenesis of nasopharyngeal carcinoma. Association Between LMP-1, LMP-2, and miR- 155 Expression as Potential Biomarker in Nasopharyngeal Carcinoma Patients: A Case/Control Study in Vietnam. Impact of up-regulating Ezrin expression by Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 on metastasis ability of nasopharyngeal carcinoma cells.

Epstein-Barr virus (EBV) and its associated human cancers–genetics, epigenetics, pathobiology and novel therapeutics. Association Between LMP-1, LMP- 2, and miR-155 Expression as Potential Biomarker in Nasopharyngeal Carcinoma Patients: A Case/Control Study in Vietnam. Epstein-Barr virus-encoded LMP1 increases miR-155 expression, which promotes radioresistance of nasopharyngeal carcinoma via suppressing UBQLN1.