Định tính listeria monocytogenes gây viêm màng não trong sữa bằng phương pháp pcr

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC TIỂU LUẬN MÔN HỌC ĐỊNH TÍNH VI KHUẨN Listeria monocytogenes TRONG SẢN PHẨM TỪ SỮA THÔNG QUA KỸ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

TIỂU LUẬN MÔN HỌC

ĐỊNH TÍNH VI KHUẨN Listeria monocytogenes TRONG SẢN

PHẨM TỪ SỮA THÔNG QUA KỸ THUẬT PCR

Tháng 10/2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

TIỂU LUẬN MÔN HỌC

ĐỊNH TÍNH VI KHUẨN Listeria monocytogenes TRONG SẢN

PHẨM TỪ SỮA THÔNG QUA KỸ THUẬT PCR

TS HUỲNH VĂN BIẾT TRƯƠNG LỆ XUYẾN KIM

NGUYỄN NGỌC ANH THI

NGUYỄN NGỌC NHƯ Ý

Tháng 10/2023

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH ẢNH ii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1. Khái quát về vi khuẩn Listeria monocytogenes 3

2.1.1 Đặc điểm 3

2.1.2 Bệnh Listeriosis 4

2.2 Kỹ thuật PCR 5

2.2.1 Thành phần PCR 6

2.2.2 Chu trình nhiệt 7

2.2.3 Ứng dụng PCR 7

Chương 3 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 8

3.1 Kết luận 8

3.2 Đề nghị 8

TÀI LIỆU THAM KHẢO 9

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 2.1 Listeria monocytogenes, vi khuẩn gram dương 3 Hình 2.2 L monocytogenes nhuộm dưới kính hiển vi 4

Hình 2.3 Các giai đoạn trong kỹ thuật PCR 6

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Tổ chức nông nghiệp và lương thực (FAO) nhấn mạnh sữa là một trong các cách để giúp mọi người thuộc các thành phần dân số đáp ứng đủ nhu cầu cơ thể về Canxi, Magie, Selen, Vitamin B2, B5, B12 (hay axit pantothenic) Sữa cũng là một trong những môi trường dinh dưỡng của nhiều vi sinh vật cả có lợi và gây hại Mặc dù sữa đã được thanh trùng nhưng vi khuẩn vẫn có thể tồn tại Việc sữa không được bảo quản đúng cách hoặc

bị nhiễm sau khi đã thanh trùng sữa do nhà chế biến sữa không đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm sẽ dễ gây ra các vấn đề sức khoẻ Vấn đề sức khoẻ do thực phẩm được Tổ chức Y tế Thế giới định nghĩa là các bệnh thường xảy ra bởi nhiễm trùng hoặc nhiễm độc gan do các tác nhân xâm nhập vào cơ thể thông qua hoạt động an uống Tác nhân gây bệnh bao gồm vi khuẩn, ký sinh trùng, vi rút, chất độc, kim loại và prion (Thomas

và ctv, 2013) Trong đó tác nhân vi khuẩn khá phổ biến và vi khuẩn Listeria

monocytogenes là một tác nhân gây bệnh nghiêm trọng ở người và động vật thông qua

việc tiêu thụ sữa hay các sản phẩm từ sữa không chất lượng Tỷ lệ mắc bệnh sẽ cao hơn

ở nhóm người dễ mắc bệnh như phụ nữ mang thai, trẻ sơ sinh, người lớn trên 65 tuổi và người có hệ thống miễn dịch suy yếu So với các bệnh do tác nhân khác hiện nay thì bệnh Listeriosis tỷ lệ bùng phát rất thấp Mặc dù bệnh Listeriosis không phổ biến ở người nhưng đây là căn bệnh cần quan tâm do mức độ nghiêm trọng và tỷ lệ tử vong

cao Một số báo cáo cho thấy khoảng 20% trường hợp bị nhiễm vi khuẩn Listeria

monocytogenes, từ đó có thể tiến triển thành viêm não - màng não, áp xe não,… với các

di chứng như động kinh, di chứng về vận động, cảm giác, tổn thương dây thần kinh sọ Nếu không được phát hiện và điều trị kịp thời, thì tỷ lượng tử vong cao Bệnh có thể từ nhiễm trùng nhẹ, tại chỗ đến bệnh cảnh xâm lấn như viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết với tổn thương đa cơ quan, trường hợp nặng có thể gây suy đa tạng, tử vong Để phát

hiện kịp thời và hạn chế tác hại của Listeria monocytogenes, việc định tính vi khuẩn trên

trong sản phẩm từ sữa cần được đặt lên hàng đầu

1.2 Mục tiêu đề tài

Định tính vi khuẩn Listeria monocytogenes trong sản phẩm từ sữa thông qua kỹ thuật

PCR Từ đó xác định chất lượng của sản phẩm, nhanh chóng có biện pháp xử lý đối với

các sản phẩm từ sữa bị nhiễm vi khuẩn Listeria monocytogenes

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Khái quát về vi khuẩn Listeria monocytogenes

2.1.1 Đặc điểm

Vi khuẩn Listeria monocytogenes là vi khuẩn gram dương, hình que, không có vỏ bọc,

không hình thành bào tử, tan máu beta, hiếu khí tuỳ tiện, có khả năng di động và

kháng acid Vi khuẩn Listeria monocytogens có nội độc tố gây hoại tử, không tiết

ngoại độc tố Trong tự nhiên, tồn tại khắp nơi trong môi trường như đất, nước, phân, động vật, thực phẩm như rau hỏng, sữa, phô mai, thực phẩm đóng hộp không đảm bảo

vệ sinh Nó còn hiện diện cả trong ruột con người, động vật có vú, chim và động vật giáp xác

Vi khuẩn dễ phát triển ở nhiệt độ từ 1 – 45oC Nhiệt độ tối ưu từ 30-37oC, chết ở nhiệt

độ cao 60oC Nó có khả năng chống chịu tương đối ở điều kiện khắc nghiệt pH khoảng

từ 4,5 – 9, khả năng chịu muối 10% NaCl và tăng trưởng tối ưu ở pH trung tính

khoảng từ 6 - 8

Ngoài ra, vi khuẩn còn nhạy cảm với kháng sinh Trong một số loài Listeria, vi khuẩn

L monocytogenes là mầm bệnh chính ở người

Hình 2.1 Listeria monocytogenes, vi khuẩn gram dương

Hình 2.2 L monocytogenes nhuộm dưới kính hiển vi

2.1.2 Bệnh Listeriosis

Listeria monocytogenes là vi sinh vật gây bệnh Listeriosis, căn bệnh có thể trở nên

nghiêm trọng và gây tử vong cho con người và động vật Ngược lại với hầu hết các mầm

bệnh truyền qua thực phẩm, L monocytogenes sẽ phát triển trong thực phẩm có độ ẩm thấp và khả năng chịu mặn cao Điều đáng chú ý là L monocytogenes phát triển tốt ở nhiệt độ lạnh Khả năng tồn tại và nhân lên trong môi trường thực phẩm này khiến L

monocytogenes đặc biệt khó kiểm soát Theo một cuộc khảo sát khác kéo dài hai năm

được thực hiện, tỷ lệ ô nhiễm cao nhất trong ngành công nghiệp thực phẩm Trung Quốc

là L monocytogenes, với tỷ lệ ô nhiễm khoảng 20% (Shamloo và ctv, 2019) Ngoài ra,

theo CDC ước tính Listeriosis là nguyên nhân đứng thứ 3 gây tử vong do bệnh từ thực phẩm ở Hoa Kỳ, có khoảng 1600 người mắc bệnh hằng năm và khoảng 260 người tử vong Tỷ lệ mắc bệnh cao nhất ở trẻ sơ sinh, người ở độ tuổi 65 tuổi, và ở những bệnh nhân suy giảm miễn dịch Phụ nữ mang thai có nguy cơ nhiễm bệnh cao gấp 24 lần so với những người khác (Ryser, E.T và ctv, 2007) Nó ảnh hưởng trực tiếp đến trẻ sơ sinh Nếu trẻ sơ sinh bị nhiễm bệnh này có thể phát triển các vấn đề sức khỏe nghiêm trọng

Bệnh có thể được chuẩn đoán bằng nuôi cấy vi khuẩn Listeria monocytogenes từ mô cơ

thể hoặc chất lỏng như máu, dịch tuỷ sống hoặc nhau thai Xét nghiệm máu thường hiệu quả nhất để xác định xem người đó có nhiễm khuẩn này hay không Trong một số trường hợp, mẫu nước tiểu hoặc dịch tủy sống cũng sẽ được xét nghiệm Hiện nay, kỹ thuật

Real-time PCR cũng có thể được áp dụng tuy nhiên đây là kỹ thuật mới, yêu cầu thiết

bị hiện đại, công nghệ cao, khó áp dụng rộng rãi trong chẩn đoán nhiễm trùng do Listeria

monocytogenes Việc điều trị đối với bệnh Listeriosis thường dùng các loại kháng sinh

khác nhau để kiểm soát mầm bệnh Một số loại thuốc được sử dụng rộng rãi để điều trị bệnh Listeriosis, chẳng hạn như penicillin, ampicillin, gentamycin, meropenem Điều trị kháng sinh được khuyến cáo càng sớm càng tốt nhằm hạn ché nguy cơ biến chứng Hiện nay chưa có vaccine phòng bệnh đặc hiệu Các biện pháp phòng bệnh không đặc hiệu như thực hiện an toàn thực phẩm, nâng cao kiến thức và hiểu biết, tiếp cận chuẩn đoán

và điều trị kịp thời Việc phân tích các sản phẩm thực phẩm để tìm hiện diện của vi sinh vật gây bệnh là một trong những bước cơ bản để quản lý an toàn thực phẩm, kiểm soát

và giảm thiểu ca bệnh

Các con đường phơi nhiễm với vi khuẩn Listeria monocytogenes

Qua đường tiêu hoá: Vi khuẩn xâm nhập thông qua thực phẩm, nước và nhiễm khuẩn Thực phẩm như thịt nguội và các sản phẩm ăn liền từ thịt (xúc xích, thịt đóng hộp thịt lên men,…), các sản phẩm từ sữa (phô mai) và các sản phẩm cá xông khói dễ phơi nhiễm

với Listeria monocytogenes

Qua nhau thai: Truyền từ mẹ sang con trong quá trình sinh đẻ

2.2 Kỹ thuật PCR

Nguyên lý hoạt động của PCR: việc tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn - một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao thông qua hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA này

Hình 2.3 Các giai đoạn trong kỹ thuật PCR

2.2.1 Thành phần PCR

Dung dịch ADN mẫu (DNA template) chứa đoạn ADN cụ thể đã được tinh sạch để nhân bản

Primers: là các đoạn ADN mồi, thường có độ dài vài chục Kbp, có nhiệm vụ định vị điểm bắt đầu và điểm kết thục của đoạn ADN mẫu

DNA polymerase: là enzyme có nhiệm vụ tổng hợp các đoạn ADN mới là bản sao của trình tự ADN ban đầu Enzyme này có khả năng chịu nhiệt cao và thường sử dụng trong PCR là Taq polymerase

Nucleotides (deoxynucleoside triphosphates; dNTPs): bao gồm 4 loại (A, T, G, C) là các thành phần cơ bản, được xem như những “viên gạch” cấu tạo nên cấu trúc của DNA, DNA polymerase sử dụng các dNTPs để tổng hợp nên các trình tự ADN bản sao Dung dịch đệm (buffer solution): cung cấp môi trường hoạt động cho enzyme DNA polymerase

Ống PCR (PCR tube): là dụng cụ plastic chuyên dụng dùng để phối trộn dung dịch phản ứng PCR trước khi cho vào thiết bị thực hiện PCR (Thermal cycler)

2.2.2 Chu trình nhiệt

1 - Giai đoạn biến tính: Nhiệt độ sẽ được đưa lên 95oC, các liên kết hydro sẽ bị phá vỡ khiến DNA bị biến tính trở thành dạng mạch đơn

2 - Giai đoạn bắt cặp: Nhiệt độ được hạ xuống 50 - 63oC, các đoạn mồi sẽ bắt cặp bổ sung vào 2 đầu trình tự mục tiêu

3 - Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ được đưa lên 72oC, Taq polymerase sẽ sử dụng dNTP

để kéo dài đầu 3' của mồi và tạo ra mạch bổ sung

2.2.3 Ứng dụng PCR

PCR được dùng để khuếch đại một đoạn DNA ngắn, đã xác định được một phần Đó có thể là một gen đơn, hay một phần của gen

PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, như kiểm định an toàn thực phẩm, xác định sinh vật GMO, định danh thịt, kiểm nghiệm nguồn nguyên liệu đầu, phát hiện vi sinh tạp nhiễm gây bệnh, phát hiện các bệnh

di truyền, nhận dạng, tách dòng gene, và xác định huyết thống

Ngoài ra, phương pháp PCR còn được áp dụng trong việc sản xuất các bộ kit chẩn đoán mầm bệnh trong đa dạng lĩnh vực khác bao gồm: Xác định bệnh trên người, thú y, thủy sản, vi sinh thực phẩm, định danh,

Phân tích pháp y: Xác định dấu vân tay di truyền, xét nghiệm DNA, quan hệ huyết thống, điều tra tội phạm

PCR có thể cho cả kết quả định tính và định lượng, nhưng thông thường PCR được sử dụng để cho kết quả định tính: phát hiện hoặc không phát hiện, chỉ một số có thể cho kết quả định lượng Phương pháp kiểm tra nhạy và nhanh Tuy nhiên kết quả tuỳ thuộc trình độ của kỹ thuật viên và máy móc, thiết bị Chi phí thực hiện khá cao

Một phản ứng PCR hoàn chỉnh có thể được thực hiện trong vài giờ, hoặc thậm chí ít hơn một giờ với một số máy tốc độ cao nhất định

Sau khi phản ứng khuếch đại được hoàn thành trong máy luân nhiệt, phương pháp điện

di trên gel agarose có thể được sử dụng để kiểm tra số lượng và kích thước của các đoạn DNA được tạo ra

Chương 3 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

3.1 Kết luận

Listeria là một trong những tác nhân truyền nhiễm thực phẩm quan trọng có ảnh hưởng quan trọng đến sức khỏe cộng đồng và kinh tế Dân số ngày càng tăng để đáo ứng nhu cầu lượng thực, thực phẩm, nhà máy sản xuất thực phẩm mở ra càng nhiều với quy mô lớn Vì thế, an toàn thực phẩm là điều hết sức cần thiết trong toàn bộ chuỗi sản xuất thực phẩm để đảm bảo sức khoẻ cộng đồng và phòng ngừa bệnh Listeria Trong số các bệnh lây truyền qua thực phẩm, bệnh ít được chú ý nhất là bệnh Listeriosis mặc dù căn bệnh

nguy hiểm với tỷ lệ tử vong cao Tác nhân gây bệnh Listeria monocytogenes có thể tồn

tại ở môi trường khắc nghiệt và nguy hiểm đối với sức khỏe con người Để kiểm soát sự lây nhiễm, cần quan tâm các điều kiện vệ sinh an toàn thực phẩm nhằm mục đích ngăn

chặn sự xâm nhiễm và nhân lên của Listeria monocytogenes trong sữa và các loại thực

phẩm khác

3.2 Đề nghị

Sản phẩm hậu PCR có thể tạo dòng thuần của chủng vi khuẩn gây bệnh làm tiền đề cho

các nghiên cứu có ứng dụng liên quan đến độc tính chủng vi khuẩn Listeria

monocytogenes trong các điều kiện môi trường khác

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Shamloo E., Hosseini H., Abdi Moghadam Z., Halberg Larsen M., Haslberger A., and M Alebouyeh 2019 Importance of Listeria monocytogenes in food safety: a

review of its prevalence, detection, and antibiotic resistance Iran J Vet Res, 20(4),

241-254

2 Thomas M K., Murray R., Flockhart L., Pintar K., Pollari F., Fazil A., Nesbitt A., and B Marshall 2013 Estimates of the burden of foodborne illness in Canada for

30 specified pathogens and unspecified agents, circa 2006 Foodborne Pathog Dis,

10(7), 639-648 https://doi.org/10.1089/fpd.2012.1389

3 Ryser E.T., Ryser E.T., and E.H Marth 2007 Listeria, Listeriosis, and Food Safety

(3rd ed.) CRC Press https://doi.org/10.1201/9781420015188