Phương pháp và kỹ thuật cơ bản trong sinh học phân tử

PHƢƠNG PHÁP VÀ KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG SHPT GV: Nguyễn Thị Ngọc Yến Mục tiêu  Công cụ SHPT cách sử dụng  Một số phương pháp SHPT  Ứng dụng thực tế Các enzym biến đổi acid nucleic Enzym cắt hạn chế - RE  Restriction enzyme (RE): Endonuclease cắt ADN hay gần trình tự nhận diện đặc hiệu  Methylase: methyl hóa trình tự nhận diện đặc hiệu ngăn cản tác động RE  Cặp RE/methylase khác Phân loại RE  Loại I III phức hệ gồm hoạt tính RE methyl hóa, loại cần ATP cắt ADN vị trí xa điểm nhận diện  dùng  Loại II có hoạt tính endonuclease, không cần ATP để hoạt động cắt ADN gần vị trí nhận diện  sử dụng nhiều o EcoRII o BamHI… Nhận diện vị trí cắt  Vị trí nhận diện đa số RE loại II thường chứa -6 nucleotid theo kiểu palindrome  RE cắt ADN sợi đôi tạo đầu tận 5’-P 3-OH Đầu cắt tà so le (đầu dính)  Nếu trình tự nhận diện có phần tính đối xứng điểm cắt thường nằm Polymerase – Đặc tính chung  Hoạt tính tổng hợp 5’3’: gắn dNTP vào đầu 3’-OH mồi giải phóng PPi  Hoạt tính exonuclease 3’5’: “sửa lỗi”  Hoạt tính exonuclease 5’3’: hủy mồi  Ribonuclease H: hủy ARN phức lai ARN-ADN  Dịch chuyển sợi  Khả xử lý  Tần suất lỗi Polymerase – Đặc tính chung Phân loại  ADN polymerase phụ thuộc ADN: enzym chép  ARN polymerase phụ thuộc ADN: enzym phiên mã  ADN polymerase phụthuộc ARN: reverse transcriptase Taq polymerase o Hoạt động tối ưu 75-80oC, giảm 10 lần 37oC Hoạt tính sau 2h 95oC o Ứng dụng: • Khuếch đại ADN PCR • Giải trình tự ADN pp dideoxy Ligase Enzym xúc tác phản ứng tạo liên kết phosphodiester 3’-OH 5’-P hai sợi acid nucleic Chuyển ADN vào tb chủ  Biến nạp: Vk bắt ADN từ môi trường  Tải nạp: sử dụng thực khuẩn để gây nhiễm tế bào đích  Thẩm điện: dùng điện cao làm thủng màng tế bào để ADN lọt qua  Chuyển nhiễm: chế giống biến nạp áp dụng cho tế bào động vật  Đạn sinh học: “súng bắn gen” đưa ADN gắn hạt vàng xuyên qua màng tế bào Chọn lọc dòng tái tổ hợp     Kỹ thuật bổ sung anpha Sử dụng đề kháng kháng sinh Chọn lọc trực tiếp Lai khóm Xác định trình tự acid nucleic Giải trình tự phương pháp:  Sanger – Coulson  Maxam – Gilbert So sánh Sanger-Coulson Maxam-Gilbert Hiệu Cao Kém Ít Độc Cần Không Độc hại Mồi Phƣơng pháp Sanger-Coulson  PP enzym/dideoxy: dựa vào ngừng tổng hợp ADN gặp phải dideoxynucleotid (Frederick Sanger)  Qui trình: o Thực phản ứng PCR riêng biệt với mồi: A: có dNTP + ddATP T: có dNTP + ddTTP G: có dNTP + ddGTP C: có dNTP + ddCTP o Mỗi ống sản phẩm nạp vào giếng điện di o Kết điện di đọc  trình tự Đọc kết Phƣơng pháp Sanger 5’-GGCCGCGTCTTCGCCGTAG-3’ ddG ddA ddT ddC 3’ 5’ Phương pháp SangerCoulson cải tiến Phƣơng pháp Maxam-Gilbert PP hóa học: dựa vào thủy giải đặc trưng ADN o Tạo ADN sợi đơn từ đoạn ADN cần giải trình tự o Đánh dấu phân tử ADN đầu o Thực ống phản ứng riêng biệt: G: + dimethyl sulphate  Guanine bị methyl hóa AG: + formic acid  Adenin Guanine bị methyl hóa TC: + Hydrazine  biến đổi Thymin Cytosin C: + Hydrazine + 1,5 M NaCl  biến đổi Cytosin o Xử lý ống với piperidine 1M/90oC để cắt ADN liên kết phosphat kế nucleotid bị biến đổi o Mỗi ống nạp vào giếng điện di o Kết điện di đọc biện luận  trình tự HẾT! ... thước lớn đến 50 kb, plasmid phage lambda < 15 kb Các phƣơng pháp & kỹ thuật •Chiết tách tinh chế vật liệu di truyền •Lai acid nucleic Kỹ thuật PCR •Tái tổ hợp tạo dòng gen •Xác định trình tự acid... plasmid sử dụng kỹ thuật bổ sung anpha để chọn lọc dòng tái tổ hợp o Mang gen cho đoạn omega β-galactosidase plasmid F’, cho phép bị nhiễm phage dạng sợi M13 Nếu plasmid F’ làm khả DH 5- o Mang đặc... phosphodiester 3’-OH 5’-P hai sợi acid nucleic Chủng VSV vector tạo dòng Chủng vi sinh vật E coli  Bộ máy di truyền nghiên cứu đầy đủ  Tốc độ tăng trưởng nhanh  Khả gây bệnh thấp Chủng vi sinh vật