1. Trang chủ
  2. » Giáo Dục - Đào Tạo

khuếch đại gen ssiv mã hóa cho starch synthase (ss) ở giống sắn km140 bằng phướng pháp RT PCR

13 2 0

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

THÔNG TIN TÀI LIỆU

Thông tin cơ bản

Định dạng
Số trang 13
Dung lượng 297,6 KB

Nội dung

KHUẾCH ĐẠI GEN SSIV MÃ HOÁ CHO STARCH SYNTHASE (SS) Ở GIỐNG SẮN KM140 BẰNG PHưƠNG PHÁP RT- PCR Sinh viên: Phan Thị Khánh Linh MSSV: 20162471 Đặt vấn đề  Cây sắn lương thực quan trọng giới sau lúa ngô Sắn có hàm lượng tinh bột cao với khoảng 84-87% trọng lượng khô, nguồn cung cấp carbonhydrate dồi  Sắn trồng phổ biến Việt Nam từ lâu xem lương thực thức ăn gia súc quan trọng sau lúa ngô  Việc ứng dụng công nghệ sinh học đại nghiên cứu sắn giai đoạn khởi đầu sử dụng phương pháp đơn giản nuôi cấy mô để giữ giống, nhân nhanh in vitro số giống  Như vậy, ứng dụng công nghệ sinh học nhằm cải tạo sắn theo hướng tính trạng có lợi suất cao, chất lượng phù hợp mục đích sử dụng nhằm phục vụ công nghiệp xuất vấn đề cấp thiết nước ta Qúa trình sinh tổng hợp tinh bột enzyme liên quan Vật liệu nghiên cứu  Vật liệu thực vật: giống sắn KM140 Trung tâm nghiên cứu thực nghiệm nông nghiệp Hưng Lộc, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam cung cấp Củ giống sắn thu làm vật liệu cho tách chiết RNA  Cặp mồi sử dụng Vật liệu sử dụng  Hóa chất: Kit tách chiết RNA tổng số PureLink Plant RNA Reagent (Invitrogen); kit tổng hợp cDNA RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas), dung dịch TAE 1X (40mM Tris, 20mM acetic acid 1mM EDTA); Agarose 0,8%; Ethidium bromide 0,5µg/ml, thang DNA 1kb (Thermo)  Thiết bị: Pipetman, máy soi gel (Bio-Rad), máy chụp ảnh điện di (Amersham Pharmacia Biotech), máy ly tâm (Eppendorf), điện di (Bio-Rad), máy hút chân không (Savant), máy PCR System 9700 (Appied Biosystem), bể ổn nhiệt, máy voltex v.v trang thiết bị khác Phòng Cơng nghệ tế bào thực vật Phịng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học Phương pháp nghiên cứu  Tách chiết RNA tổng số từ củ sắn  Tổng hợp cDNA  Phương pháp PCR  Phương pháp xác định trình tự nucleotit Tách chiết RNA tổng số từ củ sắn  Quy trình tách chiết RNA thực theo hướng dẫn kit PureLink Plant RNA Reagent, Invitrogen  Đầu tiên nghiền 0,1 g mẫu nitro lỏng Sau bổ sung 0,5ml PureLinkPlant RNA Reagent lạnh, đảo Ủ phút nhiệt độ phòng Rồi ly tâm 12.000 vòng phút nhiệt độ phòng Chuyển phần dịch qua ống ly tâm Bổ sung 0,1ml NaCl M, trộn Bổ sung thêm 0,3ml Chloroform, trộn Ly tâm 12.000 vòng 10 phút 4°C, chuyển pha qua ống ly tâm Thêm lần thể tích isopropanol, trộn ủ nhiệt độ phòng 10 phút Ly tâm 12.000 vòng 10 phút 4°C, bỏ phần dịch Tiếp tục bổ sung 1ml cồn 75%, trộn Ly tâm 12.000 vòng phút nhiệt độ phòng, bỏ dịch, dùng pipet cẩn thận hút hết dịch ống ly tâm Tách chiết RNA tổng số từ củ sắn  RNA tổng số sau tách chiết từ củ sắn tiếp tục loại bỏ DNA tạp nhiễm cách xử lý DNAse theo hướng dẫn nhà sản xuất (Thermo Scientific), sau tinh phương pháp tủa sử dụng dung dịch LiCl 7,5M (Ambion) Thêm tác nhân tủa vào dung dịch RNA tổng số cho nồng độ cuối LiCl dung dịch RNA đạt 2,5M, ủ mẫu -20°C 30 phút Ly tâm 13000 vòng/phút 15 phút Loại bỏ dịch rửa tủa RNA với cồn 70% lạnh để loại bỏ lƣợng muối cịn sót lại Hòa tủa RNA nước khử ion xử lý DEPC Tổng hợp cDNA  cDNA tổng hợp theo kít “RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit” (Fermentas) Phản ứng cDNA thực thể tích 20µl gồm có thành phần sau: 500 ng RNA tổng số; 1µl mồi ngẫu nhiên (Hexamer) Bổ sung nước khử ion có xử lý DEPC tới thể tích 12µl Trộn nhẹ, ủ 65°C/5phút, sau đặt vào đá Tiếp tục bổ sung thành phần vào ống phản ứng trên: 4µl đệm Reaction buffer 5X tổng hợp cDNA; 1µl riboLock Ribonuclease inhibitor (20u/l); 2µl dNTP (10 mM); 1µl enzyme M-MuLV Reverse Transcriptase (20u/µl) Trộn nhẹ cho vào máy spin sau chạy chương trình tổng hợp cDNA 25°C/5 phút; 42°C/ 60 phút Kết thúc phản ứng 70°C/5 phút Bảo quản cDNA -20°C -70°C Mẫu cDNA sau tổng hợp đƣợc sử dụng để thực phản ứng PCR Phương pháp PCR  Các đoạn gen quan tâm nhân lên cặp mồi đặc hiệu Sợi cDNA dùng làm khuôn PCR dựa sở phản ứng mở rộng primer nhờ enzyme bền nhiệt có hoạt tính 5’-3’ DNA polymerase tạo sản phẩm PCR có hai đầu để khuếch đại theo hàm mũ lên đến hàng triệu lần đoạn DNA Tuy nhiên, Taq DNA polymerase có nhược điểm khả xuất đột biến trình tổng hợp sợi cao (1 đột biến 3700 nucleotide)  Taq DNA polymerase khơng thích hợp cho nhân vùng CDS gen Pfu DNA polymerase sử dụng giải pháp thay với tỉ lệ sai sót thấp 7.7 × 10^5 tới × 10^6  Phản ứng thực với enzyme Pfu DNApolymerase chu trình nhiệt sau: 95ºC/3 phút, 32 chu kỳ (95ºC/40 giây, 55ºC/30 giây, 72ºC/4 phút 72ºC/10 phút) Sản phẩm PCR tinh sạch, tách dòng vector pBT giải trình tự sử dụng cặp mồi Frag_F/R  Sản phẩm kiểm tra gel agarose 0,8 % Phương thức xác định trình tự nucleotit  Đoạn gen quan tâm gắn vector tách dòng pBT sau tách từ khuẩn lạc, xác định trình tự máy đọc tự động ABI PRIM 3100 Avant Genetic Analyzer cách sử dụng hoá chất sinh chuẩn bigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Do kích thước gen SSIV lớn (~3,5kb) nên cặp mồi (bảng 1) dùng để nhân đoạn chồng gối nhau, sau gắn ghép lại với để thu đƣợc kích thước SSIV hồn chỉnh Thành phần chu trình nhiệt phản ứng PCR đọc trình tự máy luân nhiệt GeneAmp PCR System 9700  Sản phẩm PCR đƣợc tinh cách bổ sung 5l EDTA 125mM, 60l cồn 100% ủ nhiệt độ phịng 15 phút Tiếp ly tâm 12.000 v/p, 15 phút để kết tủa đoạn DNA, sau loại bỏ cồn Bổ sung 60l ethanol 70% ly tâm 10.000 v/p 10 phút Làm khô kết tủa DNA, bổ sung 10l Hi-DiTM Formamide biến tính 950C phút Các mẫu tra vào giếng khay đựng mẫu, sau điện di ống mao quản 80cm x 50l với polymer POP-4 TMcủa hãng ABI, Mỹ Kết xử lý phần mềm DNAstar Kết thảo luận  Kết điện di kiểm tra RNA tổng số gel agarose cho thấy RNA tổng số thu có tính tồn vẹn, khơng bị đứt gẫy, đảm bảo hàm lượng độ tinh cho thí nghiệm  Từ kết phân tích chứng tỏ phân lập thành cơng gen SSIV từ giống sắn KM140 đƣợc đăng kí trình tự ngân hàng Genbank với mã số KT033500  Đã phân lập thành cơng gen SSIV mã hóa cho enzyme starch synthase, đóng vai trị quan trọng việc tăng cường trình sinh tổng hợp tinh bột sắn phương pháp RT - PCR đăng ký ngân hàng Genbank với mã số KT033500 có kích thước 3189 bp Tài liệu tham khảo  TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 34 2017 (Nguyễn Thị Minh Hồng1 , Phạm Bích Ngọc , Lê Thu Ngọc 3)  Link báo: http://www.vjol.info/index.php/DHHD/article/viewFile/32897/27989 ... hàng Genbank với mã số KT033500  Đã phân lập thành công gen SSIV mã hóa cho enzyme starch synthase, đóng vai trị quan trọng việc tăng cường trình sinh tổng hợp tinh bột sắn phương pháp RT - PCR. .. Phương pháp PCR  Các đoạn gen quan tâm nhân lên cặp mồi đặc hiệu Sợi cDNA dùng làm khuôn PCR dựa sở phản ứng mở rộng primer nhờ enzyme bền nhiệt có hoạt tính 5’-3’ DNA polymerase tạo sản phẩm PCR. .. gel agarose cho thấy RNA tổng số thu có tính tồn vẹn, khơng bị đứt gẫy, đảm bảo hàm lượng độ tinh cho thí nghiệm  Từ kết phân tích chứng tỏ phân lập thành công gen SSIV từ giống sắn KM140 đƣợc

Ngày đăng: 03/08/2021, 13:28