Kỹ thuật AFLP là kết hợp giữa kỹ thuật RAPD và nhân đoạn PCR được tiến hành theo các bước sau:
* Cắt ADN genom bằng enzim cắt giới hạn EcoR1 và Msel: Để làm việc này, lấy 0,3
mg ADN ủ 2 giờở 37oC với 3 đơn vị EcoR1 and 3 đơn vị Msel, 6 ml dung dịch điện có nồng
độ gấp 5 lần (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM MgAc, 250 mM KAc).
* Gắn các đoạn cắt với đoạn tiếp hợp: Sau khi cắt, lấy 10 ml hỗn hợp dùng để gắn (1ml
đoạn tiếp hợp EcoR1 (5 pmol/ml) và 1 ml đoạn tiếp hợp Msel (50 pmol/ml), 1ml 10 mM
ATP, 1ml T4 ADN ligase và 4 ml nước cất vô trùng) cho vào 20 ml ADN đã được cắt. Phản
ứng gắn được thực hiện ở 20oC trong 3 giờ. Sau khi gắn các tiếp hợp, ADN được làm lo•ng 10 lần và giữở -20oC.
* Nhân đoạn bước đầu: Trước khi nhân chọn lọc các đoạn ADN đã gắn các tiếp hợp
được nhân bước đầu với các mồi tiền nhân EcoR1 (5’-GACTGCGTACCAATTC-3’) và Msel
(5’GATGAGTCCTGAGTAA3’). Dung dịch phản ứng nhân bước đầu gồm 5ml ADN đã gắn
tiếp hợp và pha lo•ng 10 lần và 25 ml hỗn hợp tiền nhân (0,5 ml mồi tiền nhân EcoR1 (100
ng/ml), 0,5 ml mồi tiền nhân Msel (100 ng/ml), 1,3ml 5mM dNTP, 3ml 10 x đệm PCR, 1,2
ml 50 mM MgCl2, 0,2 ml 5 đơn vị/ml Taq ADN polymerase, và 18,3 ml nước cất vô trùng).
Phản ứng nhân được thực hiện bằng 30 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 30 giây ở 94oC, 1 phút ở
56oC, 1 phút ở 72oC.
* Nhân chọn lọc: Việc nhân chọn lọc các đoạn ADN đã được gắn tiếp hợp và nhân bước
đầu được tiến hành với việc sử dụng các mồi có 2 hoặc 3 nucleotide chọn lọc.
Các mồi chọn lọc EcoR1 có chuỗi nucleotide chung là 5GACTGCGTACCAATT3’ còn
các mồi chọn lọc Msel có chuỗi nucleotide chung là 5’GATGAGTCCGAGTAA-3’. Các mồi
chọn lọc khác nhau ở chỗ ngoài chuỗi nucleotide chung chúng có từ 1 đến 3 nucleotide chọn
lọc. Chẳng hạn EcoR1-C, EcoR1-CT, EcoR1-CAT hay Msel-A, Msel-AG, Msel-GC.
Nhân chọn lọc được thực hiện trong 12ml dung dịch gồm 6 ml hỗn hợp phản ứng (1,25
ml 10 x đệm PCR, 0,6 ml 50 mM MgCl2, 0,6 ml 5 mM dNTP, 0,5 ml mỗi loại mồi chọn lọc,
0,1 ml 5 đơn vị Taq ADN polymerase và 3 ml nước cất vô trùng). Phản ứng nhân chọn lọc
được thực hiện bằng 36 chu kỳ như sau: 1 chu kỳ gồm gi•n xoắn ở 94oC trong 30 giây, gắn mồi ở 65oC trong 1 phút và kéo dài mồi ở 72oC trong 2 phút; tiếp theo là 12 chu kỳ với nhiệt
Các sản phẩm nhân chọn lọc được phân lập bằng điện di trên gel polyacrylamide biến tính 5%. Điện di được tiến hành với dòng điện công suất ổn định 75W trong 2 giờ. Sau điện di gel được nhuộm bằng nitrate bạc.
Ưu điểm của kỹ thuật này là: Độ nhạy cao; tái thực hiện; ứng dụng rộng r•i; phân biệt
được dị hợp tử. Tuy nhiên có một số hạn chế: chi phí cao; yêu cầu kỹ thuật nghiêm ngặt và phải sử dụng chất phóng xạ.