Chuong 10 1 lai phan tu

Chương 10 Kỹ thuật lai phân tử Cơ sở lý thuyết • Sự bắt cặp lai (Hybridization) theo chế bổ sung (Complementarity) • Các dạng phức hợp lai bổ sung 1) DNA-DNA 2) DNA-RNA 3) Protein-Protein (thường dạng phức hợp kháng nguyênkháng thể ) Lai DNA-DNA DNA-RNA Lai phân tử trình kết hợp lại hai mạch đơn axít nucleic (DNA, RNA) Cơ sở việc lai phân tử mối liên kết hydro base hai mạch DNA biến tính tái hồi đun nóng làm lạnh Để tiến hành phản ứng lai phân tử trước hết DNA mạch kép phải biến tính Đó q trình liên kết hydro mạch DNA kép ban đầu bị phá vỡ giải phóng hai mạch đơn với tồn base sẵn sàng tiếp nhận liên kết hydro Một số trường hợp xảy lai DNA Tính đặc hiệu phản ứng lai 1) Lai đặc hiệu: tồn trình tự mẫu dị (probe) bổ sung với trình tự DNA cần dị 2) Lai khơng đặc hiệu: phản ứng lai xảy trình tự mẫu dị trình tự DNA có trình tự khơng hoàn toàn bổ sung cho Lai nhiệt độ 42oC đảm bảo cho phản ứng lai đặc hiệu nhiệt độ 35oC http://amiga1.med.miami.edu/Medical/PDF-Files/Lecture10.pdf Có thể phát phân tử DNA hỗn hợp nhiều DNA dựa vào mẫu dò đặc hiệu cho phân tử DNA Mẫu dị Hỗn hợp DNA Phát Hỗn hợp sau lai với mẫu dò Một số kỹ thuật tạo mẫu dò DNA/RNA Mẫu dò: đoạn DNA RNA mạch đơn ngắn (< 2000 nu) sử dụng để xác định đoạn trình tự đặc hiệu thơng qua phép lai Mẫu dò DNA/RNA: sinh tổng hợp antisense RNA DNAdependent RNA polymerase dùng [32P]UTP dig-UTP Mẫu dò DNA/DNA: Tổng hợp mẫu dò với DIG-UTPs [32P]dNTPs DIG-UTPs vs [32P]dNTPs • Digoxigenin (DIG) bán kháng ngun có hoạt tính kháng ngun cao – Luminescent detection – Colorimetric detection (NBT/BCIP reaction) Phản ứng tạo màu với chất BCIP NBT Màu hồng Màu xanh Một số phương pháp sử dụng để phát vị trí protein westen blot So sánh phương pháp lai Blot Type Matrix Molecule Detection Southern agarose DNA nucleic acid northern agarose RNA nucleic acid western polyacrylamide Protein antibody Các phương pháp lai khác In situ Hybridization RNAse protection Assay EMSA (Electromobility Shift Assay) IHC (Immunohistochemistry) DNA microarray Lai chỗ - In situ hybridization Là kỹ thuật dùng để xác định số copy đoạn DNA đặc thù có mặt tế bào Thường sử dụng mẫu dò đánh dấu huỳnh quang (Fluorescence in situ hybridization (FISH) đồng vị khơng đồng vị phóng xạ) DNA probes lai với chromosome tế bào metaphase interphase Chu kỳ tế bào qua pha: G1, S; G2 pha M Fluorescence in situ hybridization (FISH) experiment visualizing two gut bacteria colonizing the epithelial cell surface of the honey bee gut The gammaproteobacterial gut symbiont Gilliamella apicola is shown in magenta, the betaproteobacterial gut symbiont Snodgrassella alvi is shown in green Counterstain with DAPI in blue shows DNA of bacteria and host nuclei RNAse Protection Assay Sử dụng DNA-dependent RNA polymerase (chiết từ bacteriophage SP6, T7 or T3) để tổng hợp mẫu dò cRNA đánh dấu phóng xạ, dùng cDNA làm mạch khuôn [32P]UTP cRNA probes lai với mRNAs mục tiêu dung dịch Bổ sung RNAse đặc hiệu cho RNA sợi đơn → mẫu dị trình tự mục tiêu bảo vệ khỏi enzyme hình thành sợi kép Điện di, phân tích sản phẩm Ưu điểm RNAse Protection Assay Nhạy gấp 10 lần so với Northern Blots Có thể nhận biết nhiều đoạn mục tiêu lúc Có tính đặc hiệu cao khả bắt cặp xác RNA mẫu dị Có thể nhận biết trường hợp mẫu có tế bào/mơ Sử dụng mẫu dò đánh dấu biotin RPA Câu hỏi Chemiluminescence (using Horse Radish Peroxidase-Conjugated Secondary Antibodies) phenyldiboronic acid (PDBA), Salicylhydroxamic acid (SHA) , Kỹ thuật hóa mơ miễn dịch immunohistochemistry Kiểm tra có mặt protein tế bào dựa vào phản ứng antigen-antibody Đánh dấu kháng thể (antibody) chất nhuộm mầu phát huỳnh quang để dễ dàng quan sát vị trí, phân bố lượng protein tế bào Electromobility Shift Assay (EMSA) (hay Gel Shift Assay) Các bước: Đánh dấu mẫu dò DNA 32P Trộn probe đánh dấu với protein mục tiêu→ phức hợp Bổ sung mẫu dò không đặc hiệu (cạnh tranh) Tách phức hợp với mẫu dị tự gel âm tính Ngun lý: phức hợp DNA-Protein di chuyển chậm đoạn DNA tự gel ... cặp lai (Hybridization) theo chế bổ sung (Complementarity) • Các dạng phức hợp lai bổ sung 1) DNA-DNA 2) DNA-RNA 3) Protein-Protein (thường dạng phức hợp kháng nguyênkháng thể ) Lai DNA-DNA DNA-RNA... DNA cố định màng lai đem lai với mẫu dò đánh dấu p32 chất gây phản ứng màu Quá trình thực buồng lai (nhiệt độ 6 5- 680 C) thời gian 6- 12 • Sau kết thúc phản ứng lai, màng lai rửa loại bỏ mẫu dị... hình thành phức protein-kháng thể Bổ sung kháng thể thứ cấp có gắn với enzyme alkalin phosphatase horseradish peroxidase Bổ sung chất 5-bromo-4-chloro-3'indolyphosphate p-toluidine (BCIP) nitro