Phương pháp và kỹ thuật cơ bản trong sinh học phân tử

Chủng vi sinh vậtJM103 o Nhân bản vector phage M13 o Dùng với plasmid pUC, plasmid sử dụng kỹ thuật bổ sunganpha để chọn lọc dòng tái tổ hợp o Mang gen cho đoạn omega của β-galactosidase

PHƯƠNG PHÁP VÀ KỸ THUẬT

CƠ BẢN TRONG SHPT

GV: Nguyễn Thị Ngọc Yến

Mục tiêu

 Công cụ cơ bản của SHPT và cách sử dụng

 Một số phương pháp cơ bản của SHPT

 Ứng dụng trong thực tế

Các enzym biến đổi acid nucleic

Phân loại RE

 Loại I và III là phức hệ gồm cả 2 hoạt tính RE và methyl hóa, loại này cần ATP và nó cắt ADN tại vị trí khá xa điểm nhận diện  ít được dùng

 Loại II chỉ có hoạt tính endonuclease, không cần ATP

để hoạt động và cắt ADN tại hoặc rất gần vị trí nhận diện  sử dụng nhiều

o EcoRII

o BamHI…

Polymerase – Đặc tính chung

 Hoạt tính tổng hợp 5’3’ : gắn dNTP vào đầu 3’-OH của mồi và giải phóng PPi

 Hoạt tính exonuclease 3’5’ : “sửa lỗi”

 Hoạt tính exonuclease 5’3’ : hủy mồi

 Ribonuclease H : hủy ARN trong phức lai ARN-ADN

 Dịch chuyển sợi

 Khả năng xử lý

 Tần suất lỗi

Polymerase – Đặc tính chung

Phân loại

 ADN polymerase phụ thuộc ADN: enzym sao chép

 ARN polymerase phụ thuộc ADN: enzym phiên mã

 ADN polymerase phụthuộc ARN: reverse transcriptase

Taq polymerase

o Hoạt động tối ưu ở 75-80oC, giảm 10 lần ở 37oC Hoạt tínhvẫn còn sau 2h ở 95oC

o Ứng dụng:

• Khuếch đại ADN bằng PCR

• Giải trình tự ADN bằng pp dideoxy

Ligase

Enzym xúc tác phản ứng tạo liên kết phosphodiester giữa 3’-OH và 5’-P của hai sợi acid nucleic

Chủng VSV và vector tạo dòng

Chủng vi sinh vật

E coli

 Bộ máy di truyền được nghiên cứu đầy đủ

 Tốc độ tăng trưởng nhanh

 Khả năng gây bệnh thấp

Chủng vi sinh vật

JM103

o Nhân bản vector phage M13

o Dùng với plasmid pUC, plasmid sử dụng kỹ thuật bổ sunganpha để chọn lọc dòng tái tổ hợp

o Mang gen cho đoạn omega của β-galactosidase trênplasmid F’, cho phép nó bị nhiễm bởi các phage dạng sợinhư M13 Nếu mất plasmid F’ sẽ làm mất khả năng nàyDH5-ɑ

o Mang đặc tính bổ sung anpha như JM103

o Đột biến gen recA làm mất khả năng tái tổ hợp tươngđồng

o Mang gen deoR đột biến giúp dễ thu nhận mảnh ADN lớn

o Có thể tồn tại ổn định trong tb chủ qua nhiều thế hệ

o Trình tự nhận diện enzym cắt giới hạn đưa gen vào

o Mang yếu tố chọn lọc để xác định tb có mang vector

o Có vùng tạo dòng (MCS): là nhiều trình tự nhận diện duynhất của các RE khác nhau nằm liên tiếp (polylinker), đểcắt mở vòng plasmid và nối đoạn gen mong muốn vào.

Plasmid được đưa vào tb

chủ = biến nạp, thẩm điện

VD: pUC, pBR322,

Yếu tố chọn lọc

Các vector plasmid

 pBR322

 pGEM và pBluescript

pUC

Vector từ phage lamda

Phage tiêu giải

Vector từ phage ʎ

Tạo vector từ phage:

o Cắt bỏ một phần bộ genphage không liên quan đếnquá trình tiêu giải và thaybằng đoạn ADN cần tạo dòng

o Kích thước ADN sau tái tổhợp: 78% (38 kb)  102% (51kb) so với dạng hoang dại (50kb) mới đóng gói được

Vector từ phage lamda

Ưu điểm:

o Đóng gói in vitro. Điều này rất có ý nghĩa vì khi đó chỉcần một lượng ít vector và ADN cần chèn Đóng gói in vitro là cách đơn giản nhất để đưa ADN tái tổ hợp vào tếbào E coli chủ

o Các thư viện phage có thể dễ dàng phát hiện với mẫu

dò, khuếch đại và bảo quản trong một thời gian dài

Vector cosmid

Cosmid = cos site + plasmid: dạng lai phage và plasmid

o Mang yếu tố chọn lọc, điểm Ori (~plasmid)

o Vị trí tạo dòng, trình tự mã hóa cho vị trí cos (~phage ʎ)

Vector cosmid

Tạo vector cosmid:

o Cắt vector bằng RE tại MCS và trộn với đoạn gen muốnchèn (có chiều dài từ 35 - 45 kb)

o Vector và đoạn chèn sẽ được nối lại bằng ligase, tạo sợiADN thẳng với đoạn chèn bị kẹp giữa 2 phần của vector

và tận cùng với các vị trí cos ở 2 đầu

o Đóng gói in vitro nhờ nhận diện 2 vị trí cos: Sợi ADN này ủvới các protein vỏ sẽ tạo thành phage và được gây nhiễmvào E coli

o Sau khi vào tế bào chủ, ADN tái tổ hợp sẽ tạo thành vòngnhờ vị trí cos và hoạt động như một plasmid

Ƣu điểm

 Tạo dòng các đoạn gen có kích thước lớn đến 50 kb, trong khi đó plasmid và phage lambda < 15 kb

Các phương pháp & kỹ thuật cơ bản

•Chiết tách và tinh chế vật liệu di truyền

•Lai acid nucleic

•Kỹ thuật PCR

•Tái tổ hợp và tạo dòng gen

•Xác định trình tự acid nucleic

Chiết tách và tinh chế ADN

Nguyên tắc

 Phá vỡ tế bào phóng thích VLDT + tế bào chất

 Tủa các thành phần trong tbc và để lại ADN tan

 Cô đặc và thu hồi ADN dạng tinh khiết

- Biến tính protein và phân tách cùng pha hữu cơ, để lại ADN tan trong nước

- Loại ARN: ribonuclease (RNase)

- Tủa ADN bằng ethanol tuyệt đối với

sự hiện diện muối cation hóa trị I, nhiệt độ thấp

- Isopropanol đồng thể tích với pha nước

Chiết ADN bộ gen tế bào

Chiết plasmid

Tách plasmid khỏi ADN NST:

 Kích thước:

o Phá vỡ tb trong điều kiện nhẹ

nhàng, ADN NST không đứt đoạn

Chiết ADN phage

Chiết tách từ thực khuẩn chứ không từ tb chủ nên chiết tách khá đơn giản Cần loại bỏ capsid của phage

o Ly tâm loại tb chủ

o Tủa phage bằng PEG

o Loại capsid bằng phenol

Tinh chế acid nucleic

 Ly tâm phân đoạn : lượng acid nucleic lớn Ly tâm phân tách theo thang tỷ trọng saccharose hoặc CsCl2

 Sắc ký :

o Lọc gel: tách ADN qui mô lớn

o HPLC: tách oligonucleotid, độ phân giải cao đến 1 nu

o Hấp phụ: mARN với đuôi polyA được hấp phụ bằng resin

 Điện di : tách ADN qui mô nhỏ

o Gel agarose

o Gel polyacrilamide: tinh chế acid nucleic với khác biệt 1 nu

Định tính & định lƣợng ADN

Định lƣợng ADN – Quang phổ kế

 Định lượng : ADN hấp thu cực đại 257nm  OD260nm

1 OD260nm tương đương

o 50 μg/ml dung dịch ADN (hoặc ARN) sợi đôi

o 40 μg/ml dung dịch ARN (hoặc ADN) sợi đơn

o 30 μg/ml oligonucleotid (tới 70 base)

 Kiểm tra độ tinh khiết : tỷ lệ OD260/230 hoặc OD260/280

Định tính ADN – Điện di gel

 Phân tách acid nucleic/ protein dưới tác động của điện trường xuyên qua 1 hệ gel Các phân tử sẽ tách ra:

o Tùy theo kích thước

o So sánh với chuẩn

Kỹ thuật lai acid nucleic

Nhiệt độ chảy

Tm: Nhiệt độ tại đó 50% duplex hình thành Phụ thuộc chiều dài, tỷ lệ GC, nồng độ ion…

Tm (oC) = 4(GC) + 2(AT)

To > Tm: biến tính duplex

To < Tm: phản ứng lai (hồi tính)

Kỹ thuật lai

Nguyên tắc : Dùng đoạn dò để lai và phát hiện ra phân

tử đích Nếu có sự tồn tại phân tử lai  có phân tử đích trong mẫu

Kỹ thuật lai

Phản ứng lai tiến hành trong điều kiện sao cho sự lai diễn ra đặc hiệu:

o Đặc hiệu  duplex bền  phát hiện

o Không đặc hiệu  biến tính  không phát hiện

Phân loại

 Lai trên màng rắn : phân tử tham gia được cố định trên màng nitrocellulose, probe tự do trong dung dịch  duplex gắn trên màng

o Southern blot: đích là ADN

o Northern blot: đích là ARN

o Dot blot: hỗn hợp acid nucleic chấm trực tiếp trên màng

 Lai tại chỗ : định vị acid trong mô/tb

 Lai trong dung dịch , duplex được tách khỏi dung dịch

để phát hiện  chẩn đoán bệnh dựa trên acid nucleic

Lai sau khi điện di, phát hiện và xác định kích thước phân tử đích

Souther

Southern blot

Southern blot

Kỹ thuật PCR

Nguyên lý

Dựa trên sao chép ADN in vitro

o Trong điều kiện có sẵn nucleotid

o Enzym polymerase sẽ kéo dài mạch ADN theo nguyên tắc

bổ sung nếu đầu 3’-OH trống

Tiến trình PCR

Sự lặp lại của 1 tiến trình gồm 3 bước:

o Biến tính: dsADN  ssADN nhờ nhiệt độ

o Gắn mồi: ủ các đoạn mồi (chuỗi oligonucleotid ADN tổnghợp đặc hiệu, gồm mồi xuôi, mồi ngược) với các ssADN

o Kéo dài: enzym kéo dài mồi theo NTBS với khuôn mẫu

Chương trình PCR

 Biến tính khởi đầu: 95oC / 5-10 phút

 Chu kỳ nhiệt: gồm 3 bước lặp lại 25-40 lần

o Biến tính: 94-95 o C / 30s-vài phút

o Gắn mồi: 40-70 o C (< Tm của mồi) / 30s-60s

o Kéo dài: 65-74 O C / thời gian tùy theo độ dài khuôn

 Kéo dài kết thúc: 72-74oC / vài lần thời gian kéo dài

Thành phần phản ứng:

• Khuôn mẫu

• Mồi

• Đệm: pH thích hợp và nồng độ Mg++ thay đổi

• dNTPs: A, T, G và C

• DNA polymerase

Kéo dài

3’ 3’

Đoạn đích

Ƣu nhƣợc điểm

 Ưu: Nhanh, Đơn giản, Nhạy, Đặc hiệu

 Nhược

o Phải biết trình tự 2 đầu để thiết kế mồi

o Ngoại nhiễm  mất tính đặc hiệu

 Cải tiến

o Nested PCR (mồi tổ)

o RT-PCR: PCR ngược, dùng ARN là khuôn tổng hợp ADN

o Realtime-PCR: phát hiện và định lượng sp bằng huỳnhquang  số lượng ADN khuôn ban đầu

• Nhuộm xen giữa

• Phân hủy đoạn dò

• Lai hóa đoạn dò

Nhuộm xen giữa Hủy đoạn dò Lai hóa đoạn dò

Ứng dụng

 Khuếch đại ADN dùng trong nghiên cứu, tạo dòng gen

 Phát hiện ADN trong chẩn đoán, với độ nhạy và độ đặc hiệu cao

 Xác định huyết thống, pháp y

Tái tổ hợp và tạo dòng gen

Nguyên lý

 Cô lập gen số lượng lớn ở dạng tinh khiết để nghiên cứu cấu trúc, cần đưa vào tb chủ để nhân bản  Tạo dòng gen

 Khác PCR: tạo dòng gen chưa biết cấu trúc, do đó thực hiện trước khi PCR

o Tạo đoạn ADN

o Nối đoạn ADN cần tạo dòng vào vector tạo phân tử tái tổhợp

o Đưa ADN tái tổ hợp vào tb chủ

o Chọn lọc dòng tái tổ hợp

Tạo đoạn gen mong muốn

o Lưu ý vị trí cắt sẽ tạo ra đầu tù/ đầu dính phù hợp với vector mới nối vào được

Kỹ thuật PCR

o Nếu cấu trúc đoạn gen đã được biết

o Đoạn ADN thu được bằng PCR có các đầu bị so le (lệch) không xác định về trình tự

o Làm tà đầu sản phẩm PCR, gắn linker hoặc adaptor

o Thiết kế mồi có chứa trình tự nhận diện cắt của RE

Nối ADN

 Dùng ligase của T4 (tinh chế từ E coli nhiễm T4)

 Trộn vector duỗi thẳng và ADN với ligase trong điều kiện thích hợp  lk phosphodiester và nối các ADN lại

Homopolymer

Chuyển ADN vào tb chủ

 Biến nạp : Vk bắt ADN từ môi trường

 Tải nạp : sử dụng thực khuẩn để gây nhiễm tế bào đích

 Thẩm điện : dùng điện thế cao làm thủng màng tế bào

Xác định trình tự acid nucleic

o Mỗi ống sản phẩm được nạp vào một giếng điện di

o Kết quả điện di được đọc  trình tự

Đọc kết quả Phương pháp Sanger

5’-GGCCGCGTCTTCGCCGTAG-3’

ddG ddA ddT ddC

5’

3’

Phương pháp

Phương pháp Maxam-Gilbert

PP hóa học : dựa vào sự thủy giải đặc trưng của ADN

o Tạo ADN sợi đơn từ đoạn ADN cần giải trình tự

o Đánh dấu các phân tử ADN ở một đầu

o Thực hiện 4 ống phản ứng riêng biệt:

o Xử lý 4 ống trên với piperidine 1M/90oC để cắt ADN ở liên kết phosphat kế nucleotid bị biến đổi

o Mỗi ống được nạp vào một giếng điện di

o Kết quả điện di được đọc và biện luận  trình tự

HẾT!