Bản mỏng được chuẩn bị sẵn là loại bản có thể tự tráng hoặc mua trên thị trường, sau đó chấm mẫu phân tích mẫu đã được hòa tan trong một dung môi dễ bay hơi thích hợp lên bản mỏng, chấm
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ HĨA HỌC ThS Nguyễn Thị Ngọc Lan THỰC HÀNH CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ BÀI 1: CHƯNG CẤT LÔI CUỐN HƠI NƯỚC Lý thuyết Chưng cất trình chuyển chất lỏng thành ngưng tụ thành lỏng Để chuyển chất lỏng thành hơi, tiến hành đun sơi chất lỏng Chất lỏng sơi áp suất áp suất bên Khi áp suất bên giảm nhiệt độ sơi chất giảm Phương pháp chưng cất lôi tinh dầu nước dựa nguyên lý trình chưng cất hỗn hợp không tan lẫn vào nước tinh dầu Khi hỗn hợp gia nhiệt, hai chất bay Nếu áp suất nước cộng với áp suất tinh dầu áp suất môi trường hỗn hợp sơi, tinh dầu lấy với nước Phương pháp có ưu điểm giúp tránh việc phải đun nóng hỗn hợp lên nhiệt độ cao phá hủy hay nhiều cấu tử hỗn hợp a) Chưng cất lôi nước trực tiếp Nguyên liệu nước cho vào thiết bị, đun sôi, nước bay lôi theo tinh dầu, sau làm lạnh ngưng tụ hơi, ta thu tinh dầu sau phân ly tách nước Hình 1: Chưng cất lôi nước trực tiếp b) Chưng cất lơi nước gián tiếp Sử dụng bình tạo nước riêng (bình 1), bình khác chứa nước ngun liệu (bình 2) Khi đun sơi nước bình 1, nước từ bình vào bình lơi theo tinh dâu có nguyên liệu sau bị ngưng tụ ống sinh hàn hứng vào bình hứng Hình 2: Hệ thống chưng cất lôi nước gián tiếp THỰC HÀNH Trong này, sinh viên tiến hành trích tinh dầu từ vỏ cam vỏ bưởi chưng cất lôi nước Tinh dầu vỏ cam có màu vàng đậm, mùi thơm đặc trưng phần vỏ tinh dầu bưởi có màu vàng nhạt, mùi gỗ nhẹ với thành phần Limonene a) Dụng cụ hóa chất Dụng cụ Bộ chưng cất lơi nước Bếp điện đun bình cầu Dao/Kéo Cốc thủy tinh 50ml Phễu chiết 1 1-2 Nguyên liệu/Hóa chất Vỏ cam/vỏ bưởi Số lượng 50-100g Diethyl ether Na2SO4 khan NaCl b) Cách tiến hành Vỏ cam rửa sạch, xay nhỏ ngâm dung dịch NaCl 10% khoảng Sau cho vào bình cầu, thêm nước đến khoảng 2/3 thể tích bình Lắp hệ thống chưng cất lơi nước hình Đun sơi nước bình cầu Khi nước sôi, nước bay lên mang theo tinh dầu, bị ống sinh hàn làm lạnh ngưng tụ thành thể lỏng rơi xuống ống gạn Trong ống gạn cho sẵn nước, dung dịch tách thành lớp Khi lượng nước ống gạn tăng lên, trả bình cầu nhờ ống ngang thông Sau khoảng từ nước sôi, ngừng chưng cất, mở khóa thu hỗn hợp tinh dầu nước vào cốc 50ml Cho hỗn hợp tinh dầu – nước vào phễu chiết, thêm 15ml diethyl ether, lắc phễu chiết, đặt phễu chiết vào giá, mở nút đợi đến hai lớp chất lỏng tách lớp Lớp ether chứa tinh dầu Lớp nước Mở khóa thu pha nước dung dịch ether riêng hai cốc Phần pha nước tiếp tục trích với diethyl ether để lấy hết tinh dầu lại Gộp chung lần trích, cho Na2SO4 khan vào dung dịch, lọc thu dung dịch Cô quay đun cách thủy để loại dung môi Sau bay hết dung mơi, đề nguội đong thể tích cân khối lượng Nội dung báo cáo Màu sắc, khối lượng tinh dầu thu được? Tại cho hỗn hợp tinh dầu – nước vào phễu chiết cho thêm dung môi diethyl ether, lớp ether nằm trên, cịn nước nằm dưới? Mục đích sử dụng Na2SO4? BÀI 2: SẮC KÝ LỚP MỎNG VÀ SẮC KÝ CỘT Lý thuyết a) Sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng kỹ thuật cần sử dụng lượng nhỏ mẫu chất (10-7g) để tách nhanh định tính hợp chất Sắc ký lớp mỏng kỹ thuật phân bố rắn – lỏng đó, pha lỏng di động cho lên lớp mỏng chất hấp phụ, chất tráng phủ lên kiếng, nhôm hay miếng plastic Do chất hấp phụ tráng thành lớp mỏng nên có tên gọi bảng mỏng Bản mỏng chuẩn bị sẵn loại tự tráng mua thị trường, sau chấm mẫu phân tích (mẫu hịa tan dung mơi dễ bay thích hợp) lên mỏng, chấm thành vết nhỏ gọn, sấy nhẹ để đuổi phân dung mơi hịa tan mẫu Khi đó, mẫu chất cịn lại bột khơ mỏng Đặt mỏng theo chiều thẳng đứng bình có chứa sẵn dung mơi phù hợp Do tác dụng lực mao quản, dung môi thấm theo mỏng qua điểm xuất phát Sau đó, vết xác định phương pháp vật lý (nhìn mắt, soi đèn tử ngoại, ) phương pháp hóa học (sử dụng thuốc thử) Một chất tinh khiết cho vết trịn có giá trị Rf không đổi dung môi xác định 𝑅𝑓 Đ𝑜ạ𝑛 đườ𝑛𝑔 𝑑𝑖 𝑐ℎ𝑢𝑦ể𝑛 𝑐ủ𝑎 𝑐ℎấ𝑡 Đ𝑜ạ𝑛 đườ𝑛𝑔 𝑑𝑖 𝑐ℎ𝑢𝑦ể𝑛 𝑐ủ𝑎 𝑑𝑢𝑛𝑔 𝑚ô𝑖 b) Sắc ký cột Sắc ký cột phương pháp tách cấu tử hóa học khỏi hỗn hợp chúng Đối với chất riêng biệt pha hỗn hợp cần tách, tùy theo khả hấp phụ khả hòa tan hịa với dung mơi rửa cột để lấy trước sau Chất hấp phụ sắc ký cột thường dùng silica gel Sắc ký cột hở tiến hành áp suất khí Pha tĩnh chất hấp thu, mẫu chất cần phân tích nạp lên đầu cột, phía pha tĩnh Pha động dung môi giải ly cột Các yếu tố ảnh hưởng đến khả tách gồm: • Lựa chọn chất hấp phụ • Lựa chọn dung mơi giải li • Kích thước cột, khối lượng chất hấp phụ, lưỡng mẫu dùng • Vận tốc giải ly Cột rửa sạch, sấy khô Cột ống thủy tinh có khóa, cột giữ cố định thẳng đứng, phía có bình hứng, đáy cột lót lớp bơng gịn Sau tiến hành nhồi cột (nhồi ướt nhồi khô) Khi cho chất hấp phụ hết vào cột, tiếp tục cho dung môi chảy ngang qua chất hấp phụ liên tục thời gian để giúp cho việc nạp cột chặt chẽ Sau cột ổn định cho mẫu chất cần phân tích vào cột Mở khóa cột hạ mực dung môi đến sát mức chất hấp phụ có cột, dùng ống nhỏ giọt cho mẫu vào đầu cột, mở khóa cho dung dịch mẫu thấm xuống bề mặt chất hấp phụ Cho lớp bơng gịn đặt nhẹ len mặt thoáng chất hấp phụ bắt đầu tiến hành cho dung môi giải ly Thực hành a) Dụng cụ hóa chất Dụng cụ Hóa chất Cột sắc ký Acetone Cốc thủy tinh 250 ml Ether dầu hỏa Cốc thủy tinh 100 ml Silica gel Cối chày Phễu thủy tinh Phễu chiết Cối chày Ống nghiệm 15 Đũa thủy tinh Bếp điện Cốc thủy tinh dùng giải ly mỏng Bản mỏng silica gel Ống vi quản Kiếng thủy tinh Ống đong 10 ml b) Cách tiến hành ❖ Chuẩn bị dịch sắc tố màu Cho rửa sạch, lau thật khô, cắt nhỏ vào cối dùng chày nghiền nát Chuyển giã nát vào cốc 100 ml có chứa sẵn 30 ml hỗn hợp gồm 18 ml ether dầu 12 ml acetone, lắc 10 phút, lọc lấy dịch trích, cho vào cốc khác phễu giấy lọc Rửa bã nằm phễu ml hỗn hợp Cho dịch trích vào phễu chiết, rửa 20 ml nước, tách riêng lớp hữu (lớp trên) cho vào cốc thủy tinh khác, làm khan Na2SO4, gạn lấy dung dịch Đun cách thủy dung dịch để loại bớt dung môi, thu dung dịch sắc tố đậm đặc ❖ Chuẩn bị cột sắc ký chọn dung môi giải ly Dùng đũa thủy tinh dài để nhồi lớp bơng gịn dày khoảng 1-2mm vào đáy cột, không nhồi chặt ráp cột sắc ký thẳng đứng vào giá nhờ kẹp, thêm dung môi ether dầu hỏa cho đầy cột Cho 15ml dung môi ether dầu hỏa vào cốc thủy tinh 100ml, thêm từ từ 10g silica gel khuấy để thấm ướt hết silica gel Cho từ từ silica gel vào cột sắc ký, vừa gõ cột mở khóa kho dung mơi chảy giọt Lưu ý dung môi ngập silica gel Sau cho hết silica gel, mở khóa để dung mơi chảy ra, hứng dung môi để sử dụng cho đoạn Cắt mỏng thành nhỏ có kích thước 2x10 cm Dùng bút chì vạch mức xuất phát cách mép cm mức tiền tuyến dung môi cách mép 0.5 cm STT Dung môi giải ly Tỉ lệ Ether dầu hỏa 100% Ether dầu hỏa : acetone 90:10 Ether dầu hỏa : acetone 70:30 Cho dung môi giải ly vào ly thủy tinh khác (đã có sẵn giấy lọc), đậy miếng kiếng thủy tinh để dung môi bão hòa Chấm mẫu lên mỏng tiến hành giải ly, chọn dung môi phù hợp để tiến hành sắc ký cột ❖ Nạp mẫu vào cột sắc ký Khi dung mơi cột nằm lớp silica gel cịn khoảng mm khóa cột lại Dùng ống nhỏ giọt để đưa mẫu vào đầu cột sắc ký Từ từ mở khóa cột dung dịch mẫu thấm xuống bề mặt silica gel đầu cột, lúc thấy dung dịch xuống gần lớp silica gel khóa cột lại, tiếp tục nạp cho mẫu vào đầu cột (lưu ý giữ lại mẫu để chấm sắc ký lớp mỏng) Mở khóa để hạ mực dung dịch mẫu xuống sát mặt thống chất hấp phụ, đóng khóa lại Dùng ống nhỏ giọt cho lượng nhỏ dung môi hệ dung môi chọn để sắc ký cột vào đầu cột, mở khóa để dịch màu tiếp tục thấm xuống silica gel Đến thấy dịch chất màu gắn chặt vào silica gel phần đầu cột Liên tục cho dung môi vào để giải ly Sắc tố di chuyển khỏi cột hứng vào ống nghiệm Tiến hành sắc ký lớp mỏng ống nghiệm chứa sắc tố màu dung dịch mẫu trước chạy cột mỏng để so sánh Nội dung báo cáo Cho biết dung môi hệ dung môi lựa chọn để tiến hành sắc ký cột Nêu tượng quan sát trình chạy cột? Cho biết màu sắc, hình dạng vết giá trị Rf chất có mẫu BÀI 3: CHIẾT TÁCH VÀ TINH CHẾ RUTIN Lý thuyết a) Kỹ thuật chiết tách Phương pháp chiết phương pháp tách chất từ hỗn hợp dung mơi thích hợp Có phương pháp chiết sau Có thể chiết từ hỗn hợp dung dịch hay từ chất rắn Tùy theo chất chất bị chiết môi trường chúng tồn để chọn dung mơi chiết cho thích hợp, nghĩa dung mơi hòa tan hòa tan nhiều chất định chiết mà khơng hịa tan hay hịa tan chất khác hỗn hợp Quá trình chiết kết thúc chiết hết chất cần chiết Điều kiểm tra màu hay sắc ký ❖ Chiết rắn – lỏng Hiệu suất chiết chất rắn chất lỏng phụ thuộc trước hết vào độ hòa tan, tốc độ chuyển từ pha sang pha khác Tính tan phụ thuộc vào dung mơi tốc độ hịa tan phụ thuộc vào bề mặt tiếp xúc Thường chất rắn chiết liên tục máy chiết Soxhlet Nguyên tắc sau: đun nóng dung mơi bình cầu cho dung mơi lên bình chiết chứa chất qua ống sinh hàn ngược ngưng tụ chảy trở lại vào bình chiết Dung mơi lựa chọn phải hịa tan chất nghiên cứu phải hòa tan chất phụ qua ống nhánh chảy trở lại bình cầu Nếu dung mơi hịa tan chất phụ chất hữu nghiên cứu cịn lại bình chiết, cịn dung mơi hịa tan chất nghiên cứu thu chất hữu bình cầu chất nghiên cứu tách khỏi dung môi phương pháp khác ❖ Chiết lỏng – lỏng Đây phương pháp tách dựa di chuyển chất từ pha lỏng sang pha lỏng khác tính tan khác chúng hai pha lỏng riêng biệt Trong đó, pha dung dịch chứa chất cần chiết, pha cịn lại dung mơi chiết Chiết chất hữu từ dung dịch lắc dung dịch với dung mơi thích hợp khơng trộn lẫn với dung mơi cũ có khả hịa tan tốt chất cần chiết dung môi cũ Trong trường hợp chất cần chiết tan dung môi cũ nhiều dung mơi hay khơng chọn dung mơi không dùng phương pháp chiết thường trên, mà phải dùng phương pháp chiết liên tục Để lắp ráp dụng cụ cho phương pháp chiết liên tục cần phải biết tỉ khối dung môi cao hay thấp so với chất cần chiết ❖ Chiết pha rắn Chiết pha rắn (hay chiết rắn – lỏng) trình phân bố chất tan hai pha lỏng rắn Trong đó, chất tan ban đầu pha lỏng (nước dung môi hữu cơ), chất để hấp thụ chất tan dạng rắn (dạng hạt nhỏ xốp) gọi pha rắn Khi cho pha lỏng qua cột chiết (hoặc đĩa chiết), pha rắn tương tác với chất cần phân tích giữ nhóm (hoặc số nhóm) chất cần phân tích lại pha rắn, chất lại khỏi cột với dung mơi hịa tan mẫu Sau đó, dùng dung mơi thích hợp để lấy nhóm chất cần phân tích khỏi cột b) Kỹ thuật tinh chế ❖ Phương pháp kết tinh: Kết tinh trình hình thành phát triển tinh thể từ tướng nóng chảy, dung dịch hay khí Phương pháp kết tinh lại phương pháp tinh chế quan trọng dựa tính bão hịa chất rắn cần tinh chế đun nóng dung mơi thích hợp, loại bỏ chất phụ chất kết tinh trở lại làm lạnh Quá trình kết tinh lại gồm giai đoạn sau: - Hòa tan mẫu chất rắn không tinh khiết dung môi thích hợp - Lọc nóng dung dịch để loại bỏ chất phụ không tan - Làm lạnh dung dịch đuổi bớt dung môi để tạo dung dịch bão hịa gây mầm kết tinh - Làm khơ tinh thể Quy trình làm lại nhiều lần để thu chất tinh khiết ❖ Phương pháp thăng hoa Thăng hoa trình làm bay chất rắn thành ngưng tụ lại thành trạng thái rắn, không qua trạng thái lỏng Phương pháp tiến hành thăng hoa áp suất thường: Với dụng cụ đơn giản lượng nhỏ cho chất cần thăng hoa vào bát sứ, phủ giấy lọc có chọc thủng nhiều lỗ nhỏ đậy bát phễu thủy tinh có đậy cuống phễu bơng Sau đun nóng bát sứ lửa đèn cồn hay bếp điện qua lưới amiant hay bếp cách cát cách cẩn thận đun nóng q phân hủy chất thăng hoa ❖ Kỹ thuật chưng cất Chưng cất trình chuyển chất lỏng thành ngưng tụ thành lỏng Để chuyển chất lỏng thành hơi, tiến hành đun sơi chất lỏng Chất lỏng sơi áp suất áp suất bên ngồi Khi áp suất bên ngồi giảm nhiệt độ sôi chất giảm Với chất tinh khiết nhiệt độ sơi khơng đổi q trình đun, khơng có tượng q nhiệt đun mạnh Nếu nhiệt độ sôi chất thấp nhiệt độ chất bị phân hủy tiến hành chưng cất áp suất thường Còn nhiệt độ sôi chất cao nhiệt độ phân hủy phải tiến hành chưng cất áp suất thấp Phương pháp chưng cất thường dùng để tách biệt (tinh chế) chất có nhiệt độ sơi khác khỏi hỗn hợp Có nhiều phương pháp chưng cất khác tùy thuộc vào tính chất hỗn hợp chất lỏng - Với chất có nhiệt độ sôi xa thường chọn phương pháp cất đơn hay cất thường - Với chất có nhiệt độ sơi gần thường chọn phương pháp chưng cất phân đoạn - Phương pháp chưng cất lôi nước dùng để tách biệt chất hỗn hợp, có chất khơng tan nước dễ bay với nước Thông thường phương pháp lựa chọn thỏa mãn điều kiện không thực với hai phương pháp Thực hành a) Dụng cụ hóa chất Dụng cụ Bộ chiết Soxhlet Cốc thủy tinh 250 ml Cốc thủy tinh 100 ml Phễu Buchner Bình fiol Đũa thủy tinh Phễu thủy tinh Giấy lọc 2 1 1 Ngun liệu/Hóa chất Nụ hoa hịe 50-100g Cồn 90o Ether dầu hỏa b) Cách tiến hành Cân 50g hoa hịe sấy khơ vào ống chứa mẫu chiết Soxhlet Cho 250 ml ethanol vào bình cầu Chiết 2-3 Lọc nóng lấy dịch chiết Cơ quay thu hồi dung mơi Cao chiết hồ tan vào ethanol nóng Để nguội đến nhiệt độ phịng, để dung dịch bắt đầu kết tinh Lọc qua Buchner, sản phẩm thô rửa ether dầu hoả đến nước rửa khơng cịn màu xanh dừng lại Cân lượng cụ thể rutin thô thu Cho rutin thô vào cốc thủy tinh, thêm lượng tối thiểu nước, đun bếp cách cát dùng lưới amiant, dùng đũa thủy tinh khuấy chất hịa tan hết Nếu nước nóng mà chất chưa hòa tan hết, tiếp tục cho thêm lượng nhỏ ethanol vào, đun sôi khuấy cho tan hết Sau chất hòa tan hết, tiến hành lọc nóng từ từ qua cốc thứ (đã chứa sẵn nước đặt sẵn bếp) phễu thủy tinh có chứa giấy lọc (đã thấm ướt nước nóng) Nếu dung dịch nguội từ từ, chất rắn kết tinh với tinh thể lớn, làm nguội nhanh, tinh thể nhỏ Trong lúc chờ kết tinh, không nên dùng đũa thủy tinh khuấy trộn dung dịch làm gãy vụn tinh thể Trong trường hợp có kết tinh chậm, khơi mào kết tinh cách dùng đũa thủy tinh cọ nhẹ vào bên thành cốc, mặt thoáng dung dịch Sau lọc xong, để yên cho nguội dần, sản phẩm kết tinh Sau chất rắn kết tinh hoàn toàn, lọc chất rắn cách lọc áp suất Hệ thống gồm hệ thống tạo áp suất có sẵn phịng thực hành, bình lọc có vịi (bình fiol), phễu Buchner, phễu có đặt miếng giấy lọc cắt vừa vặn cho tờ giấy lọc đặt vừa khít, lọt lịng đáy phễu Khi lọc, ráp hệ thống hình vẽ, mở hệ thống tạo áp suất kém, thấm ướt tờ giấy lọc dung mơi tờ giấy lọc hút sát vào đáy phễu, rót chất cốc vào phễu Cân tính hiệu suất Nội dung báo cáo Khối lượng rutin thô rutin sau kết tinh lại Tính hiệu suất trình kết tinh Mơ tả tượng quan sát kết tinh lại rutin So sánh màu sắc rutin thô rutin sau kết tinh lại? Cho biết cơng thức hóa học rutin Có thể kết tinh lại rutin ethanol thay nước hay khơng? Giải thích