Kỹ thuật phân tử

CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT ACID NUCLEIC 2/2016 DNA DNA tái tổ hợp (recombinant DNA) RNA DNA gen (genomic DNA) Guanidium thiocyanate Phenol SDS PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT DNA  Bước Phá màng tế bào màng nhân, giải phóng DNA phân hủy protein liên kết với DNA Tế bào, mô nghiền hỗn hợp chất tẩy (SDS, sarcosyl) proteinase (proteinase K, lysozyme)  Bước Loại bỏ thành phần không mong muốn mẫu (protein, polysaccharide, lipid, RNA) Sử dụng phenol:chloroform làm biến tính protein  Bước Nucleic acid kết tủa ethanol (tỉ lệ 2:1) hay isopropanol (tỉ lệ 1:1) kết hợp nồng độ muối cao, sau thu nhận cách ly tâm Một số dụng cụ ly trích phân tử sinh học 1000 -100 10 - Những lưu ý sử dụng micropipette Khoảng thể tích sử dụng micropipette Cách điều chỉnh thể tích lấy mẫu Loại đầu tip sử dụng Pha lỏng DNA protein Pha hữu RNA, lipid Tách chiết DNA sử dụng phenol:chloroform:isoamyl alcohol, pH 8; DNA nằm pha lỏng hỗn hợp DNA kết tủa ethanol 70% Cột silica chứa mẫu DNA buffer có nồng độ ion cao Monogram for estimation of centrifuge rpm setting PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT RNA Phương pháp tách chiết RNA toàn phần gồm bước phương pháp tách chiết DNA  Tế bào, mô nghiền dung dịch gồm chất tẩy mạnh, tác nhân gây biến tính protein mạnh (guanidinium thiocyanate), chất khử (β-mercapto ethanol)  Các protein loại bỏ khỏi mẫu qua xử lí phenol:chloroform li tâm  RNA hịa tan nước tủa ethanol thu nhận thông qua li tâm 10 59 Phương pháp dideoxynucleotide Sanger Dựa vào tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự DNA cần xác định trình tự nhờ enzyme DNA polymerase • Sử dụng loại nucleotide thơng thường loại dideoxynucleotide (ddNTP) có nhóm 3’OH thay H • Trình tự DNA cần xác định phải tạo dòng vector mạch đơn (phage M13) • Thành phần phản ứng gồm: DNA pol, mồi bắt cặp với trình tự chuyên biệt phage M13, loại nucleotide (1 loại đánh dấu đồng vị phóng xạ 35S) loại ddNTP • Khi ddNTP sử dụng phản ứng tổng hợp, phản ứng dừng lại 60 http://themedicalbiochemistrypage.org/molecular-medicine.html#sequencing 61 62 63 Các phương pháp cải biên từ phương pháp Sanger • Để đơn giản hố việc tạo dịng đoạn DNA cần xác định trình tự, plasmid mang hai trình tự chuyên biệt sợi sử dụng • Xác định trình tự máy tự động (automated sequencing) sử dụng flourophore để đánh dấu loại ddNTP • DNA khuếch đại trực tiếp PCR không qua tạo dòng 64 65 Vector pGEM-T Easy Đoạn DNA cần giải trình tự gắn vào plasmid nẳm vùng promoter T7 SP6 www.promega.com 66 67 68 CÁC PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ (Molecular hybridization) 6/2011 69 Cơ sở lai phân tử Nhiệt độ nóng chảy (Tm) DNA Các nhân tố ảnh hưởng đến Tm  Thành phần base  Độ dài  Ảnh hưởng điểm bắt cặp sai lệch  Ảnh hưởng môi trường phản ứng (nồng độ muối formamide) Tm = 16,6 log[M] + 0,41 (%GC) + 81,5 - % mismatch – 675/chiều dài (cặp base) – 0,65 (% formamide) 70 Khái niệm lai phân tử Hai mạch đơn phân tử DNA tách thành sợi đơn tác động nhiệt độ Nếu nhiệt độ phản ứng giảm từ từ điều kiện thích hợp, hai mạch bắt cặp trở lại Hiện tượng gọi lai phân tử 71 Các yếu tố ảnh hưởng đến lai phân tử • Nồng độ DNA thời gian phản ứng Được xem xét đồng thời, tích số nồng độ (concentration) thời gian gọi Cot Cot1/2 giá trị có 50% số phân tử lai • Nhiệt độ Tốc độ phản ứng lai cực đại nhiệt độ thấp Tm phân tử khoảng 25% • Độ dài trình tự Tốc độ lai tỉ lệ thuận với bình phương độ dài trình tự bổ sung • Lực ion Nồng độ NaCl 1M làm tăng tốc độ phản ứng lên từ – 10 lần 72 Lai pha lỏng Phân tích định lượng phân tử lai Quang phổ kế, Sử dụng nuclease S1, Sắc kí hydroxylapatide Lai pha rắn Các phân tử lai định vị kỹ thuật phóng xạ tự ghi Southern blot Northern blot Dot slot blot Lai chỗ (in situ hybridization) Trình tự nucleic acid cần tìm nằm mơ hay tế bào Lai khuẩn lạc Lai nhiễm sắc thể Lai tế bào mô 73