Các phương pháp phân loại lai phân tử

Thực vật có hoa NXB Đại học quốc gia Hà Nội 2006. Tr 78 – 100. Từ khoá: Phương pháp phân loại, nhiễm sắc thể, tế bào, izoenzym, giải phẫu. Tài liệu trong Thư viện điện tử ĐH Khoa học Tự nhiên có thể được sử dụng cho mục đích học tập và nghiên cứu cá nhân. Nghiêm cấm mọi hình thức sao chép, in ấn phục vụ các mục đích khác nếu không được sự chấp thuận của nhà xuất bản và tác giả. Mục lục Chương 7 Các phương pháp phân loại 3 7.1 Phương pháp phân loại hình thái 3 7.2 Phương pháp phân loại giải phẫu 3 7.2.1 Nghiên cứu cấu trúc biểu bì lá 3 7.2.2 Nghiên cứu cấu tạo giải phẫu gỗ 3 7.3 Phương pháp phân loại bào tử phấn hoa 8 7.4 Phương pháp nghiên cứu tế bào 10 7.4.1 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 10 7.4.2 Hình thái thể nhiễm sắc 16 7.4.3 Kiểu nhân 17 7.5 Phương pháp phân loại izoenzym 18 7.5.1 Định nghĩa izoenzym 18 7.5.2 Phương pháp phân tích izozym bằng kỹ thuật điện di 19 7.6 Phươ ng pháp phân loại bằng ADN 23 Chương 7. Các phươn g pháp phân loại Nguyễn Nghĩa Thìn 7.6.1 Kỹ thuật phản ứng trùng hợp - PCR 23 7.6.2 Phân loại dựa trên kỹ thuật cắt giới hạn - RFLP 24 7.6.3 Phân loại dựa trên kỹ thuật nhân ngẫu nhiên ADN đa hình - RAPD 24 7.6.4 Phân loại dựa trên kỹ thuật nhân đoạn AFLP 25 7.6.5 Phân loại dựa trên kỹ thuật tiểu vệ tinh là các đoạn ADN ngắn có một số lượng các chuỗi nucleotid lặp lại - SSR 26 3 Chương 7 Các phương pháp phân loại 7.1 Phương pháp phân loại hình thái (Xem chương 9 và 10) 7.2 Phương pháp phân loại giải phẫu 7.2.1 Nghiên cứu cấu trúc biểu bì lá Biểu bì lá là một dấu hiệu có ý nghĩa trong phân loại đã được nhiều người sử dụng trước hết cấu trúc của các kiểu tế bào biểu bì ví dụ ở Vulpa (hình 7.3) hay các kiểu lông trên bề mặt, ví dụ ở Combretum (hình 7.1). Các kiểu lông tùy theo điều kiện chúng ta có thể xem dưới kính hiển vi thường hay kính hiển vi quét (hình 7.2). Bên cạnh nghiên cứu cấu tạo lông, người ta sử dụng lưỡi dao để bóc các lớp biểu bì để xem cấ u tạo hệ thống lỗ khí hoặc người ta dùng parafin lo•ng tráng qua bề mặt lá rồi sau đó bóc ra để xem cấu tạo các tế bào quanh lỗ khí. Ba mươi lăm kiểu lỗ khí đã tìm thấy trong thực vật có mạch (hình 7.1) có ý nghĩa lớn trong phân loại. Những kiểu đó thường có ý nghĩa ở các bậc taxôn cao. Ví dụ như ở Acanthaceae đặc trưng kiểu diacytic, trong khi đó có liên quan chặt chẽ với Scrophulariaceae với kiểu monomocytic… Trong họ Poaceae hoa tiêu giảm mạnh và các dấu hiệu đặc trưng rất hạn chế. Do đó người ta quan tâm các dấu hiệu giải phẫu cơ quan dinh dưỡng và tế bào học hơn trong đó các tế bào biểu bì được quan tâm. 7.2.2 Nghiên cứu cấu tạo giải phẫu gỗ Cấu tạo giải phẫu gỗ được nghiên cứu trên các bản cắt ngang, tiếp tuyến, xuyên tâm và tiêu bản làm mủn. Nó có ý nghĩa lớn trong tiến hóa (hình 7.3 – 7.8). Dụng cụ nghiên cứu là kính hiển vi hai mắt với vật kính x8, x20, x40; thị kính x7, máy ảnh, trắc vi thị kính, trắc vi vật kính. 7.2.2.1 Làm tiêu bản lát cắt Theo tính chất của gỗ cứng hay mềm để có cách xử lý khác nhau, nếu là gỗ mềm thì cắt trực tiếp ngay, không cần qua các bước x ử lý cũng được. Nếu là gỗ cứng thì xử lý bằng glyxerin và cồn hoặc đun trong nước sôi và để vài tiếng đồng hồ mới tiến hành cắt. Mục đích cho tống hết các bọt khí làm cho gỗ mềm ra và tiêu bản nguyên vẹn. Chuẩn bị mẫu: 4 Hình 7.1. Các dạng tế bào quanh lỗ khí (theo Dilcher, 1974) A. anomocytic, B. cycocytic; C. amphicyclocytic; D. actinocytic, E. anisocytic, F. amphianisocytic, G. adiacytic, H. amphidiacytic, I.paracytic, J. amphiparacytic, K. brachyparacytic, L. amphibrachyparacytic, M. hemiparacytic, N. paratetracytic, O. amphitetracytic, P. brachyparacytic, Q. amphibrachyparatetracytic, R. staurocytic, S. anomotetracytic, T. parahexacytic-monopolar, U. parahexacytic-dipolar, V. brachyparahexacytic-monopolar, W. brachyparahexacytic-dipolar, X. polocytic, Y. copolocytic, Z. axillocytic, AA. coaxillocytic, BB. desmocytic, CC. pericytic, DD. copericytic, EE. amphipericytic Hình 7.2. Các dạng lông tuyến của chi Combretum: 6 tuyến có cuống và các tuyến khác dạng khiên (theo Dilcher, 1974) 5 * Khử nước ở nguyên liệu: Vật mẫu lấy ra khỏi dung dịch làm mềm phải được rửa thật kỹ bằng nước thường rồi ngâm lần lượt vào cồn 70o, cồn 96o, cồn tuyệt đối lần thứ nhất, lần thứ hai và lần thứ ba. Thời gian ngâm mẫu khoảng từ 15 - 30 phút hoặc hơn tùy theo độ dày của vật mẫu. * Chuyển vào dung môi trung gian: sau khi lấy mẫu ra khỏi cồn tuy ệt đối lần thứ ba, chuyển mẫu vào metylbenzoat lần thứ nhất, rồi lần thứ hai, mỗi giai đoạn để 1 - 2 giờ sau đó đưa vào xylen lần thứ nhất và lần thứ hai, mỗi giai đoạn không quá 30 phút. * Chuyển vào parafin: từ trong môi trường xylen ta chuyển tiếp như sau: Xylen - parafin (tỷ lệ 3: 1), để ở nhiệt đồ bình thường trong 1 - 2 giờ. Xylen - parafin (tỷ lệ 1: 1), giữ ở 40o trong khoảng 1 - 2 giờ. Xylen - parafin (tỷ l ệ 1: 3), giữ ở 40o trong khoảng 1 - 2 giờ, sau đó cho vào parafin nóng chảy trong tủ sấy ở nhiệt độ tủ cao không quá 62oC. Thời gian để phụ thuộc vào bề dày của mẫu và bản chất của mô, có thể để từ 10 - 12 giờ đến vài ngày. Nhiệt độ tủ sấy phải giữ đều. Hình 7.3. Các dạng tế bào biểu bì của Vulpia alopecuros: A. Mặt bụng; B. Mặt lưng và V. tenuis: C. Mặt bụng; D. Mặt lưng (theo Cotton và Stace, 1977). Tế bào silic có màu đen * Đúc khối parafin để dựng vật mẫu: Khi parafin đã ngấm hoàn toàn vào vật mẫu thì đem đúc thành khối, sau đó để nguội. Chú ý: Nên đặt vật mẫu vào giữa khối parafin. Nếu cần, điều chỉnh vật mẫu sau khi parafin đã đông đặc thì phải dùng một kim sắt hơ nóng để cho parafin chảy nóng trở lại. • Chuẩn bị khối parafin đựng vật mẫu: trong khối parafin nói trên thường chứa nhi ều vật mẫu do đó phải chia mỗi mẫu nằm trong một khối parafin nhỏ riêng. Sửa các khối parafin mang vật mẫu thành hình thang cụt có đáy vuông. Các cạnh đối diện của mặt cắt phải song song với nhau. Gắn khối parafin này lên một miếng gỗ nhỏ bằng cách hơ nóng lưỡi dao mổ trên đèn cồn rồi làm chảy parafin ở hai mặt cắt gắn với nhau. Sửa lại khối parafin một l ần nữa để cho mặt cắt phải thật phẳng, các cạnh thật vuông góc với nhau và để cho các lát cắt vào ngay với mặt cắt. 6 - Tiến hành cắt: Có thể cắt bằng tay hoặc bằng máy cắt. Sau khi gỗ đã được làm mềm tiến hành cắt theo 3 mặt phẳng: ngang, tiếp tuyến và xuyên tâm. Với độ dày vừa phải (khoảng 15 - 18 *m) để vừa mỏng vừa giữ được các yếu tố nguyên vẹn. Sau đó sửa thành các mảnh một cách cân đối (vuông hay chữ nhật). - Loại parafin ở lát cắt: để có thể nhuộm và quan sát được vi ph ẫu, cần loại hết parafin trên lát cắt. Phương pháp loại parafin như sau: chuyển các mẫu qua lần lượt các ống Boren đựng các dung dịch dưới đây. Xylen (lần thứ nhất) Thời gian 10 phút Xylen (lần thứ hai) Thời gian 5 phút Xylen - cồn tuyệt đối (3:1) Thời gian 5 phút Xylen - cồn tuyệt đối (1:1) Thời gian 5 phút Xylen - cồn tuyệt đối (1:3) Thời gian 5 phút Cồn tuyệt đối (1:3) Thời gian 5 phút Cồn 96o Thời gian 5 phút Cồn 70o Thời gian 5 phút Cồn 50o Th ời gian 5 phút Cồn 30o Thời gian 5 phút Nước cất: Thời gian 5 phút Sau đó chuyển tiêu bản vào các chậu đựng thuốc nhuộm tùy theo yêu cầu nghiên cứu. * Nhuộm màu: Thuốc nhuộm safranin 1 - 9% trong cồn tuyệt đối, khi dùng ta phải pha lo•ng gấp đôi. Cách nhuộm: Lấy các lát cắt ra thấm khô và tiến hành nhuộm bằng thuốc nhuộm safranin từ 5 phút đến 2 giờ. Sau đó cố định trong HCl và rửa bằng nước cất cho sạch. Chuyển sang giai đ oạn loại nước. Loại nước: Để loại hết nước các bản cắt được ngâm trong các dung dịch cồn từ nồng độ thấp đến cao. Vì cồn tan trong nước và sẽ rút dần dần nước ra. Sau đó chuyển sang dung dịch cồn + xylen. D•y các dung dịch xylen nồng độ cao dần để loại hết cồn ra (do keo canada chỉ tan trong xylen). Cuối cùng chuyển sang dung dịch xylen + cacbon có tác dụng khử trùng. Vật mẫu ngâm trong các dung dịch v ới khoảng thời gian từ 15 đến 30 phút hoặc hơn. Hình 7.4. Các giai đoạn tiến hóa của phiến rây từ kép đến đơn (Takhtajan 1964) Hình 7.5. Lát cắt xuyên tâm gỗ của Tetracentro sinensis (Takhtajan 1964) 7 * Dán tiêu bản: Chuẩn bị lamen và lam kính sạch. Đặt các lát cắt đã loại hết nước và ngâm trong dung dịch xylen + cacbon lên lam kính, sửa đúng hướng, nhỏ vài giọt keo canada và đậy từ từ lamen tránh cho bọt khí xuất hiện. 7.2.2.2 Làm tiêu bản ngâm mủn Dựa trên nguyên tắc một số hóa chất có tác dụng phá hủy màng gắn giữa các tế bào, làm cho các tế bào tách rời nhau ra. Phương pháp này thường dùng để nghiên cứu từng tế bào nguyên vẹn mà không làm hư hạ i chúng. Phương pháp tiến hành như sau: * Làm mủn: Cũng lấy ở mẫu gỗ ban đầu chẻ vài que nhỏ bỏ vào ống nghiệm, cho một vài tinh thể KCIO3, thêm HNO3 và sau đó thêm một ít nước cho ngập gỗ và đun bằng đèn cồn khoảng 15 - 20 phút. Khi thấy các que gỗ đã trắng ra, dùng đũa thủy tinh đánh cho gỗ tơi ra, để lắng và dùng nước cất rửa axit, sau đó ngâm trong cồn khoảng 15 phút. Tiến hành quá trình nhu ộm. * Nhuộm mẫu: Dung dịch nhuộm là safranin 1 - 9% trong cồn. Thấm khô mẩu gỗ mủn bằng giấy thấm, cho vài giọt thuốc nhuộm safranin (cho ướt hết mẫu) để khoảng 5 phút, cố định bằng HCl, rửa nước và sau đó tiến hành loại nước. • Loại nước: Ngâm trong dung dịch cồn 90o khoảng 15 phút, chuyển sang cồn tuyệt đối lần thứ nhất, lần thứ hai để rút nước ra, sau đó là quá trình rút cồ n khỏi tế bào bằng xylen (vì keo canada chỉ tan trong xylen chứ không tan trong cồn). Quá trình này tiến hành bằng cách chuyển mẫu sang dung dịch cồn + xylen lần thứ nhất, lần thứ hai và cuối cùng là cacbon xylen tương tự như trên tiêu bản cắt lát. Hình 7.6. Các giai đoạn tiến hóa của bản thủng lỗ từ kiểu hình thang của kiểu trung gian và từ kiểu đối nhau tới kiểu cách nhau (Takhtajan 1964) Hình 7.7. Các giai đoạn tiến hóa của bản thủng lỗ hình thang từ kiểu thủng lỗ nguyên thủy có nhiều vách ngang tới kiểu thủng lỗ chuyên hóa chỉ có một số vách ngang (Takhtajan 1964) 8 • Dán tiêu bản: Sau khi mẫu đã được loại nước và thấm xylen lấy một ít mủn, dùng kim mũi mác dàn đều trên lam kính đã sạch và khô, nhỏ vài giọt keo canada và từ từ đậy lamen. 7.2.2.3 Quan sát * Quan sát bằng mắt thường cấu tạo chung của gỗ. * Quan sát trên kính hiển vi và mô tả. * Đo đạc trên kính hiển vi dựa trên trắc vi vật kính và trắc vi thị kính các yếu tố cần mô tả. * Chụp ảnh và mô tả. 7.2.2.4 Đánh giá và phân loại Căn cứ trên bản mô tả và các sơ đồ tiến hóa, chúng ta phân tích, đánh giá các mức độ tiến hóa khác nhau, có thể lập thành khóa xác định. 7.3 Phương pháp phân loại bào tử phấn hoa Phấn hoa là một dấu hiệu được nhiều nhà phân loại sử dụng bởi tính ổn định của nó, dễ lấy mẫu, phương pháp đơn giản, ít tốn kém và thời gian tiến hành ngắn phù hợp với nghiên cứu trong phân loại. Mặt khác chúng thể hiện các mức độ tiến hóa một cách rõ ràng qua các dấu hiệu về hình dạng, kích thước, cấu trúc bề mặt rất đa dạng của chúng cũng như sự có mặt rãnh, số lượng rãnh, sự có mặt các lỗ, số lượng của chúng trên rãnh, cấu trúc rãnh (hình 7.10 - 7.12). A B 1 2 3 4 5 6 9 8 7 Hình 7.8. Sơ đồ tiến hóa của các kiểu chính của tia (A) và nhu mô gỗ (B) 1. Dị hình hỗn hợp với tần cùng dài; 2. Dị hình hỗn hợp với tận cùng ngắn; 3. Dị hình một dãy; 4. Đồng hình hỗn hợp; 5. Đồng hình nhiều dãy; 6. Đồng hình một dãy; 7. Nhu mô phân tán; 8. Không dính mạch trong giải (gian mạch); 9. Nhu mô quanh bó (Takhtajan 1964) Hình 7.9. Các giai đoạn tiến hóa của các thành phần mạch với kiểu thủng lỗ đơn, ở phần mạch đầu tiên trên bản thủng lỗ dưới còn lại một vạch ngang (Takhtajan 1964) 9 4 3 2 1 Hình 7.10. Hình thái hạt phấn 1. Hình bầu dục đứng; 2. Hình cầu gai; 3. Hình ngũ giác gai thấp; 4. Hình bầu dục đứng rộng bề mặt mạng lưới (Webster) Phương pháp này tiến hành theo các bước sau: + Lấy mẫu nghiên cứu: mẫu hạt phấn lấy từ hoa đã trưởng thành của các mẫu cho vào một túi giấy nhỏ và ghi rõ tên khoa học của tiêu bản, số hiệu và nơi lưu giữ. + Xử lý mẫu: hiện nay có nhiều phương pháp để xử lý mẫu bào tử phấn hoa nhưng phương pháp axetolyza được sử dụng phổ biến, nhuộm và làm sáng. Các bước tiế n hành như sau: * Cho mẫu chứa phấn hoa vào ống nghiệm, khẽ nghiền nhỏ. * Pha hỗn hợp axetoliza: cho vào ống đo 4,5 ml alhydric, sau đó cho thêm vào 5 ml H2SO4 đậm đặc. * Đổ hỗn hợp trên vào ống nghiệm chứa mẫu phấn hoa, sau đó đun sôi trên nồi cách thủy ở nhiệt độ 70 – 100oC, vừa đun vừa khuấy đều bằng đũa thủy tinh, rồi đưa ra ly tâm 3 phút với vận tốc 300 vòng/phút, đổ dị ch trong đi. * Rửa vật mẫu nhiều lần bằng cách cho hỗn hợp cồn 95o và nước cất theo tỷ lệ 3:1 vào ống nghiệm rồi ly tâm và đổ nước đi, cho thêm một ít nước cất vào ống nghiệm, lọc mẫu. * Chia vật mẫu thành 3 phần A,B,C và xử lý tiếp như sau: • Phần A cho thêm vào ống nghiệm hỗn hợp cồn 95o với nước cất theo tỷ lệ 3:1, ly tâm và gạn nước trong đ i. • Phần B nhuộm màu. Cho vào ống nghiệm chứa mẫu phấn hỗn hợp và nước cất và 1 giọt fusxin, để yên từ 2 - 5 phút; quay ly tâm gạn nước trong và rửa vật mẫu bằng hỗn hợp cồn và nước cất rồi ly tâm gạn nước trong. • Phần C làm mẫu sáng. Rửa vật mẫu trong hỗn hợp cồn và nước cất, ly tâm gạn nước trong. Đổ hỗn hợp làm sáng mẫu vào ống nghiệm để yên 2 phút sau đ ó ly tâm 5 phút gạn nước trong. Hỗn hợp làm sáng gồm có: Axit axetic đặc (8ml), NaClO3 30% (12 giọt), HCl (1ml). A B Hình 7.11. Ảnh hiển vi cấu trúc bề mặt hạt phấn A: một loài trong họ Cúc - Compositae; B: một loài trong họ Thầu dầu – Euphorbiaceae 10 Đổ phần B và phần C vào phần A, cho vào ống nghiệm một ít nước cất khuấy đều, ly tâm 5 phút rồi gạn nước trong. Rửa vật mẫu bằng cồn 95o và nước cất, ly tâm và gạn nước trong. Cho vào ống nghiệm một ít glyxerin đặc, khuấy đều rồi để yên. + Làm tiêu bản hiển vi hạt phấn: hút mẫu bằng pipet, nhỏ một ít dịch mẫu lên lam kính để soi, quan sát (chụp ảnh, mô tả, đo kích thước trên các tiêu bản t ạm thời với kính hiển vi quang học ở các vật kính *20, *40. + Phương pháp đo hiển vi: để đo kích thước hạt phấn gồm đo trục xích đạo và trục cực của hạt phấn dùng thước đo vật kính và thước đo thị kính. Mỗi chỉ số đo ít nhất 30 mẫu, các số đo kích thước được xử lý theo phương pháp thống kê để tính được kích thước trung bình và độ lệch chu ẩn của mỗi mẫu. + Phương pháp mô tả: đối với mỗi loài cần có một bản mô tả. Đây là phần tư liệu cơ sở của nghiên cứu, sơ đồ mô tả gồm: Tên khoa học, họ; địa điểm thu mẫu, người thu, số hiệu, nơi lưu giữ như Bảo tàng hay phòng mẫu; kiểu hạt phấn, kích thước và các đặc điểm khác + Phương pháp chụ p ảnh hiển vi: phương pháp này nhằm mục đích minh hoạ cho phần mô tả hình thái hạt phấn, đòi hỏi phải phản ánh chính xác hình dạng, cấu trúc hạt phấn ở các vị trí khác nhau trong đó cơ bản là hai vị trí: cực và xích đạo, đôi khi cả vị trí nghiêng nếu cần. Phải làm rõ cấu trúc phân lớp của vỏ hạt phấn bằng các ảnh phân tích sáng. Các quan sát để chụp ảnh tiến hành trên các tiêu bản tạm thời g ắn trong glyxerin với kính hiển vi quang học. Hiện nay với kỹ thuật hiện đại người ta có nhiều cách chụp khác nhau để thể hiện một cách đầy đủ các chi tiết của đối tượng. + Đánh giá và lập khóa định loại: trên cơ sở những thông số mô tả chúng ta căn cứ trên những dấu hiệu liên quan đến tiến hóa để xây dựng khóa phân loại. 7.4 Phương pháp nghiên cứu tế bào 7.4.1 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của hệ thống học tế bào thực vật là bộ thể nhiễm sắc của toàn bộ các taxôn thực vật bậc thấp cũng như bậc cao. Để nghiên cứu bộ thể nhiễm sắc phục vụ cho hệ thống học thực vật người ta thường tiến hành nghiên cứu bộ nhiễm sắc ở giai đoạn phân bào nguyên nhiễm cụ thể ng ười ta thường sử dụng mầm non của lá, đỉnh sinh trưởng của thân, đỉnh rễ non của cây hoặc đỉnh rễ chính của hạt vừa nẩy mầm vì đó là vùng đang ở giai đoạn phân chia mạnh nhất và vùng phân chia ở ngay ở dưới lớp bao của các cơ quan đó. Bên cạnh đó người ta còn tiến hành nghiên cứu bộ nhiễm sắc ở giai đoạn phân bào giảm nhiễm cụ thể ngườ i ra dùng bông non đối với họ Lúa (Poaceae) ngay sau hay khi mới nhú bông hoặc nụ hoa đối với các loài khác lúc chưa có màu đặc trưng hoặc từ hạt phấn cho nẩy mầm trong ống nghiệm. Phương pháp thông thường tiện lợi và dễ chủ động nhất là gieo hạt trong đĩa petri ở nhiệt độ 23 – 25oC cho hạt nẩy mầm. Thời gian nẩy mầm tuỳ theo từng loại 1 - 2 ngày đến vài tuần lễ. Độ dài của rễ từ 0,8 - 2 cm là dùng được. Người ta tiến hành dùng panh hay kim mũi mác ngắt một đoạn cách đỉnh rễ khoảng 2 mm và nhúng vào dung dịch cố định. Bên cạnh gieo hạt trong đĩa petri người ta còn có thể tiến hành trồng cây trong chậu với đất ẩm và tơi xốp. Đối [...]... lực hỗ trợ cho các nhà phân loại trong trường hợp các khóa phân loại hình thái không đủ để giải quyết vấn đề Tất nhiên cũng cần nói rõ phương pháp này dù nó có phản ảnh bản chất di truyền của loài hay bất kỳ một taxôn nào khác nhưng nó không thể thay thế cho phương pháp phân loại truyền thống Nó sẽ giúp cho việc hoàn chỉnh và làm chính xác cách phân loại truyền thống trên cơ sở dựa vào các dấu hiệu hình... dạng phân tử enzym là một “marker” của gen Vì vậy nó được sử dụng cho loài Trong nội bộ loài, việc sử dụng các dẫn liệu đa hình thông qua tần số alen của các locut cũng có thể chỉ ra tính chất đặc trưng cho các vùng phân bố của loài Trên cơ sở như vậy người ta dùng izoenzym để phân biệt các cá thể thuộc các đơn vị phân loại giữa các thứ hoặc giữa các loài, giữa các loài đồng hình, loài chị em 19 Phương. .. giữa các taxôn, còn việc sử dụng phương pháp này cũng như các phương pháp phân tích ADN dùng trong phân loại không phải đơn giản Việc nhận dạng và suy luận kết quả của phép phân tích điện di cần phải tuân theo những nguyên tắc đặc thù và đòi hỏi các nhà nghiên cứu phải am hiểu các phạm trù trong phân loại học, am hiểu đối tượng mà mình nghiên cứu và phải có quá trình nghiên cứu lâu dài trên cơ sở lấy phương. .. xạ Phân tích các kết quả Thuận lợi của phương pháp này: kết quả có khả năng thực hiện giữ ở các phòng thí nghiệm; các chỉ thị RFLP thường chỉ ra sự kế thừa tương đồng của các dị hợp tử có thể nhận ra từ đồng hợp tử; có khả năng phân biệt ở mức độ loài, quần thể hay cá thể và phương pháp đơn giản Tuy nhiên áp dụng phương pháp này có một số hạn chế: tốn nhiều thời gian, chi phí cao; hầu hết công việc phân. .. có quá trình nghiên cứu lâu dài trên cơ sở lấy phương pháp phân loại bằng hình thái làm cơ sở Về giá trị phân loại của hai phương pháp này có tính hiện thực chỉ khi nào nghiên cứu một cách đầy đủ và trọn vẹn một taxôn nào đấy Trên cơ sở đó mới tìm ra các marker đặc trưng có ý nghĩa trong phân loại Nếu chỉ phân tích từng phần của một taxôn và không phân tích có tính hệ thống thì những số liệu đó chỉ mới... gọi là sự đa hình Các đoạn này có thể di truyền và được sử dụng như các dấu phân tử Dựa trên số đoạn ADN tương đồng của các băng điện di để xác định sự giống nhau hay mối quan hệ họ hàng gần gũi Phương pháp tiến hành: * Tách ADN * Cắt ADN thành những đoạn nhỏ nhờ các enzym giới hạn * * * * Phân tích các đoạn ADN bằng điện di trên gel Chuyển các đoạn ADN sang một màng lọc Hiển thị các đoạn ADN bằng... đối mà thôi và nếu tách phương pháp này 20 khỏi phương pháp phân loại hình thái như một số nhà sinh học phân tử đã làm lại là một sai lầm không thể chấp nhận 7.5.2.1 Kỹ thuật điện di Điện di là một kỹ thuật sắc ký được sử dụng rộng r•i để tách một hỗn hợp các hợp chất có khả năng ion hóa Điện di trên gel kết hợp dựa vào điện tích và quá trình tách dựa vào kích thước phân tử của các đối tượng tham gia... tiếp như sau: L1 L2/3 L4/5 0,31 0,05 → 0,18 Cây chủng loại phát sinh của 5 loài trên được lập như sau: 7.6 Phương pháp phân loại bằng ADN Từ thập kỷ tám mươi của thế kỷ XIX việc phát triển các chỉ thị ADN hay còn gọi là dấu phân tử đã được tiến hành Đó là các chỉ thị về đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP, Botstein và cs, 1980); Đa hình các đoạn ADN nhân ngẫu nhiên (RAPD, Wiliam và cs.1990);... ra sự thay đổi các axit amin trong cấu trúc bậc một của chuỗi polypeptide Cấu trúc này lại do trật tự của các nucleotid trong gen quy định Chính vì vậy khi sử dụng phương pháp điện di trên gen agarose, tinh bột thủy phân, polyacrylamid cùng với việc phối hợp nhuộm hóa tế bào cho phép ta phát hiện các biến dạng khác nhau của phân tử enzym Bởi vậy việc sử dụng các dẫn liệu về đa hình các izoenzym không... tính đa dạng của các izoenzym nhưng chưa chắc các biến đổi đó đã được di truyền lại cho các thế hệ mai sau Vì vậy phải tìm, phải sàng lọc và lựa chọn những biến đổi nào đặc trưng cho loài Đấy mới là điều quan trọng Chính vì vậy phương pháp này chỉ ra cho ta thấy mức độ đa dạng của các gen bên trong và qua đó giúp cho ta biết mối quan hệ huyết thống giữa các taxôn 7.5.2 Phương pháp phân tích izozym . 7. 4.3 Kiểu nhân 17 7. 5 Phương pháp phân loại izoenzym 18 7. 5.1 Định nghĩa izoenzym 18 7. 5.2 Phương pháp phân tích izozym bằng kỹ thuật điện di 19 7. 6. Chương 7 Các phương pháp phân loại 3 7. 1 Phương pháp phân loại hình thái 3 7. 2 Phương pháp phân loại giải phẫu 3 7. 2.1 Nghiên cứu cấu trúc biểu bì lá 3 7. 2.2