Phương pháp rt pcr

NỘI DUNG 1Hệ thống Real Time PCR gồm máy luân nhiệt PCR được nối với máy quang phổ huỳnh quang và máy vi tínhGồm 2 quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản DNA bằng phản ứng PCR và đo độ ph

NHÓM 5

NHÓM 5

Vy Ngọc Hoàng Yến Cao Hoàng Quảng Huy

NHÓM 5

Thiết bị và kĩ thuật Công Nghệ Sinh Học

▪ Thành phần của phản ứng real-time PCR

Ghi chú Nội dung 1

Ghi chú Nội dung 2

Taqman Probe

Ghi chú Nội dung 4

▪ Cơ chế hoạt động

Ghi chú Nội dung 1

Ghi chú Nội dung 2

Một số ứng dụng phổ biến của kỹ thuật

realtime PCR

Ghi chú Nội dung 3

▪ Định lượng trình tự đích trong mẫu

▪ Định tính trình tự đích trong mẫu

NỘI DUNG 1

REAL TIME PCR

1

NỘI DUNG 1

Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích hiển thị được ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng, chính vì vậy nên được gọi là real-time

NỘI DUNG 1

Nội dung 1

Điểm khác biệt đó là real-time PCR sử

dụng chất phát huỳnh quang để máy

có thể phát hiện và đo được cường

độ tín hiệu từ chất này Khi phản ứng

nhân bản xảy ra tới một chu kỳ nhất

định, cường độ tín hiệu huỳnh quang

sẽ bắt đầu có sự gia tăng rõ rệt và

tương quan với số lượng bản sao DNA

được tạo ra.

Kết quả được thể hiện dưới dạng biểu đồ quan sát được qua mỗi chu kỳ, từ đó có thể đưa ra đánh giá về hiệu quả khuếch đại DNA mục tiêu.

NỘI DUNG 1

Trên biểu đồ khuếch đại có một thông số rất quan trọng đó là chu kỳ ngưỡng (Ct), đây là chu

kỳ mà tín hiệu huỳnh quang trong ống PCR bắt đầu vượt qua đường tín hiệu nền.

NỘI DUNG 1

Nội dung 1

Để real-time PCR xác định được chính xác số lượng bản đích ban đầu có trong mẫu thử, phải thực hiện real-time PCR các mẫu thử chứa các số lượng bản DNA đích ban đầu cần xác định số lượng cùng lúc với các mẫu chuẩn chứa số lượng DNA đích ban đầu đã biết rõ số lượng.

NỘI DUNG 1

Nội dung 1

Thành phần của phản ứng real-time PCR 1. DNA (mẫu bệnh nhân, chứng âm,

chứng dương, standard)

NỘI DUNG 1

Thành phần của phản ứng real-time PCR

Chất màu huỳnh quang chèn vào sợi đôi DNA: SYBR Green

Đặc điểm là có ái lực rất cao với sợi đôi DNA và chúng có khả năng làm cho sợi đôi DNA phát huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thước

Trong quá trình khuếch đại thì chất màu huỳnh quang sẽ chèn vào sợi đôi DNA

giai đoạn kéo dài và hệ thống nhận biết của máy sẽ ghi nhận tín hiệu huỳnh quang

ở thời điểm kết thúc của mỗi chu kỳ nhiệt

Probe (các đoạn trình tự dò): Taqman probe, Beacon probe

Probe là những đoạn trình tự oligonucleotid sợi đơn có khả năng bắt cặp đặc hiệu với DNA đích và hiện tượng bắt cặp này sẽ dẫn đến sự phát huỳnh quang

Cường độ huỳnh quang phụ thuộc vào số lượng probe bắt cặp, hay chính xác hơn

là phụ thuộc vào số lượng bản sao DNA đặc hiệu hiện diện trong ống phản ứng

NỘI DUNG 1

Nội dung 2

SYBR Green: cơ chế hoạt động

(1) Khi chưa có sản phẩm khuếch đại thì ống thứ nghiệm không phát được hùynh quang khi nhận được ánh sáng kích thích

(2) Nhưng khi có hiện diện của sản phẩm khuếch đại thì SYBR I chèn vào

và tập trung trên phân tử DNA , làm cho ống phản ứng bị phát huỳnh quang khi nhân được ánh sáng kích thích

Nội dung 3

Nội dung 3

Nội dung 3:Taqman Probe

[1] Khi chưa có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu, Taqman probe không phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích vì huỳnh quang phát ra bị quencher hấp phụ hết.

Nội dung 3:Taqman Probe

[2] (a) Khi có mặt sản phẩm khuếch đại đặc

hiệu, Taqman probe sẽ bắt cặp trên trình tự

đặc hiệu của sản phẩm khuếch đại ở giai

đoạn nhiệt độ bắt cặp sau giai đoạn biến

tính.

[2] (b) Taqman probe sẽ trở thành trình tự

cản đầu 3’ khi Taq polymerase kéo dài mồi

để bắt đầu tổng hợp sợi bổ sung.

[2] (c) Nhờ có hoạt tính 5’-3’ exonuclease

nên Taq polymerase sẽ cắt bỏ Taqman probe

làm reporter bị cắt rời xa quencher và nhờ

vậy mà huỳnh quang phát ra từ reporter sẽ

không còn bị quencer hấp phụ nữa.

[2] (d) Giai đoạn phát huỳnh quang của reporter xảy ra trong suốt quá trình Taq polymerase kéo dài mồi để tổng hợp sợi bổ sung.

2) Định tính trình tự đích trong mẫu

NỘI DUNG 1

Một số ứng dụng phổ biến của kỹ thuật realtime PCR

1)Định lượng trình tự đích trong mẫu:

▪ Định lượng tuyệt đối: Sử dụng đường chuẩn realtime PCR và Ct của mẫu

có thể tính được hàm lượng DNA trong mẫu (theo đơn vị số copy hoặc ng)

▪ Định lượng tương đối: Trong điều kiện lượng mẫu đầu vào là như nhau,

mẫu có Ct nhỏ hơn thì sẽ có hàm lượng trình tự đích cao hơn Tuy nhiên trong thực tế thì không có bằng chứng nào để khẳng định lượng mẫu đầu vào là như nhau, vì vậy cần phải có giá trị Ct tham chiếu của gene chứng nội (IC), việc so sánh sẽ diễn ra gián tiếp thông qua việc so sánh với IC Đó

là nguyên lý của phương pháp định lượng tương đối 2-ΔΔCt của Livak ΔΔCt của Livak

NỘI DUNG 1

Một số ứng dụng phổ biến của kỹ thuật realtime PCR

2) Định tính trình tự đích trong mẫu:

Giống như PCR, realtime-ΔΔCt của Livak PCR cũng có thể được sử dụng để thực hiện định

tính các tác nhân gây bệnh như vi khuẩn, virus, nấm, ngoài ra việc tối ưu trình tự mẫu dò có thể giúp phát hiện cả các đột biến điểm hay các đoạn DNA

có đa hình trình tự đơn (SNP),

Thanks For Watching!