Nhưng quan trọng hơn vẫn là thông qua các bước kỹ thuật cụ thể giúp người học nắm được những điểm cơ bản về nghiên cứu phát triển sinh học phân tử được các nhà nghiên cứu nhiều thế hệ [r]
(1)TS PHẠM HỒNG SƠN
Giáo trình
KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG
SINH HỌC PHÂN TỬ
Nhà xuất Đại học Huế
(2)TS PHẠM HỒNG SƠN
Giáo trình
KỸ THUẬT CƠ BẢN
TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ
Nhà xuất Đại học Huế
(3)LỜI MỞ ĐẦU
Tuy thành nghiên cứu thực phẩm biến đổi gen (GMF - genetically modified food) có bàn ăn bàn nghị nhiều nước giới, nhiều thành khác vận dụng rộng rãi y học nông nghiệp, sinh học phân tử lĩnh vực mẻ nhiều trường đại học nước ta Để đáp ứng nhu cầu tiếp cận nghiên cứu, phát triển ứng dụng lĩnh vực cần có tài liệu thực hành sinh học phân tử tiếng Việt Đó lý đời giáo trình
Là tài liệu hướng dẫn kỹ thuật, giáo trình đương nhiên giới thiệu bước kỹ thuật thường thực sinh học phân tử Nhưng quan trọng thông qua bước kỹ thuật cụ thể giúp người học nắm điểm nghiên cứu phát triển sinh học phân tử nhà nghiên cứu nhiều hệ sáng tạo thực khứ, nhờ kết nghiên cứu vẽ lại tranh tồn cảnh giới khái quát hóa nhiều tài liệu sinh học Mong muốn người biên soạn người học nắm điểm cốt yếu kỹ thuật sinh học phân tử sở phát triển kỹ thuật hay cải tiến bước cho phù hợp với thực tiễn nghiên cứu
(4)chuyển gen động vật, thực vật" "Cơng nghệ protein"
Trong thực tế, hai nhóm phương pháp nghiên cứu khoa học song song vận dụng phương pháp thực nghiệm (experimentalistic) phương pháp tự nhiên học (naturalistic) hay quan sát tự nhiên, bổ sung cho nhau, không nên coi nhẹ cách thức Tuy vậy, để tiếp cận với q trình vi mơ thể sống việc quan sát tự nhiên, đo đạc số liệu vĩ mơ từ khái qt thành lý luận q trình vi mơ khơng cịn đường đa số người lựa chọn Nghiên cứu thực nghiệm đầy khó khăn q trình sinh học vi mô trở thành cách thức chủ yếu để loài người nhận thức giới sinh học Sinh học phân tử phát triển sở kiến thức đa ngành Có thể nói Sinh học phân tử kết phối hợp tư hóa học với phương tiện lý học hệ thống sinh học nhằm lặp lại trình sinh học tự nhiên để vận dụng sản xuất sản phẩm người mong muốn với hiệu suất cao hơn, phân loại đối tượng sinh học nhận biết chúng thông qua việc xác nhận phân tử đặc hiệu Trong trình cần ý tượng ta quan sát tự nhiên kết tất nhiên mn vàn chuyển hóa ngẫu nhiên Do đó, thực nghiệm nhằm lặp lại tượng tự nhiên hình thành qua hàng trăm triệu năm tiến hóa thường gặp khơng khó khăn Vì vậy, kỹ thuật giới thiệu tránh khỏi buồn tẻ thử nghiệm, tuyển chọn kết thử nghiệm, sàng lọc sản phẩm, dùng sản phẩm làm nguyên liệu cho thử nghiệm Khi vậy, chọn sản phẩm số lớn sản phẩm gần sản phẩm sai sau nhân sản phẩm bước ưu tiên kỹ thuật sinh học phân tử
Tuy kỳ vọng cao chúng tơi khơng tránh khỏi sai sót, mong nhận góp ý xây dựng đồng nghiệp người đọc
(5)Chương 1
NHỮNG THAO TÁC CƠ BẢN
I Dụng cụ hóa chất
1 Dụng cụ
Nhìn chung, phịng thí nghiệm thực thí nghiệm sinh học phân tử chuyển gen (di nạp gen) khơng có dụng cụ đặc biệt so với phịng thí nghiệm sinh học khác Tuy nhiên, so với thí nghiệm sinh hóa thường tiến hành trước loại hóa chất thường dùng với lượng hơn, DNA RNA lẫn với nuclease dễ dàng bị phân giải chất thường hấp phụ lên bề mặt thủy tinh nên thường phải sử dụng ống chất dẻo nhỏ Hơn nữa, tạp nhiễm DNA thường làm hỏng thí nghiệm nên tốt hết sử dụng dụng cụ lần chừng mực kinh tế cho phép Dụng cụ thường dùng phịng thí nghiệm sinh học phân tử là:
1.1 Các loại ống (tubes) gồm loại ống Eppendorf 1,5 ml, 0,5 ml (hãng Eppendorf, hãng BioRad ) dùng cho hầu hết phản ứng phản ứng enzyme loại phản ứng enzyme hạn chế, chiết xuất nucleic acid (NA) phenol, kết tủa nucleic acid ethanol sau với ống quay li tâm máy li tâm chuyên dụng Các loại ống nghiệm dùng lần ống Falcon 2059, ống Corning 25216 P loại ml khơng chịu li tâm với vận tốc cao Các loại ống nghiệm 12 ml li tâm máy li tâm lạnh có ống lót (adaptor) đến 10.000 vịng/phút (v/ph) sử dụng cho việc kết tủa ethanol Các loại ống nghiệm chất dẻo nắp vặn có đáy nhọn dùng để tập trung vi khuẩn khơng quay li tâm ngồi phạm vi 3.000 v/ph Các loại ống nghiệm polyethylene cỡ 50 ml sử dụng rộng rãi việc đựng hóa chất, chiết xuất nucleic acid phenol với lượng lớn Một số ống nghiệm chất dẻo sử dụng với chloroform, số khác hấp cao áp tiệt trùng, đa số loại ống nghiệm chất dẻo bán dạng khử trùng (thường tia gamma, trừ ống Eppendorf)
(6)2.3 Điện di gel agarose 119
VI Thử nghiệm run-on nhân 121
1 Phân li nhân 121
2 Thẩm đốm lên màng 121
3 Điều chế RNA tổ chức 122
4 Hybridization 123
VII Phân tích xê dịch gel (gel shift analysis) 125 VIII Thí nghiệm cản trở kết hợp methyl hóa dimethyl sulfate
(DMS) 127
IX Phương pháp "vết chân" (foot print) nhờ DNase I 128
X Phân tích protein 130
1 Định lượng protein (phương pháp Bradford) 130
1.1 Điều chế hóa chất 130
1.2 Định lượng 130
2 Điện di SDS-polyacrylamide 130
2.1 Chế tác gel SDS-polyacrylamide 131
2.2 Điều chế mẫu, điện di nhuộm 131
3 Phương pháp thẩm Western 133
3.1 Blotting 133
3.2 Nhuộm kháng thể 134
XI Tinh chế protein kết hợp DNA nhờ sử dụng trình tự DNA
đặc hiệu 136
1 Điều chế DNA 136
2 Kết hợp DNA với sepharose hoạt hóa CNBr 137
3 Tinh chế protein cột Sepharose kết hợp DNA có trình
tự base đặc hiệu 138
XII South-Western hybridazation 139
1 Điều chế dịch chiết xuất tế bào 139
2 Phương pháp South-Western blot (thẩm South-Western) 140
XIII Phương pháp tạo thể đột biến nhân tạo 141
1 Chế tác thể đột biến khuyết tổn 141
1.1 Tiêu hóa phần Bal 31 142
1.2 Tạo dòng phụ (subcloning) đoạn khuyết tổn 143
2 Chế tác thể đột biến vị trí định 144
2.1 Phương pháp sử dụng DNA tổng hợp làm mồi 144
2.2 Phương pháp sử dụng DNA tổng hợp đoạn ghép (phương
pháp biến dị cassette) 149
XIV PCR 151
(7)2 Một số kỹ thuật mở rộng áp dụng PCR 153 XV Phương pháp "vân tay" DNA (DNA finger print) 157
1 Phương pháp DNA finger print 157
2 Phương pháp mẫu dò lạnh (cold probe) 158
Tài liệu tham khảo 162