quy trình định lượng coliform bằng phương pháp mpn

 Nhóm Coliforms gồm 4 giống: Escherichia, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter  Nhóm Coliforms là nhóm vi sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước hay các

QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG COLIFORM

BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG THƯƠNG TP HCM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

HỌC PHẦN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM GVHD: ĐINH THỊ HẢI THUẬN

NHÓM 7

Thành viên

2005210199 Võ Anh Thư Nội dung các bước tiến hành và kết quả

2005217987 Đặng Cao Khánh Ngọc Nội dung môi trường và hóa chất

2005218031 Danh Hoàng Qúy Nội dung nguyên tắc, quy trình phân tích

2005218105 Huỳnh Thị Ngọc Trâm Tổng quan và powepoint

Tổng quan

Coliform phân = coliform chịu nhiệt + sinh indole

trên môi trường lỏng Trypton ở 44.5 ℃ trong 24 giờ trong 24 giờ

Tổng quan Coliform

Coliform hình que, gram âm, không sinh bào tử,

hiếu/ kỵ khí tùy nghi, có khả năng sinh acid, sinh hơi do lên men lactose ở 37℃ trong 24 giờ trong vòng 24-48 giờ

Coliform chịu nhiệt = coliform + lên men lactose

sinh hơi trên môi trường lỏng EC ở 44℃ trong 24 giờ trong

24 giờ

 Nhóm Coliforms gồm 4 giống: Escherichia, Citrobacter,

Klebsiella, Enterobacter

 Nhóm Coliforms là nhóm vi sinh vật chỉ thị: số lượng hiện

diện của chúng trong thực phẩm, nước hay các loại mẫu

môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của

các vi sinh vật gây bệnh khác

Tổng quan Coliform

 Dùng để đánh giá số lượng vi sinh vật theo số có xác suất lớn nhất của lượng

vi sinh vật có thể có trong một đơn vị thể tích mẫu

 Phương pháp dựa trên nguyên tắc mẫu được pha loãng thành 1 dãy thập phân Mỗi nồng độ pha loãng được ủ từ 3-5 ống lặp lại có ống Durham Theo dõi sự đục môi trường và sinh hơi để định tính sự hiện diện trong từng ống thử nghiệm (ống dương tính)

 Hai hệ thống: 9 ống và 15 ống

Tổng quan phương pháp MPN

Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

Phương pháp phát hiện và định lượng Coliforms

-Kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất (MPN)

Quy trình định lượng Coliforms bằng MPN

Nguyên tắc

Cấy lượng mẫu thử vào bộ 3-5 ống nghiệm môi trường tăng sinh chọn lọc lỏng nồng độ

đơn.

Ủ ấm 30-37 ℃ trong 24 giờ

các ống chứa

môi trường tăng sinh chọn lọc trong 24- 48h

Cấy vào một loạt các ống chứa

môi trường khẳng định

Cấy các ống tiếp theo chứa môi trường và các dịch pha

loãng thập phân

Tính số có xác suất lớn nhất của Coliforms có trong 1 ml mẫu từ số

ống có sinh khí.

Cấy lượng mẫu

Môi trường

và hóa chất

Môi trường và hóa chất Mục đích

SPW (Saline Peptine Water) Pha loãng mẫu

Môi trường và hóa chất

Thành phần Hàm lượng Vai trò

NaCl 1g Duy trì sự cân bằng thẩm thấu của môi trườngPeptone 8,5g Cung cấp các hợp chất nito và carbon, các dưỡng

chất thiết yếu như acid amin và vitamin cần cho

quá trình sinh trưởng của coliforms

Nước cất 1000ml Hòa tan các chất tan tạo dung dịch, có độ tinh

khiết cao, không nhiễm tạp chấtMôi trường SPW (Saline Peptone Water)

Thành phần nồng độ kép Môi trường nồng độ đơn Môi trường Vai trò

Tryptose 40 g 20 g Cung cấp nito, năng lượng và các khoáng chất cần thiết cho sự phát triển của vi sinh vậtLactose 10 g 5 g Coliforms sử dụng đường lên men, sinh khí

NaCl 10 g 5 g Duy trì cân bằng áp suất thẩm thấu

Dikali hydro

phosphat (K2HPO4) 5,5 g 2,75 g Làm hệ đệm ổn định pH cho môi trường trong quá

trình lên men lactose

Kali dihydro

phosphat (KH2PO4) 5,5 g 2,75 g

Natri lauryl sulfate 0,2 g 0,1 g Ức chế các vi khuẩn tạp nhiễm không phải coliforms

Nước cất 1000 ml 1000 ml Hòa tan các chất tan tạo dung dịch, có độ tinh khiết cao, không nhiễm tạp chất

Môi trường tăng sinh chọn lọc ( Lauryl Sulfate Tryptone Broth (LSB))

Môi trường và hóa chất

Môi trường khẳng định BGBL (Brilliant Green Lactose Bile Broth)

Dịch thủy phân

bằng casein 10 g

Cung cấp nito, năng lượng và các khoáng chất cần thiết

cho sự phát triển của vi sinh vật

Lactose (C12H22O11.H2O) 10 g Coliforms sử dụng đường lên men, sinh khí

Mật bò khô 20 g Kích thích sự phát triển của coliforms và ức chế các vi khuẩn gram dương

Brilliant Green 0,0133 g Ức chế sự xuất hiện của vi sinh vật không mong muốn, thuốc nhuộm coliforms

Nước 1000 ml Hòa tan các chất tan tạo dung dịch, có độ tinh khiết cao, không nhiễm tạp chất

Môi trường và hóa chất

Quy trình định lượng Coliforms

bằng phương pháp MPN

Ống nghiệm Đầu típ Ống Durham

Quy trình định lượng Coliforms bằng MPN

10g/25g mẫu rắn hoặc 10ml/25ml mẫu lỏng + 90ml SPW

Đồng nhất mẫu bằng Stomacher trong 60s

Mẫu ban đầu

3 ống nghiệm LSB

nồng độ kép

3 ống nghiệm LSB nồng độ đơn

dịch mẫu 10 -2

Ủ 30 ℃ trong 24 giờ /37 ℃ trong 24 giờ (24-48h) Ghi nhận các ống LSB (+) ở mỗi độ pha loãng

Ủ 30 ℃ trong 24 giờ hoặc 37 ℃ trong 24 giờ (24-48h) ủ 30Cấy vào ống canh BGBL, ℃ trong 24 giờ hoặc 37℃ trong 24 giờ (24-48h)

Số ống (+) ở mỗi độ pha loãng

Tra bảng MPN, biểu thị kết quả

3 ống nghiệm LSB nồng độ đơn

Pha loãng

Quy trình định lượng Coliforms bằng MPN

Quy trình định lượng Coliforms bằng MPN

Mẫu là nước ép cần tây

Chuẩn bị mẫu thử ban đầu

Lấy chính xác 10ml mẫu nước ép cần tây

vào bình tam giác có 90 ml SPW

Quy trình định lượng Coliforms bằng MPN

Đồng nhất mẫu bằng cách lắc đều bình tam giác trong 2-3 phút

Pha loãng mẫu

Dùng pipet vô trùng lấy 1 ml mẫu ban đầu

cho vào một ống nghiệm chứa 9ml dịch pha

loãng SPW vô trùng ở nhiệt độ thích hợp

Quy trình định lượng Coliforms bằng MPN

Trộn đều bằng máy vortex trong 5-10 giây để thu được dung dịch pha 10-2 .

Quy trình định lượng Coliforms bằng MPN

• Tiếp theo hút 1ml dịch pha loãng 10-2 cho

vào 3 ống LSB nồng độ đơn còn lại

• Đặt tất cả ống trên vào tủ ấm 37℃ trong 24 giờ trong

24 2h Nếu không thấy sinh khí hoặc mờ

đục thì ủ tiếp 24  2h

10 -2

10 -1

10 -1 10 -2 10 -3

Quy trình định lượng Coliforms bằng MPN

Thử nghiệm khẳng định

• Dùng que cấy vòng cấy dịch cấy từ các

ống môi trường nồng độ kép và đơn (+)

sang các ống môi trường BGBL

• Đặt vào tủ ấm 37℃ trong 24 giờ trong 24  2h, nếu

không sinh khí thì tiếp tục ủ 24  2h

BGBL (Ủ 37 ℃ trong 24-48h) trong 24-48h)

Kết quả

Kết quả

Chỉ số dương tính trên môi trường BGBL là 211 Tra bảng MPN ta có kết quả là 20

Vậy ta có số vi khuẩn Coliforms trong 1 ml mẫu là 20x10 MPN/ml

CÂU HỎI TRẮC NGHIỆM

C

D

D

D

Câu 1: Coliforms gồm có bao nhiêu loại?

A 1

B 2

Câu 2: Nhóm Coliforms bao gồm những những giống nào

B E.coli, Salmonella,Vibrio,

Klebsiella

Câu 3: Tỉ lệ dùng để pha loãng mẫu trong phương pháp trên là bao nhiêu

A 1: 1

B 1:9

Câu 4: Đâu là đặc điểm đúng về Coliforms

A Hình cầu, lên men lactose

C Hình que, lên men lactose D Hình phẩy,

không lên men lactose

B Hình sợi, không lên men lactose

Câu 5: Đâu là môi trường khẳng định của định lượng

Coliforms bằng phương pháp MPN

A LSB

B DG18

Câu 6: Coliforms ủ ấm ở nhiệt độ bao

nhiêu?

A 30-37 độ C

B 24-48 độ C

Câu 7: Thành phần Tryptone trong môi trường LSB có vai trò gì ?

A Cung cấp nitơ cho vi sinh vật

C Ổn định pH cho môi trường D Ức chế vi khuẩn tạp nhiễm

B Duy trì cân bằng thẩm thấu của

môi trường

THANKS FOR LISTENING

NHÓM 7

Tài liệu tham khảo

1) Giáo trình Phân tích vi sinh vật thực phẩm, Trường Đại học Công Thương

TP HCM, 2023

3) TCVN 4882 : 2007

2) https://microbiologynote.com/vi/most-probable-number-mpn-test/