Các kĩ thuật lai phân tử

Các phương pháp lai phân tử Nhóm Khái niệm Cơ sở lai phân tử Nội dung Các yếu tố ảnh hưởng đến lai phân tử Nguyên lý lai phân tử Các dạng lai phân tử Khái niệm • Phương pháp lai phân tử kỹ thuật hóa học sinh học phân tử, sử dụng để tạo phân tử cách kết hợp tài liệu di truyền từ hai nguồn khác • Q trình nhằm tạo đa dạng genetict tạo phân tử có tính chất đặc biệt ứng dụng nhiều lĩnh vực • Hai mạch đơn phân tử DNA tách thành sợi đơn tác động nhiệt độ • Nếu nhiệt độ giảm từ từ điều kiện thích hợp, hai mạch bắt cặp trở lại • Hiện tượng gọi lai phân tích Cơ sở lai phân tử • Nhiệt độ nóng chảy (Tm) DNA • Các nhân tố ảnh hưởng đến Tm - Thành phần base - Độ dài - Ảnh hưởng điểm bắt cặp sai lệch - Ảnh hưởng môi trường phản ứng (nồng độ muối formamide) -Tm = 16,6 log[M] + 0,41 (%GC) + 81,5 - % mismatch – 675/chiều dài (cặp base) – 0,65 (% formamide) Các yếu tố ảnh hưởng đến lai phân tử Nồng độ DNA thời gian phản ứng Được xem xét đồng thời, tích số nồng độ (concentration) thời gian gọi Cot Cot1/2 giá trị có 50% số phân tử lai • Nhiệt độ Tốc độ phản ứng lai cực đại nhiệt độ thấp Tm phân tử khoảng 25% • Độ dài trình tự Tốc độ lai tỉ lệ thuận với bình phương độ dài trình tự bổ sung • Lực ion Nồng độ NaCl 1M làm tăng tốc độ phản ứng lên từ – 10 lần Nguyên lý lai phân tử -Là KT sử dụng sợi đơn acid nucleic, gọi đoạn dò (probe), bắt cặp bổ sung với sợi đơn acid nucleic khác, gọi phân tử đích (target) -Nhằm phát và/hoặc phân lập phân tử đích hỗn hợp nhiều sợi acid nucleic -Phân loại chất hóa học phân tử lai hỗn hợp: • DNA:DNA •DNA:RNA • RNA:RNA -Phân loại nguồn gốc phân tử lai hỗn hợp: • Probe-Probe • Target-Target • Target-Probe Southern blot Các kĩ thuật Northern blot Wesetern blot Southern blot Nguyên lý kỹ thuật southern blot: •Dựa nguyên tắc biến tính hồi tính phân tử DNA •Dựa vào nguyên tắc bổ sung cặp nucleotide: A-T, G-C (các đoạn polynucleotide mạch đơn có trình tự bổ sung) •Màng lai nitrocellulose hay nylon có khả tiếp nhận DNA Nguyên tắc lai southern blot: •Phản ứng lai cần nhiệt độ cao hố chất gây biến tính DNA ( NaOH, Formandehyt) •Địi hỏi đoạn DNA (RNA) biết trình tự để làm mồi “Probe” Probe đánh dấu •Các vật liệu, trang thiết bị máy móc xác: màng lai, máy Blotting, buồng lai, máy PCR Quy trình thực -Xử lý mẩu ban đầu -Điện di truyền -Chuyển lên màng -Chế độ chuẩn màng -Xác định phân tích 10 Ứng dụng kỹ thuật southern blot •Southern blot sử dụng dể đánh giá copy gen genome, xác định intron, exon, đoạn bị đột biến thêm đoạn… •Khi sử dụng DNA marker khác làm mẫu dị, phân biệt lồi, lồi đồng hình •Southern blot – RFLP: giúp phát đa dạng chiều dài đoạn cắt RE, qua đó, nhận biết sai biệt di truyền vị trí nhận biết RE dẫn đến sai biệt chiều dài đoạn DNA tạo từ RE Đồng thời, RFLP cịn sử dụng để xác định huyết thống, lập đồ giới hạn gen •Chẩn đoán bệnh thai nhi 20XX presentation title 11 NORTHERN BLOT Phương pháp thấm Northern, hay RNA blot (thấm RNA), kỹ thuật sử dụng nghiêm cứu sinh học phân tử để xác định mức độ biểu gen cách đo lượng RNA (hoặc mRNA cô lập) xuất mẫu thử 20XX presentation title 12 Northern blot 13 Northern blot • Kỹ thuật Northern Blotting gần giống với kỹ thuật Southern Blotting; khác biệt phương pháp làm mờ vết rạn phía bắc, có xác định cụ thể phân tử RNA mRNA cho biểu gen 20XX presentation title 14 Quy trình • • • • • • • • Xử lý mẩu ban đầu Điện di truyền Chuyển lên màng Chế độ chuẩn màng Đánh dấu probe Phản ứng với probe Rữa màng Xác định phân tích 15 Ứng dụng • Các kĩ thuật sử dụng để biểu mức gen sinh ung (gen ung thư) giảm biểu gen ức chế khối u tế bào ung thư so với tế bào bình thường biểu gen trình thải trừ tạng ghép 20XX presentation title 16 WESTERN BLOT Quy trình Western blot, gọi immunoblot, phương pháp phân tích phát protein mẫu Phương pháp cho phép xác định diện, lượng kích thước protein quan tâm mẫu 20XX presentation title 17 Quy trình • • • • Xử lý mẩu ban đầu Điện di truyền Chuyển lên màng • Chế độ chuẩn màng Phản ứng với kháng thể chất đích 18 Ứng dụng • Xác định hoạt động gel thơng qua có mặt protein mơ • Nhận dạng protein mục tiêu • Đánh giá tính chun biệt kháng thể • Phân tích bệnh vi khuẩn virus gây ra: thử nghiệm khẳng định HIV, viêm gan B • Năm 2002, ứng dụng thành công phương pháp Western Blot việc xác định kháng nguyên giun đũa chó (Toxocara canis) thỏ (Olga Lucia Morales ctv, 2002), mở hướng việc xét nghiệm chẩn đốn xác bệnh ký sinh trùng người 19 Thanks you