Xây dựng phương pháp định lượng một số hoạt chất kháng HIV trong thuốc bằng phương pháp điện di mao quản

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ THÙY LINH XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HOẠT CHẤT KHÁNG HIV TRONG THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ THÙY LINH XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HOẠT CHẤT KHÁNG HIV TRONG THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 604429 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS NGUYỄN VĂN RI Hà Nội – Năm 2012 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG - TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu thuốc điều trị HIV 1.2 Tình hình sử dụng thuốc HIV Việt Nam giới 1.3 Các phƣơng pháp phân tích định lƣợng thuốc HIV 1.3.1.Các phƣơng pháp sắc ký 1.3.2.Phƣơng pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis-CE) 1.4 Giới thiệu chung phƣơng pháp điện di mao quản 1.4.1 Nguyên tắc phƣơng pháp điện di mao quản .9 1.4.2 Thiết bị phƣơng pháp điện di mao quản 10 1.4.3 Các trình xảy mao quản .11 1.4.4 Sự phân loại hay kiểu (mode) phƣơng pháp điện di mao quản 12 1.4.5 Điện di mao quản vùng (CZE) .12 1.4.6 Phƣơng pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) 13 1.4.7 Phân tích định lƣợng theo điện di mao quản 23 CHƢƠNG - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 24 2.1.1 Điều kiện nghiên cứu 24 2.1.2 Đối tƣợng nghiên cứu 25 2.2 Nội dung phƣơng pháp nghiên cứu 26 2.2.1 Nội dung nghiên cứu .26 2.2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu .26 CHƢƠNG - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Nghiên cứu khảo sát tối ƣu điều kiện tách 3TC,NVP AZT 29 3.1.1 Chọn bƣớc sóng phát chất 29 3.1.2 Mao quản xử lý mao quản 31 3.1.3 Chọn phƣơng pháp bơm mẫu 32 3.1.4 Độ điện di độ điện di hiệu dụng .33 3.1.5 Lựa chọn chế tách 34 3.1.6 Ảnh hƣởng pH dung dịch đệm điện di 36 3.1.7 Ảnh hƣởng thành phần dung dịch đệm 39 3.1.8 Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ chất tạo mixen SDS 39 3.1.9 Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ đệm 41 3.1.10 Khảo sát ảnh hƣởng thời gian bơm mẫu .43 3.1.11 Khảo sát ảnh hƣởng điện di 45 3.1.12 Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ mao quản 46 3.1.13.Tổng kết điều kiện tối ƣu 47 3.1.14 Định tính 3TC, AZT NVP điều kiện điện di thiết lập 47 3.2 Đánh giá phƣơng pháp phân tích 50 3.2.1 Khảo sát tính tƣơng thích hệ thống .50 3.2.2 Tính đặc hiệu 50 3.2.3 Khảo sát khoảng tuyến tính lập đƣờng chuẩn 52 3.2.4 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lƣợng (LOQ) 56 3.2.5 Độ lặp lại phƣơng pháp 57 3.2.6 Độ phƣơng pháp 58 3.2.7 Kết định lƣợng chế phẩm 61 3.3 Ƣu nhƣợc điểm phƣơng pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) 63 3.4 Hƣớng phát triển đề tài 64 KẾT LUẬN .65 DANH MỤC CÁC BẢNG STT bảng Tên bảng Trang 1.1 Các chất hoạt động bề mặt dùng MEKC 19 3.1 Tổng kết điều kiện điện di tối ƣu 47 3.2 Kết khảo sát tính tƣơng thích hệ thống 49 3.3 Diện tích pic điện di đồ nồng độ 3TC tƣơng ứng 52 3.4 Diện tích pic điện di đồ nồng độ AZT tƣơng ứng 54 3.5 Diện tích pic điện di đồ nồng độ NVP tƣơng ứng 55 3.6 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lƣợng (LOQ) 57 Kết xác định độ lặp lại MEKC định lƣợng 3TC Kết xác định độ lặp lại MEKC định lƣợng AZT Kết xác định độ lặp lại MEKC định lƣợng NVP Kết khảo sát độ phƣơng pháp thêm chuẩn 3TC Kết khảo sát độ phƣơng pháp thêm chuẩn AZT Kết khảo sát độ phƣơng pháp thêm chuẩn NVP 57 3.13 Kết định lƣợng viên nén Avocomb-N 61 3.14 Kết định lƣợng viên nén Lamivudine 150mg & Zidovudine 300mg 62 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12 58 58 59 60 60 DANH MỤC CÁC HÌNH Tên hình STT Trang 1.1 Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo hệ điện di mao quản 11 1.2 Quá trình tách chất CZE 13 1.3 Cấu trúc Mixen dịng EOF MEKC 15 1.4 Cấu trúc khơng gian β- cyclodextrin 20 1.5 Cấu trúc không gian phân tử α-CD, β- CD, γ- CD 21 1.6 Cấu trúc phân tử phân tử α-CD, β- CD, γ- CD 22 3.1 Phổ hấp thụ 3TC, AZT NVP 31 3.2 Khảo sát chế tách CZE, MEKC 35 3.3 Điện di đồ pH 8,76; 9,06; 9,30; 9,62; 10,17 37 3.4 Điện di đồ nồng độ SDS 25mM; 50mM 75mM 40 3.5 Điện di đồ nồng độ đệm 5mM; 10mM 20mM 42 3.6 Điện di đồ thời gian bơm mẫu 3s, 5s 7s 44 3.7 Điện di đồ điện di 15kV; 20kV 22 kV 46 3.8 Điện di đồ 3TC, AZT NVP điều kiện tối ƣu 48 Điện di đồ chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT NVP điều kiện tối ƣu Điện di đồ chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT NVP sau thêm 3TC điều kiện tối ƣu Điện di đồ chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT NVP sau thêm AZT điều kiện tối ƣu Điện di đồ chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT NVP sau thêm NVP điều kiện tối ƣu 48 3.13 Điện di đồ mẫu trắng 51 3.14 Điện di đồ chuẩn hỗn hợp 3TC, AZT NVP 51 3.9 3.10 3.11 3.12 49 49 49 Điện di đồ chế phẩm làm việc 3TC, AZT NVP 51 Điện di đồ chế phẩm làm việc 3TC, AZT NVP thêm hỗn hợp chuẩn Đƣờng chuẩn biểu thị quan hệ Diện tích pic nồng độ 3TC Đƣờng chuẩn biểu thị quan hệ Diện tích pic nồng độ AZT Đƣờng chuẩn biểu thị quan hệ Diện tích pic nồng độ NVP 52 3.20 Điện di đồ viên nén Avocomb-N 62 3.21 Điện di đồ viên nén Lamivudine 150mg & Zidovudine 300mg 63 3.15 3.16 3.17 3.18 3.19 53 54 55 DANH MỤC VIẾT TẮT ARV Virus gây suy giảm miễn dịch ngƣời (Human Immunodeficiency Virus) Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ngƣời (Acquired immunodeficiency syndrome) Thuốc kháng virut USP Dƣợc điển Mỹ (United State Pharmacopiea) CE Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis) HIV AIDS CEC Điện sắc ký mao quản (Capillary Electrochromatography) CGE Điện di mao quản gel (Capillary Gel Electrophoresis) CZE Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis) DAD Detector mảng diod (Diod Array Detector) EOF Spic Dòng điện thẩm (Electro- osmotic Flow) Sắc kí lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) Sắc ký điện động micell (Micellar Electrokinetic chromatography) Diện tích pic tm Thời gian di chuyển (Migration times) SD Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) HPLC MEKC RSD % Độ lệch chuẩn tƣơng đối (Relative Standard Deviation) STT Số thứ tự AZT Zidovudine LOD Giới hạn phát (Limit of Detection) LOQ Giới hạn định lƣợng (Limit of Quantity) NVP Nevirapine D4T Stavudine 3TC Lamivudine MỞ ĐẦU Theo phân tích chuyên gia, tổng số ngƣời nhiễm HIV tiếp tục trì sống ngày đƣợc tăng cao hệ hai tác động chủ yếu Một số ngƣời nhiễm HIV hàng năm toàn cầu mức cao Chỉ tính riêng năm 2008, giới có khoảng 2,7 triệu ngƣời nhiễm HIV Hai kết tích cực liệu pháp điều trị kháng virut (ARV) làm giảm số ngƣời tử vong, kéo dài sống cho ngƣời bệnh Đến tháng 12/2008 ƣớc tính khoảng triệu ngƣời nhiễm HIV nƣớc có thu nhập thấp trung bình đƣợc điều trị thuốc kháng HIV, tăng lên 10 lần vòng năm Trong vịng năm (2004- 2008) nhờ chăm sóc điều trị tốt, số ngƣời chết AIDS giảm 10% [12] HIV/AIDS vấn đề lớn giới nhƣ Việt Nam Ở nƣớc ta Thành Phố Hồ Chí Minh nơi có nhiều ca nhiễm HIV/AIDS (Sau Hội An, An Giang, Hải Phịng, Quảng Ninh, ) Chúng ta khơng ngăn chặn lây lan bệnh mà điều trị hiệu để giảm nguy tử vong kéo dài cải thiện chất lƣợng sống cho ngƣời HIV/AIDS Trong điều trị kháng Retrovirut đóng vai trị lớn Trƣớc nƣớc ta chƣa đầy đủ loại thuốc Retrovirut nên thƣờng dùng đơn hóa phối hợp hai loại thuốc điều trị HIV/AIDS Giờ kết hợp loại thuốc trƣờng hợp lâm sàng nặng Hiện nay, nƣớc ta sản xuất đƣợc thuốc chống HIV Lamididrir (Lamivudine 150mg + Zidovudine 300mg) Tuy nhiên phần lớn sử dụng thuốc kháng HIV theo chƣơng trình quốc gia đƣợc cấp [12] Để đảm bảo điều trị, an toàn sử dụng, việc quản lý chất lƣợng thuốc kháng HIV cần thiết Vì cần có phƣơng pháp phân tích có độ tin cậy cao, nhanh nhằm đáp ứng yêu cầu kiểm soát tốt chất lƣợng thuốc HIV Cho tới sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) phƣơng pháp phân tích hóa lý đa số đƣợc sử dụng để định lƣợng loại thuốc Ƣu điểm phƣơng pháp độ lặp lại, độ xác khả tách tốt Đồng thời thiết bị HPLC đƣợc tích hợp với hầu hết kỹ thuật hóa lý có (phổ UV-VIS, phân tích điện hóa, MS, NMR,…) cho phép nâng cao độ nhạy hạ thấp giới hạn phát phƣơng pháp Tuy vậy, phƣơng pháp HPLC đòi hỏi sử dụng dung mơi có độ tinh khiết cao, đắt tiền, có nhiều loại gây ảnh hƣởng xấu, gây nhiễm mơi trƣờng Đó xuất phát điểm việc lựa chọn phát triển phƣơng pháp định lƣợng thuốc dựa kỹ thuật hóa lý khác thay cho HPLC mà thực nghiên cứu Kỹ thuật tách mà lựa chọn làm sở cho nghiên cứu điện di mao quản (CE) [15] CE phƣơng pháp đƣợc phát triển, nhiên có nhiều ƣu điểm vƣợt trội hiệu lực tách cao, kinh tế đặc biệt thời gian phân tích nhanh đáp ứng khơng cho phân tích phịng thí nghiệm mà cịn phục vụ cho phân tích lâm sàng sản xuất Vì kỹ thuật hữu hiệu để thay hay hỗ trợ HPLC nhiều lĩnh vực phân tích, có nghiên cứu Dƣợc Hơn nữa, chuyên luận chung CE đƣợc quy định Dƣợc điển số nƣớc nhƣ Hoa Kỳ, Anh, Trung Quốc…Tuy nhiên Việt Nam, CE chƣa đƣợc ứng dụng nhiều kinh nghiệm ứng dụng phân tích dƣợc phẩm cịn hạn chế Do chúng tơi nhận định hƣớng nghiên cứu có ý nghĩa thực tiễn cho công tác nghiên cứu quản lý chất lƣợng thuốc nƣớc ta Từ phân tích trên, tiến hành nghiên cứu ứng dụng phƣơng pháp điện di mao quản vào định lƣợng thuốc kháng HIV với đề tài: “Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng số hoạt chất kháng HIV thuốc phƣơng pháp điện di mao quản” kết phƣơng trình hồi quy (chuẩn F)