SOUTHERN BLOTTING Là KT giúp chuyển DNA đích từ gel lên màng. Tiến trình KT: 1. Phân cắt DNA đích bang enzym cắt hạn chế phù hợp. 2. Điện di sản phẩm trên gel agarose. 3. Phân tách phân tử DNA sợi đôi thành sợi đơn. 4. Chuyển DNA sợi đơn lên màng nylon hoặc nitrocellulose bằng phương pháp thẩm thấu. 5. Cho các đoạn dò bắt cặp với DNA đích trên màng. 6. Hiển thị kết quả bang KT phóng xạ tự ghi. 81720 Nguyen MInh Ha 11
Kỹ thuật Lai phân tử Nguyễn Minh Hà drnguyenminhha@gmail.com BM Hóa sinh – SHPT YH, Trường DHYK PNT Nêu nguyên lý KT Lai phân tử Mục tiêu 8/17/20 Liệt kê số ứng dung KT Lai phân tử khác Nguyen MInh Ha Nguyên lý Đoạn dò phương pháp phát Các KT Lai phân tử: Nội dung Northern blotting/Southern blotting Dot blot/Microarray FISH 8/17/20 Nguyen MInh Ha Sự biến tính hồi tính DNA Nhiệt độ nóng chảy (Tm) Nhiệt độ bắt cặp (Th) NGUYÊN LÝ 8/17/20 Nguyen MInh Ha NGUYÊN LÝ Là KT sử dụng sợi đơn acid nucleic, gọi đoạn dò (probe), bắt cặp bổ sung với sợi đơn acid nucleic khác, gọi phân tử đích (target) Nhằm phát và/hoặc phân lập phân tử đích hỗn hợp nhiều sợi acid nucleic 8/17/20 Nguyen MInh Ha Phân loại chất hóa học phân tử lai hỗn hợp: DNA:DNA DNA:RNA NGUYÊN LÝ RNA:RNA Phân loại nguồn gốc phân tử lai hỗn hợp : Probe-Probe Target-Target Target-Probe 8/17/20 Nguyen MInh Ha NGUYÊN LÝ đặc điểm quan trọng trình lai là: (1) đoạn dị gắn với trình tự đích; (2) đoạn dị tìm thấy phân tử đích hàng triệu phân tử liên quan 8/17/20 Nguyen MInh Ha NGUYÊN LÝ Nhiệt độ nóng chảy (Tm ): điểm nhiệt mà đó, 50% phân tử DNA dung dịch phân tách thành sợi đơn Nhiệt độ bắt cặp (Th) tính tốn từ Tm Tm Th bị ảnh hưởng bởi: chiều dài, cấu trúc, % GC đoạn dị phân tử đích, nồng độ muối dung dịch … 8/17/20 Nguyen MInh Ha Là đoạn DNA or RNA (20 bp - < 2kb), bổ sung đơi base với phân tử đích ĐOẠN DỊ (PROBES) Có thể dạng sợi đơn sợi đôi chuyển thành dạng sợi đơn tham gia phản ứng lai Được đánh dấu để nhận diện: Đồng vị phóng xạ (32P, 35S) KT phóng xạ tự ghi Biotine/Streptavidine KT so màu Chất phát quang sinh học àKT đo quang phổ 8/17/20 Nguyen MInh Ha SOUTHERN BLOTTING 8/17/20 Nguyen MInh Ha 10 Là KT giúp chuyển RNA đích từ gel lên màng NORTHERN BLOTTING 8/17/20 Các bước tiến hành tương tự Southern blotting Chủ yếu sử dung để đánh giá mức độ biểu gen bất thường trình phiên mã Nguyen MInh Ha 19 Là KT sàng lọc nhanh DOT BLOTTING Sử dung pp Allele-Specific Oligonucleotide (ASO): phân biệt allele khác nucleotide Không cần KT điện di Không xác định chiều dài phân tử đích Có thể tiến hành nhiều mẫu lúc 8/17/20 Nguyen MInh Ha 20 Chuyển mẫu lên màng DOT BLOTTING Ví dụ: Lai với probe “ba' t thường” “G” Lai với probe “bình thường” “Ä” - Mẫu bình thường A/A - Mẫu dị hợp A/G - Mẫu đồng hợp G/G A/A A/G G/G 8/17/20 Nguyen MInh Ha 21 Microarray = DNA chip = biochip = gene array Nguyên lý: Lai phân tử DNA microarray Set of DNA spots (probes) gắn giá đỡ rắn (thủy tinh, nhựa, silicon) Mỗi điểm gắn DNA chứa 10-12 mol probe Các phân tử lai phát định lượng độ mạnh tín hiệu huỳnh quang KQ phân tích phần mềm liệu mã nguồn mở Ứng dụng: nghiên cứu trạng thái biểu số lượng lớn gen; tạo lượng lớn liệu, nghiên cứu đánh giá trạng thái tổng thể tế bào sinh vật 8/17/20 Nguyen MInh Ha 22 DNA microarray 8/17/20 Nguyen MInh Ha 23 DNA microarray 8/17/20 Nguyen MInh Ha 24 DNA microarray 8/17/20 Nguyen MInh Ha 25 8/17/20 Nguyen MInh Ha 26 FISH = Fluorescent In-Situ Hybridization Phản ứng lai tiến hành trực tiếp tế bào mô mà không cần tách chiết acid nucleic khỏi tế bào FISH Sử dung probe đặc hiệu có gắn tín hiệu huỳnh quang,, nhằm phát diện (hoặc không) đoạn gen NST quan tâm KQ đọc KHV huỳnh quang Ứng dụng: xác định biến đổi di truyền cấp độ gen NST 8/17/20 Nguyen MInh Ha 27 FISH 8/17/20 Nguyen MInh Ha 28 FISH 8/17/20 Nguyen MInh Ha 29 FISH 8/17/20 Nguyen MInh Ha 30 FISH 8/17/20 Nguyen MInh Ha 31 FISH 8/17/20 Nguyen MInh Ha 32 Phản ứng lai xảy đoạn dò phân tử acid nucleic đích TĨM TẮT Sự đa dạng chất phân tử đích phương pháp phát tạo nên nhiều KT lai khác Ứng dụng: Xác định biến đổi di truyền Nghiên cứu biểu gen 8/17/20 Nguyen MInh Ha 33 ... acid nucleic khác, gọi phân tử đích (target) Nhằm phát và/hoặc phân lập phân tử đích hỗn hợp nhiều sợi acid nucleic 8/17/20 Nguyen MInh Ha Phân loại chất hóa học phân tử lai hỗn hợp: DNA:DNA... Nêu nguyên lý KT Lai phân tử Mục tiêu 8/17/20 Liệt kê số ứng dung KT Lai phân tử khác Nguyen MInh Ha Nguyên lý Đoạn dò phương pháp phát Các KT Lai phân tử: Nội dung Northern... đoạn dị tìm thấy phân tử đích hàng triệu phân tử liên quan 8/17/20 Nguyen MInh Ha NGUYÊN LÝ Nhiệt độ nóng chảy (Tm ): điểm nhiệt mà đó, 50% phân tử DNA dung dịch phân tách thành sợi đơn Nhiệt