Các enzyme phát triển trong sinh học phân tử

Sinh học phân tử_Nhóm 11 BÀI 4:CÁC ENZYME PHỔ BIẾN TRONG SHPT I DNA polymerase: - Các DNA polymerase enzyme chịu trách nhiệm xúc tác cho trình trùng hợp chuỗi DNA trình chép phân tử - Chức kết hợp triphosphate deoxyribonucleotide với chuỗi mẫu Nó tham gia sửa chữa DNA Enzyme cho phép kết hợp xác sở DNA chuỗi khuôn chuỗi mới, theo sơ đồ A, kết hợp với T G với C + Tổng hợp chuỗi polymer từ dNTP + Gắn nucleotide vào đầu 3’-OH primer có sẵn + Không thể tổng hợp chuỗi polynucleotide từ đầu (de novo) + Xúc tác gắn nucleotide vào đầu 3’-OH primer có sẵn - Hầu hết polymerase dùng SHPT có nguồn gốc từ vi khuẩn từ virus kí sinh chúng 1) DNA polymerase prokaryote: - Ở Prokaryote (sinh vật khơng có nhân thực sự, phân định màng) có ba loại DNA Polymerase: Pol I, Pol II, Pol III Cả loại có hoạt tính xúc tác kéo dài 5’3’ với tốc độ khác hoạt tính 3’5’ exonuclease + Pol I: cịn có hoạt tính 5’3’ exonuclease Được coi vai trò enzyme chép chủ yếu + Pol II: tham gia sửa chữa DNA hoạt động exonuclease theo hướng 3’5’ + Pol III: phức hợp enzyme điều khiển q trình tái - DNA Pol I E coli gồm phần: + Phân đoạn lớn đoạn Klenow có hoạt tính 5’3’ polymerase 3’5’ exonuclease; + Phân đoạn nhỏ có hoạt tính 5’3’ exonuclease - T4 DNA polymerase thực khuẩn thể cần khuôn primer để hoạt động: + 5’3’ polymerase có dNTPs + 3’5’ exonuclease khơng có dNTPs + Khơng có hoạt tính 5’3’ exonuclease Có thể sử dụng T4 DNA polymerase kỹ thuật nick translation hay gắn nhãn đầu 3’ DNA sợi đôi - DNA polymerase T7 thực khuẩn thể công cụ lí tưởng cho việc giải trình tự DNA Dạng chỉnh sửa enzyme có tốc độ polymer hóa 300 nucleotide/giây - Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) xúc tác việc bổ sung homopolymer vào đầu 3’OH DNA không cần khuôn mẫu TdT sử dụng dán nhãn DNA với nucleotide biến đổi (ddNTP, DIG-dUTP), kéo dài primer giải trình tự DNA TdT cần DNA primer sợi đơn có Mg 2+, chấp nhận DNA sợi đơi primer có CO2+ Sinh học phân tử_Nhóm 11 2) Polymerase bền nhiệt: a, Bst polymerase DNA Pol I bền nhiệt phân lập từ vi khuẩn chịu nhiệt Bacillus stearothermophilus (Bst) - Bst Pol I hoạt động tốt 65oC, bị bất hoạt 75oC 15 phút - Hoạt tính 5’3’ exonuclease đạt mức cao có nồng độ Mg2+ cao - Bst Pol I gồm phân đoạn protein Phân đoạn lớn bền nhiệt hữu dụng phản ứng giải trình tự 65oC b, Taq polymerase: tinh lần vào năm 1976 từ vi khuẩn Thermophilus aquaticus (vi khuẩn sống nhiệt độ 70oC - 80oC) Có hoạt tính tối đa đạt 80 độ cần Mg2+ Thiếu hoạt tính 3’5’ exonuclease (hoạt tính sửa sai, proofreading), enzyme có độ xác thấp c, Tth polymerase: phân lập từ Thermus thermophilus, có khối lượng 94 kDa, thiếu hoạt tính 3’5’ exonuclease Xúc tác chép DNA: + Từ khuôn DNA với Mg2+ + Từ khuôn RNA (phiên mã ngược) với Mn2+ 3) DNA polymerase eukaryote: - Eukaryote (sinh vật có nhân thực sự, phân định màng) có năm polymerase DNA Được ký hiệu chữ bảng chữ Hy Lạp: α, β, γ, δ, ε - Chức năng: Polymerase γ nằm ty thể chịu trách nhiệm chép vật chất di truyền bào quan tế bào Ngược lại, bốn chất cịn lại tìm thấy nhân tế bào tham gia vào trình chép DNA nhân Sinh học phân tử_Nhóm 11 II RNA polymerase: - RNA polymerase phụ thuộc DNA xúc tác phản ứng tổng hợp RNA từ khuôn DNA theo chiều 5’->3’ - RNA polymerase sử dụng nhiều SHPT SP6 T7 RNA polymerase + SP6 RNA polymerase chuỗi polypeptide 96 kDa tinh từ Salmonella typhimurium LT2 bị xâm nhiễm thực khuẩn thể SP6 + T7 RNA pol chuỗi polypeptide 98 kDa sản xuất thực khuẩn thể T7 - RNA polymerase sử dụng tổng hợp antisense RNA in vitro, tạo probe RNA có gắn nhãn - SP6 T7 RNA polymerase cần Mg2+ khuôn DNA sợi đôi - SP6 T7 RNA polymerase đặc hiệu promoter phiên mã trình tự DNA tạo dịng kiểm sốt promoter tương ứng (SP6 T7) - Quá trình phiên mã SP6 hay T7 RNA polymerase diễn đến hết phần poly(A) khn mẫu dạng trịn, q trình lặp lại nhiều lần trước RNA polymerase tách - Làm thẳng mạch khuôn trước dịch mã đảm bảo kết thúc hiệu q trình phiên mã Sinh học phân tử_Nhóm 11 III Ligase: - Khái niệm: Enzyme Ligaza (tiếng Anh: Ligase, hay gọi DNA ligase) chất xúc tác hai loại phân tử lớn enzyme liên kết hóa học với nhau, thường liên quan đến nhóm thủy phân phân tử - DNA ligase enzyme quan trọng thể sinh vật, phản ứng xúc tác đóng vai trị quan trọng q trình chép sửa chữa DNA - DNA ligase chia thành hai loại: Một hình thành phụ thuộc liên kết phosphodiester hai sợi nucleotide sử dụng lượng ATP xúc tác ATP DNA ligase, loại khác sử dụng nicotinamide adenine dinucleotide Năng lượng acid (NAD+) xúc tác hình thành liên kết phosphodiester hai chuỗi nucleotide, DNA ligase phụ thuộc NAD - DNA Ligase, gọi enzyme liên kết DNA, đóng vai trị đặc biệt quan trọng sinh học phân tử, kết nối đầu 3'-OH bazơ chuỗi DNA với đầu 5'- bazơ liền kề P -terminus, hai tạo liên kết phosphodiester, kết nối hai bazơ liền kề Sự xúc tác ligase đòi hỏi tiêu thụ ATP - Giới thiệu: DNA ligase, gọi enzyme liên kết DNA, đóng vai trị đặc biệt quan trọng sinh học phân tử, liên kết hai đoạn DNA thành Bất kể DNA sợi kép hay sợi đơn liên kết, enzyme liên kết DNA kết nối đầu 3' DNA với đầu ' DNA cách hình thành liên kết phosphate Mặc dù có protein khác tế bào, ví dụ, DNA polymerase sử dụng sợi DNA làm khuôn mẫu để bẻ gãy sợi DNA phía bên để tạo thành liên kết phosphodiester thơng qua trình trùng hợp để liên kết DNA (DNA ligase nối đoạn DNA lại với để khôi phục liên kết phosphodiester hai nucleotide bị cắt enzyme giới hạn) Tuy nhiên, q trình kết dính DNA polymerase chức ngẫu nhiên phản ứng trùng hợp, công việc thực phản ứng kết dính DNA tế bào enzyme kết dính DNA chi phối - Chức năng: Enzyme liên kết ADN liên kết ADN bị đứt gãy, có phản ứng tái ADN sửa chữa ADN tế bào liên quan đến việc tổng hợp đoạn ADN đứt gãy, đó, enzyme liên kết ADN đóng vai trị quan trọng hai chế Ngồi phản ứng kết dính tế bào, với phát triển sinh học phân tử, hầu hết phịng thí nghiệm sinh học phân tử sử dụng enzyme liên kết DNA để thực thí nghiệm DNA tái tổ hợp, có lẽ xếp vào chức quan trọng khác - Lịch sử tìm thấy: DNA ligase lần phát ba phịng thí nghiệm vào năm 1967 Sau nhiều thập kỷ nghiên cứu, nhà khoa học phát DNA ligase tìm thấy virus, vi khuẩn sinh vật nhân chuẩn, chế hoạt động loại DNA ligase khác Trong trường hợp bình thường, ligase DNA chia thành adenosine triphosphate (ATP) loại phụ thuộc nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) loại phụ thuộc theo nguồn lượng cần thiết cho phản ứng xúc tác DNA ligase Ligase DNA phụ thuộc có mặt rộng rãi eukaryote, vi khuẩn cổ, vi khuẩn vi rút, nicotinamide Sinh học phân tử_Nhóm 11 adenine dinucleotide DNA ligase phụ thuộc phân bố vi khuẩn cổ, vi khuẩn virus - Sử dụng: DNA ligase chủ yếu sử dụng kỹ thuật di truyền để lắp ráp lại đầu dính bị "cắt ra" endonucleases giới hạn, gọi "khâu di truyền" + E coli DNA ligase đề cập PEP Sinh học Trung học Tự chọn có nguồn gốc từ Escherichia coli sử dụng để kết nối đầu dính ; ligase T4DNA, có nguồn gốc từ thực khuẩn thể T4, sử dụng để kết nối đầu dính phẳng, hiệu thắt thấp - Phân loại: Ligase phân loại EC6 số EC, chia nhỏ thành loại phụ: (1) bao gồm ligase tạo liên kết CO (2) bao gồm ligase tạo thành liên kết CS (3) bao gồm ligase tạo thành liên kết CN (4) bao gồm ligase tạo thành liên kết CC (5) bao gồm ligase tạo liên kết phosphoester (6) bao gồm ligase tạo thành liên kết kim loại N IV Phosphatase: Alkaline phosphatase (AP) có nhiều gan, thận, mật, thai, xương AP tinh từ E coli sinh vật bậc cao, sử dụng để loại bỏ nhóm 5’-phosphate khỏi nucleic acid để ngăn chặn đóng vịng DNA vector thí nghiệm tạo dịng AP bị bất hoạt tác nhân tạo phức (chelating agents) EGTA, nồng độ thấp phosphate vô T4 polynucleoide kinase xúc tác phản ứng chuyển nhóm phosphate từ phân tử ATP đến đầu 5’-OH nucleic acid, trao đổi nhóm 5’-phosphate, hay phosphoryl hố đầu 3’ mononucleotide Sinh học phân tử_Nhóm 11 V Kinase T4 polynucleotide kinase: li trích từ phage T4 xâm nhiễm E Coli Bacteriophage T4 polynucleotide kinase (Bacteriophage T4-infected E coli) Enzyme bacteriophage T4 polynucleotide kinase xúc tác chuyển nhóm γ-phosphate ATP tới đầu 5’ DNA RNA Hai loại phản ứng thường xảy phản ứng thuận phản ứng trao đổi Trong phản ứng thuận, nhóm γ-phosphate chuyển tới đầu 5’ DNA dephosphoryl hóa (mất nhóm phosphate) Trong phản ứng trao đổi, có ADP thừa, enzyme chuyển nhóm 5’ phosphate từ DNA phosphoryl hóa tới ADP, DNA sau phosphoryl hóa trở lại cách nhận nhóm γ-phosphate đánh dấu đồng vị phóng xạ từ phân tử [γ-32P] ATP.γ-32P] ATP - Ứng dụng chính: + Đánh dấu phóng xạ đầu 5’ DNA để phân tích trình tự phương pháp Maxam Gilbert (1977), dùng làm mẫu dò kỹ thuật lai phân tử + Phosphoryl hóa đoạn nối (linker) đoạn DNA khơng có nhóm 5’ phosphate để chuẩn bị cho phản ứng gắn phương pháp tạo dòng Phage Viết tắt bacteriophage (thực khuẩn thể), loại virus xâm nhiễm sinh sản bên vi khuẩn Phage thường có vỏ bọc protein, phức hợp bao gồm phần đầu có hình đa diện chứa nucleic acid mà qua nucleic acid xâm nhập vào vi khuẩn chủ Sau trình nhân lên nucleic acid phage, tế bào vi khuẩn chủ thường bị tan biến Loại phage luôn làm tan tế bào vi khuẩn chúng xâm nhiễm vi khuẩn gọi phage độc Ví dụ: phage T4 Ngược lại, cịn có phage ơn hịa, xâm nhiễm vi khuẩn gây nên phản ứng tiềm tan, nghĩa hệ gen phage gắn vào nhiễm sắc thể vi khuẩn chép với nhiễm sắc thể Hệ gen phage trạng thái gắn với nhiễm sắc thể vi khuẩn gọi prophage Sinh học phân tử_Nhóm 11 VI Nuclease: Định nghĩa Nuclease thuật ngữ sử dụng cho loại enzyme tách nucleic acid Chúng gọi nucleodepolymerase polynucleotide Nuclease thuộc lớp enzyme hydrolase thực vai trò cụ thể Các ribonuclease hoạt động ribonucleic acid (RNA) deoxyribonuclease hoạt động axit deoxyribonucleic (DNA) Một số enzyme có vai trị chung phosphodiesterase, thủy phân este axit phosphoric, gọi nuclease nucleic acid bị ảnh hưởng hoạt động chúng Hạt nhân có thực vật động vật Chức hạt nhân Nuclease có vai trị cắt liên kết phosphodiester nucleotide axit nucleic gây đứt gãy sợi đơn sợi đôi phân tử mục tiêu chúng Chúng cần thiết sinh vật sống số khía cạnh sửa chữa DNA chúng Nếu có khiếm khuyết số nuclease định, gây suy giảm miễn dịch ổn định di truyền Các hạt nhân đóng vai trị quan trọng nhân phân tử Các loại hạt nhân Nuclease phân thành hai loại lớn dựa địa điểm hoạt động: Exonuclease Endonuclease Exonuclease tiêu hóa axit nucleic từ đầu Endonuclease hoạt động vùng trung tâm phân tử mục tiêu Các loại phân loại thành deoxyribonuclease ribonuclease Các deoxyribonuclease (DNA nuclease) hoạt động DNA, ribonuclease hoạt động RNA 3.1 Exonuclease: Eukaryote ( sinh vật nhân thực) Exoribonuclease ribonuclease exonuclease, enzyme thủy phân RNA cách loại bỏ nucleotide đầu cuối từ đầu ‘hoặc đầu 3’ phân tử RNA 5’-3’ Exoribonuclease (XRN-1) thủy phân RNA theo chiều 5’-3’ XRN-2 phân giải RNA dư thừa theo chiều 5’-3’ Sinh học phân tử_Nhóm 11 Sau RNA bị cắt Prokaryote ( sinh vật nhân sơ) Exonuclease I tách DNA sợi đơn theo chiều 3’-5’ giải phóng deoxyribonucleoside monophosphate Exo-III hoạt động DNA sợi đơi cắt theo chiều 3’-5’ Sinh học phân tử_Nhóm 11 Exo-V Rec BCD Và vài Endonuclease Phân cắt vùng bên củ phân tử :> 3.2 Micrococcal Nuclease Nuclease vi khuẩn loại endonuclease chủ yếu tiêu hóa DNA RNA sợi đơn, đặc biệt vùng giàu AU AT Enzyme tiêu hóa DNA RNA sợi đơi thành phần quan trọng xét nghiệm ức chế miễn dịch nhiễm sắc thể (ChIP) Nuclease Sinh học phân tử_Nhóm 11 Micrococcal tiêu hóa liên kết 5’-phosphodiester RNA DNA, đồng thời tạo mononucleotide oligonucleotide 3’-phosphate Nó cần Ca 2+ làm đồng sáng lập để thực chức bị bất hoạt hoàn toàn EGTA EDTA 3.3 Mung Bean Nuclease Mung bean nuclease endonuclease sợi đơn (ssDNA RNA) giúp loại bỏ phần mở rộng sợi đơn DNA sợi đơi Nó sử dụng để loại bỏ phần nhô sợi đơn 3’ 5’ khỏi DNA sợi kép để tạo đầu cùn Nó tách RNA DNA sợi đơn, tách vùng sợi đơn kẹp tóc DNA giúp lập đồ phiên mã RNA 3.4 Deoxyribonuclease ( viết tắt DNase ) Dùng để nhóm glycoprotein endonuclease enzym xúc tác q trình phân cắt thủy phân liên kết phosphodiester xương sống DNA , làm thối hóa DNA Vai trò enzyme DNase tế bào bao gồm phá vỡ DNA ngoại bào (ecDNA) tiết trình chết theo chương trình , hoại tử bẫy ngoại bào bạch cầu trung tính (NET) tế bào để giúp giảm phản ứng viêm mà không gây Nhiều loại deoxyribonuclease biết đến thuộc hai họ( DNase Ihoặc DNase II), khác đặc tính chất , chế hóa học chức sinh học chúng Các ứng dụng phịng thí nghiệm DNase bao gồm protein tinh khiết chiết xuất từ sinh vật nhân sơ Dnase I (Deoxyribonuclease I) Là glycoprotein 31 kDa thường dạng hỗn hợp gồm isoenzyme (A, B, C, D) Bị bất hoạt 75oC 5’ với EGTA mM Ưu tiên xúc tác phản ứng cắt vị trí 3’ pyrimidine Là endonuclease thuộc họ DNase mã hóa gen người DNASE1 DNase I nuclease tách DNA tốt liên kết phosphodiester liền kề với nucleotide pyrimidine, tạo polynucleotide kết thúc 5'-phosphate với nhóm hydroxyl tự vị trí 3', trung bình tạo tetranucleotide Nó hoạt động DNA sợi đơn, DNA sợi kép chất nhiễm sắc Ngồi vai trị endonuclease quản lý chất thải , cịn đề xuất deoxyribonucleasechịu trách nhiệm cho phân mảnh DNA trình chết rụng tế bào DNase I liên kết với actin protein tế bào Nó liên kết monome actin có lực cao (dưới nanomol) polyme actin có lực thấp Chức tương tác không rõ ràng Tuy nhiên, DNase I gắn với actin không hoạt động mặt enzyme, nên phức hợp DNase-actin dạng lưu trữ DNase I để ngăn chặn phá hủy thông tin di truyền Protein lưu trữ hạt zymogen vỏ hạt nhân hoạt động cách tách DNA theo cách phân giải nội nhân Dnase II (Deoxyribonuclease II) Là endonuclease thủy phân liên kết phosphodiester deoxyribonucleotide DNA tự nhiên DNA biến tính, tạo sản phẩm có '-photphat đầu 5'-hydroxyl, xảy chế phân cắt sợi đơn Đúng tên gọi, hoạt động tối ưu pH axit thường tìm thấy mơi trường pH thấp lysosome Sinh học phân tử_Nhóm 11 Hoạt động DNase diễn theo ba giai đoạn Giai đoạn ban đầu giới thiệu nhiều mũi nhọn xương sống phosphodiester Giai đoạn thứ hai tạo nucleotide hòa tan axit Giai đoạn thứ ba, giai đoạn cuối, bao gồm dịch chuyển siêu sắc giảm oligonucleotide Có số DNase II biết, bao gồm: DNase II alpha (thường gọi DNase II), cho biểu phổ biến mô người Người ta chứng minh đột biến enzyme chuột dẫn đến suy thối DNA q trình chết theo chương trình DNase II beta (còn gọi DLAD, DNase II-Like Acid DNase), chủ yếu biểu thủy tinh thể mắt tuyến nước bọt Một chức xóa DNA khỏi thủy tinh thể mắt Mức độ thấp phát phổi, tuyến tiền liệt hạch bạch huyết Sự thiếu hụt enzym chuột dẫn đến phát triển bệnh đục thủy tinh thể Nhận biết vùng Trước tách phân tử, nuclease phải liên kết với axit nucleic Nó địi hỏi mức độ nhận dạng định hạt nhân sử dụng liên kết cụ thể không đặc hiệu phương tiện liên kết nhận biết chúng Cả hai chế độ phương tiện đóng vai trị quan trọng sinh vật sống, đặc biệt lĩnh vực sửa chữa DNA Các endonuclease khơng đặc hiệu có liên quan đến DNA qt DNA để tìm hư hỏng trình tự mục tiêu Loại nuclease khuếch tán với DNA gặp mục tiêu Sau đó, phần cịn lại vị trí hoạt động trộn lẫn với nhóm hóa học DNA Đối với endonuclease BamHI, EcoRV PvuII, tương tác tĩnh điện DNA diện tích bề mặt tối thiểu protein liên quan đến liên kết khơng đặc hiệu Hình dạng tổng thể DNA không bị biến dạng liên kết yếu này, dạng Beta Ngược lại, vùng cụ thể nuclease hình thành liên kết mạnh nhiều Chúng hút DNA vào rãnh sâu miền liên kết DNA chúng Nó gây biến dạng đáng kể cấu trúc bậc ba DNA thực với bề mặt giàu dư lượng tích điện dương Các hạt nhân tham gia vào tương tác tĩnh điện với DNA cách rộng rãi Một số hạt nhân liên quan đến sửa chữa DNA phần trình tự cụ thể Tuy nhiên, phần lớn hạt nhân không đặc hiệu nhận bất thường cấu trúc tạo xương sống DNA cách sử dụng cặp sở không khớp Ứng dụng Nick translation Là kỹ thuật quan trọng sử dụng để chuẩn bị đầu dò có nhãn hiệu cho kỹ thuật sinh học phân tử khác blotting, lai tạo chỗ 999, lai tạo huỳnh quang 999 chỗ 999 Nó in vitro phương pháp ghi nhãn DNA Đầu dò DNA sử dụng để xác định trình tự ADN RNA cụ thể Với trợ giúp đầu dị ghi nhãn, mảnh cụ thể đánh dấu hình dung từ hỗn hợp axit nucleic Do đó, đầu dị nhãn chuẩn bị cách sử dụng kỹ thuật khác để sử dụng cho kỹ thuật khác Sinh học phân tử_Nhóm 11 Nick translation phương pháp tạo máy dị nhãn với trợ giúp enzyme DNase DNA polymerase