Các phương pháp lai phân tử

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC CÁC PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ ThS Huỳnh Văn Biết Môn học: Sinh học phân tử Mã môn học: 211106 Thủ Đức, 4.6.2023 Thành viên tham gia Nguyễn Minh Khôi 20126271 Võ Huỳnh Thảo Vy 20126176 KHÁI NIỆM VỀ LAI PHÂN TỬ: Khái niệm lai phân tử: Hiện tượng gọi lai phân tử (molecular hybridization), với đặc điểm sau: - Đặc hiệu tuyệt đối : Sự tái bắt cặp xảy trình tự hồn tồn bổ sung chúng có nằm lẫn hàng triệu trình tự khác - Các trình tự bổ sung DNA hay RNA , dẫn đến hình thành phân tử DNA_DNA, RNA_RNA, hay phân tử lai DNA_RNA Hình a Sự lai DNA RNA Hình b Quá trình lai DNA với DNA, lai DNA với RNA 2 Các yếu tố ảnh hưởng đến lai phân tử: Nồng độ DNA thời gian phản ứng Nồng độ DNA nghĩa số lượng trình tự bổ sung, cao xác suất chúng tiếp xúc với tăng, kết tốc độ phản ứng lai phân tử tang lên.Tương tự, thời gian phản ứng dài xác suất lớn số lượng phân tử lai tăng dần đến tồn trình tự bổ sung tái bắt cặp Nhiệt độ: Độ dài trình tự Tốc độ phhản ứng lai phụ thuộc nhiệt độ Thông thường phản ứng lai cực đại nhiệt đố thấp Tm nucleic acid độ 25% Tốc độ lai tăng tỷ lệ thuận với bậc độ dài trình tự bổ sung Lực ion Nồng độ NACl 1M làm tăng tốc độ phản ứng lên đến 10 lần Nồng độ NaCl vượt q 1,2M lại hồn tồn khơng cịn tác dụng  Một vấn đề quan trọng lai phân tử tạo đầu dị có đánh dấu phóng xạ Thơng thường người ta sử dụng đầu dị DNA bổ sung (cDNA) CÁC KIỂU LAI PHÂN TỬ 01 Lai pha lỏng 02 pha Lai rắn 03 Lai chỗ (in situ hybridization) Lai pha lỏng a Nguyên tắc Các trình tự bổ sung (các mạch đơn) nằm môi trường lỏng dung dịch đệm Sự lai phân tử xảy trình tự gặp chuyển động nhiệt nhiệt độ mơi trường thấp Tm vài độ b Phân tích định lượng phân tử lai Ba phương pháp thường sử dụng là: - Phương pháp dùng quang phổ kế - Phương pháp sử dụng Nuclease S1 - Phương pháp sắc kí hydroxylapatite c Các ứng dụng phương pháp lai pha lỏng: Tính tỉ lệ % trình tự giống lồi gần nhau: khơng diện với số lượng lớn, mismatch (bắt cặp sai lệch) không ngăn cản hồn tồn q trình lai đoạn DNA lớn Ở prokaryote, động học tái bắt cặp biểu thị dạng đường cong đơn giản; điều cho thấy vận tốc tái bắt cặp tất trình tự gen nghĩa khơng có trình tự lặp lại Ở Eukaryote, đường cong phức tạp bao gồm nhiều đường cong đơn giản ; điều cho thấy có lọai trình tự DNA : (1)DNA có khả bắt cặp tức thời (Cot