161 2. Phương pháp mẫu dò lạnh (cold probe) Trước đây các phương pháp lai đều sử dụng mẫu dò đánh dấu phóng xạ. Về sau thay vì chế tác và sử dụng những mẫu dò phóng xạ người ta kết hợp kháng thể với enzyme và lợi dụng hoạt tính của enzyme để phát màu cơ chất giúp phát hiện băng đặc hiệu, được gọi là phương pháp mẫu dò lạnh. Nhìn chung phương pháp sử dụng mẫu dò lạnh có độ phiền phức và mất thời gian tương tự phương pháp sử dụng mẫu dò phóng xạ....
161 Phương pháp mẫu dò lạnh (cold probe) Trước phương pháp lai sử dụng mẫu dò đánh dấu phóng xạ Về sau thay chế tác sử dụng mẫu dị phóng xạ người ta kết hợp kháng thể với enzyme lợi dụng hoạt tính enzyme để phát màu chất giúp phát băng đặc hiệu, gọi phương pháp mẫu dị lạnh Nhìn chung phương pháp sử dụng mẫu dị lạnh có độ phiền phức thời gian tương tự phương pháp sử dụng mẫu dị phóng xạ Trong trường hợp tính bổ sung mẫu dị với DNA tế bào trở nên giảm nên bước rửa cần phải nhẹ nhàng Nếu sử dụng mẫu dò phóng xạ việc kiểm tra chất lượng q trình rửa thực nhờ máy đo phóng xạ dễ dàng, rửa chưa đủ nên cịn độ phóng xạ cao tiếp tục rửa giảm xạ Phương pháp mẫu dò lạnh khơng có ưu điểm này, phải thực chọn đến phát màu Ví dụ mơ tả phương pháp mẫu dò lạnh với probe hãng Amersham Life Science gọi phương pháp ECL 162 kb cặp băng chung bố cặp băng chung mẹ cặp băng chung bố Hình 17: Kết xét nghiệm DNA finger print xác nhận huyết thống (tìm bố sinh học cho con) Làn 1: DNA bố hộ tịch, 2: DNA bố sinh học, 3: DNA 4: DNA mẹ Con mẹ bố sinh học có băng giống Trong trường hợp probe kết hợp trực tiếp với enzyme kiểm xuất film phát huỳnh quang tổ hợp phản ứng hóa học phát Thời gian lộ quang khoảng (trong lúc Hyperfilm đặt ép lên màng Saran wrap phủ màng phản ứng, sau rửa film đọc kết Phương pháp đơn giản, thực đọc thuyết minh cách dễ dàng Người ta sử dụng vào việc giám biệt quan hệ huyết thống (tìm bố thực hay bố sinh học cho ) Từ DNA hai người bố người mẹ có khoảng 10 băng nhìn thấy rõ - băng mờ Trong băng có nhiều băng có khác biệt độ lớn, nhờ hình thành dấu "vân tay" DNA riêng biệt cá thể Có thể nhìn thấy đồng thời tính đa hình đoạn hạn chế nhiều đoạn DNA Tuy nhiên, quan sát kỹ băng dấu "vân tay" DNA định thấy số băng DNA người có độ dài tương tự 163 với số băng nhìn thấy DNA bố thực (bố sinh học) số khác thấy DNA mẹ thực Còn DNA bố hộ tịch hồn tồn khơng có băng có độ dài tương tự băng DNA (cũng mẹ) Phương pháp áp dụng việc đồng định cá thể (xác định tội phạm ), giám biệt cha mẹ - kiểm tra xác nhận kết bám, khu trú tế bào người cho thể người nhận *Các bước kỹ thuật: 1) Các mẫu DNA (của con, bố hộ tịch bố sinh học mẹ) phải xử lý Chiết xuất tinh chế DNA, đo hàm lượng (khoảng µg DNA µl cho loại phản ứng cắt enzyme hạn chế vừa) 2) Ủ DNA tế bào với loại enzyme hạn chế chọn Nên dùng enzyme nhận biết cắt base Nếu cần, sử dụng đồng thời hai enzyme cho ống phản ứng 3) Xử lý phenol: cho thêm phenol vào ống trộn để khoảng phút nhiệt độ phòng băng (nước đá), quay li tâm phút 2.000 - 3.000 v/ph để lớp phenol (cùng với tủa protein) tách khỏi lớp nước chứa DNA hòa tan Hút lấy lớp nước này, trộn dịch màu 4) Chuẩn bị gel agarose TBE trình bày trước Nồng độ agarose cao (1,2 - 2%) để tăng độ phân giải 5) Điện di với dung dịch đệm TBE, không cần nhuộm ethidium bromide 6) Làm biến tính (phương pháp kiềm, sau trung hịa) 7) Chuyển qua màng (nylon, nitrocellulose) Có thể tăng cố định DNA màng cách để khoảng - cm đèn tử ngoại chiếu tử ngoại phút Làm khô (với phương pháp làm khô nhanh tốt) 8) Lai tiền khởi (khoảng - khoảng 35 ºC, nhiệt độ cao hay thấp tính tùy theo độ dài mẫu dị tỷ lệ G+C đó) 9) Lai với mẫu dị minisatellite đánh dấu enzyme (khoảng 10 hay qua đêm khoảng 35 ºC) 10) Rửa màng TBE, thay dịch rửa số lần 11) Không làm khô màng, cho màng vào túi polyethylene thêm vào dịch chất màu (ECL, CDP-Star, hãng Amersham) tương ứng với enzyme Hàn kín cạnh túi máy ép gia nhiệt 164 12) Đưa vào buồng tối để hình, ép Hyperfilm lên màng Để tự ký qua đêm −20 hay −70 ºC Rửa ảnh film Hong khô film Đọc phân tích kết Chú ý: Thuộc nhóm mẫu dị quang hóa học (Chemilluminescent probe) cịn có LumiGLO hãng Cruachem Inc., CSPD hãng ICN Pharmaceuticals 165 TÀI LIỆU THAM KHẢO Phạm Thành Hổ 2000 Di truyền học Nxb Giáo dục, Hà Nội Applied Biosystems, Inco 1991 High-quality template DNA for Taq Cycle Sequencing Using DyedeoxyTM Terminator: An improved preparation procedure DNA sequencing Model 373A User Bulletin 18.1-4 Birnboim H C & Doly J 1979 A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA Nucleic acids Res 7: 1513-1523 Cann A J 2001 Principles of molecular virology, 3rd ed Academic Press, London Matsumoto S 1990 Rabomanuaru idenshi kougaku (Cẩm nang di truyền tử công học) Maruzen Kabushiki Kaisha, Tokyo Pham H.-S., Kiuchi A & Tabuchi K 1999 Methods for rapid cloning and detection for sequencing of cloned inverse PCR-generated DNA fragments adjacent to known sequences in bacterial chromosome Microbiol Immunol 43: 928-836 Persing D H., Smith T F., Tenover F C & White T J 1993 Diagnostic molecular microbiology: Principles and applications American Association for Micrrobiology, Washington, DC Sambrook J., Russell D T., & Russell D W 2000 Molecular cloning, a laboratory manual 3rd ed Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York Sanger F., Nicklen S & Coulsen A R 1977 DNA sequencing with chainterminating inhibitors Proc Natl Acad Sci U S A 71: 1342-1346 10 Surzycki S 2000 Basic techniques in molecular biology Springer, Berlin 1 Weisburg W G., Barns S M., Pelletier D A & Lane D J 1991 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study J Bacteriol 173: 697703 166 MỤC LỤC Lời mở đầu Chương Những thao tác I Dụng cụ hóa chất Dụng cụ Hóa chất 2.1 Những điều ý chung 2.2 Dung dịch gốc II Điện di Điện di agarose Điện di polyacrylamide Thu hồi đoạn DNA từ gel điện di III Chiết suất phenol Chế phenol Chiết xuất phenol chlorform IV Cơ đặc thẩm tích Cơ đặc Thẩm tích V Phương pháp định lượng acid nucleic (DNA RNA) Phương pháp quang học Phương pháp định lượng điện di Phương pháp nhỏ giọt định lượng acid nucleic 3 4 8 11 15 19 19 20 21 21 22 24 24 24 25 Chương Kỹ thuật tái tổ hợp DNA 26 I Điều chế DNA plasmid Điều chế lượng nhỏ DNA plasmid 1.1.Phương pháp Birnboim 1.2 Phương pháp đun sôi Điều chế lượng lớn DNA plasmid 2.1 Nuôi cấy vi khuẩn 2.2 Chiết xuất DNA 2.3 Điều chế plasmid li tâm phân đoạn mật độ cesium chloride (CsCl) II Điều chế DNA phage λ Phương pháp xác định hiệu giá phage Điều chế lượng nhỏ DNA phage 26 26 26 28 28 28 29 29 32 32 32 167 2.1 Phương pháp điều chế dịch phage dung khuẩn 2.2 Điều chế lượng nhỏ DNA phage Điều chế lượng lớn DNA phage 3.1 Phương pháp chế dịch phage dung khuẩn 3.2 Điều chế DNA III Điều chế DNA tế bào động vật IV Phương pháp đánh dấu DNA Phương pháp dịch khấc (nick-translation method) Phương pháp mồi đúp (multiprime method) Đánh dấu đầu mút 3.1 Đánh dấu đầu 5' 3.2 Đánh dấu đầu 3' Lọc gel 4.1 Sephadex 4.2 Phương pháp spin column (cột li tâm) (bằng Bio-Gel P-60) Phương pháp đánh dấu mẫu dò digoxygenin 5.1 Đánh dấu digoxygenin nhờ phương pháp nhiều mồi 5.2 Đánh dấu digoxygenin nhờ PCR V Điều chế RNA Phương pháp guanidine thiocyanate Phương pháp phenol nóng VI Chế thư viện DNA bổ sung (cDNA liabrary) Điều chế RNA-polyA nhờ cột cellulose gắn d(T) Phân đoạn nhờ li tâm chênh lệch nồng độ saccharose Tổng hợp cDNA Sàng lọc (screening) thư viện cDNA λgt 10 nhờ mẫu dò DNA tổng hợp Sàng lọc (screening) thư viện cDNA λgt 10 nhờ mẫu dò (probe) DNA dòng hóa Sàng lọc thư viện cDNA λgt 11 nhờ mẫu dò kháng thể VII Tạo dòng DNA gen (DNA genome cloning) Vector phage Vector plasmid cosmid VIII Tạo tế bào khả biến hay chịu di nạp (competent cell) Phương pháp CaCl2 Phương pháp Hanahan Sử dụng tế bào khả biến IX Subcloning (tái tạo dòng thuần) Điều chế vector plasmid Điều chế DNA cần gắn 33 33 34 34 35 37 39 40 40 41 41 41 41 41 42 43 43 44 46 46 47 49 49 51 52 57 62 63 66 67 71 75 75 76 77 78 78 78 168 X Phân tích điều tiết phiên mã nhờ thử nghiệm CAT (CAT assay) Thí nghiệm chính: di nạp gen vào tế bào eukaryota CAT assay Chương Kỹ thuật phân tích xác nhận phân tử I Kỹ thuật lai Southern (Southern hybridization) Chuyển Southern (Southern transfer) Lai (hybridization) Lai gel khô II Lai Northern (Northern hybridization) lai thẩm đốm (dot blot hybridization) Northern hybridization (biến tính RNA formaldehyde) Dot blot hybridization (sử dụng hydroxymethyl thủy ngân) III Phương pháp xác định trình tự nucleotide DNA Phương pháp dideoxy 1.1 Điều chế DNA khuôn 1.2 Điều chế dung dịch nucleotide cho phản ứng dideoxy 1.3 Gắn kết DNA khuôn với mồi 1.4 Phản ứng dideoxy 1.5 Sequencing gel (gel giải trình) 1.6 Sequencing DNA với máy luân nhiệt DNA-Sequencer tự động Phương pháp Maxam-Gilbert 2.1 Đánh dấu hóa học 2.2 Phân giải piperidine điện di gel Phương pháp xác định trình tự nucleotide nằm kề đoạn DNA biết IV Phương pháp mapping nối dài mồi (primer) S1 mapping Phương pháp nối dài mồi 2.1 Phương pháp sử dụng DNA hai sợi 2.2 Phương pháp sử dụng primer tổng hợp Mapping riboprobe (riboprobe mapping) V Hệ phiên mã in vitro Phương pháp điều chế dịch chiết thô tế bào HeLa 1.1 Dịch chiết xuất toàn tế bào 1.2 Dịch chiết xuất S-100 1.3 Dịch chiết xuất nhân Phiên mã in vitro (run-off assay) 2.1 Sử dụng promoter rDNA người với pol I 81 81 82 84 84 84 86 87 90 90 91 93 94 95 97 98 99 101 103 106 107 108 109 110 110 111 111 112 113 115 115 115 116 117 118 118 169 2.2 Sử dụng hệ pol II với promoter major late Ad 2.3 Điện di gel agarose VI Thử nghiệm run-on nhân Phân li nhân Thẩm đốm lên màng Điều chế RNA tổ chức Hybridization VII Phân tích xê dịch gel (gel shift analysis) VIII Thí nghiệm cản trở kết hợp methyl hóa dimethyl sulfate (DMS) IX Phương pháp "vết chân" (foot print) nhờ DNase I X Phân tích protein Định lượng protein (phương pháp Bradford) 1.1 Điều chế hóa chất 1.2 Định lượng Điện di SDS-polyacrylamide 2.1 Chế tác gel SDS-polyacrylamide 2.2 Điều chế mẫu, điện di nhuộm Phương pháp thẩm Western 3.1 Blotting 3.2 Nhuộm kháng thể XI Tinh chế protein kết hợp DNA nhờ sử dụng trình tự DNA đặc hiệu Điều chế DNA Kết hợp DNA với sepharose hoạt hóa CNBr Tinh chế protein cột Sepharose kết hợp DNA có trình tự base đặc hiệu XII South-Western hybridazation Điều chế dịch chiết xuất tế bào Phương pháp South-Western blot (thẩm South-Western) XIII Phương pháp tạo thể đột biến nhân tạo Chế tác thể đột biến khuyết tổn 1.1 Tiêu hóa phần Bal 31 1.2 Tạo dòng phụ (subcloning) đoạn khuyết tổn Chế tác thể đột biến vị trí định 2.1 Phương pháp sử dụng DNA tổng hợp làm mồi 2.2 Phương pháp sử dụng DNA tổng hợp đoạn ghép (phương pháp biến dị cassette) XIV PCR PCR 119 119 121 121 121 122 123 125 127 128 130 130 130 130 130 131 131 133 133 134 136 136 137 138 139 139 140 141 141 142 143 144 144 149 151 151 170 Một số kỹ thuật mở rộng áp dụng PCR XV Phương pháp "vân tay" DNA (DNA finger print) Phương pháp DNA finger print Phương pháp mẫu dò lạnh (cold probe) 153 157 157 158 Tài liệu tham khảo 162 Mục lục 163 ... xuất S -100 1.3 Dịch chiết xuất nhân Phiên mã in vitro (run-off assay) 2.1 Sử dụng promoter rDNA người với pol I 81 81 82 84 84 84 86 87 90 90 91 93 94 95 97 98 99 101 103 106 107 108 109 110 110. .. 78 78 168 X Phân tích điều tiết phiên mã nhờ thử nghiệm CAT (CAT assay) Thí nghiệm chính: di nạp gen vào tế bào eukaryota CAT assay Chương Kỹ thuật phân tích xác nhận phân tử I Kỹ thuật lai Southern... finger print xác nhận huyết thống (tìm bố sinh học cho con) Làn 1: DNA bố hộ tịch, 2: DNA bố sinh học, 3: DNA 4: DNA mẹ Con mẹ bố sinh học có băng giống Trong trường hợp probe kết hợp trực tiếp