Bài viết Chẩn đoán nhanh virus SCV (Strawberry crinkle virus) trên cây dâu tây (Fragaria spp.) bằng phương pháp RT-PCR được nghiên cứu nhằm xác định được các cây dâu tây sạch virus SCV, làm nguồn nguyên liệu phục vụ cho công tác nhân giống dâu tây sạch bệnh virus cung cấp cho các vùng trồng dâu tây, góp phần nâng cao năng suất và chất lượng quả dâu tây, đồng thời giới thiệu quy trình chẩn đoán nhanh virus bằng phương pháp RT-PCR phục vụ cho công tác chẩn đoán bệnh virus gây hại cho cây dâu tây và cho các loại cây trồng khác.
Chuyên san Phát triển Khoa học và Công nghệ số (1), 2022 CHẨN ĐOÁN NHANH VIRUS SCV (STRAWBERRY CRINKLE VIRUS) TRÊN CÂY DÂU TÂY (FRAGARIA SPP.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP RT-PCR Hà Thị Tuyết Phượng Khoa Nông nghiệp Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Tiền Giang *Tác giả liên hệ: hathituyetphuong@tgu.edu.vn TÓM TẮT Cây dâu tây mang lại hiệu kinh tế cao ổn định Quả dâu tây có lợi cho sức khỏe người Virus SCV (Strawberry Crinkle Virus) gây bệnh xoắn dâu tây, bệnh virus nghiêm trọng cho dâu tây Virus SCV lan truyền nhanh qua môi giới truyền bệnh Khi bị nhiễm bệnh, khó phát giai đoạn sớm, biểu triệu chứng bệnh khơng thể khắc phục Nghiên cứu thực nhằm xác định dâu tây virus SCV, làm nguồn nguyên liệu phục vụ cho công tác nhân giống dâu tây bệnh virus cung cấp cho vùng trồng dâu tây, góp phần nâng cao suất chất lượng dâu tây, đồng thời giới thiệu quy trình chẩn đoán nhanh virus phương pháp RT-PCR phục vụ cho cơng tác chẩn đốn bệnh virus gây hại cho dâu tây cho loại trồng khác Kết chẩn đoán virus SCV dâu tây in vitro sau trồng vườn ươm 45 ngày giống đâu tây Mỹ Đá, Mỹ Hương dâu Pháp phương pháp RT-PCR ghi nhận 100% mẫu virus Phương pháp RT-PCR phương pháp chẩn đoán nhanh đặc hiệu bệnh virus hại thực vật Từ khóa: Cây dâu tây, SCV (Strawberry Crinkle Virus), chẩn đoán, phương pháp RT-PCR RAPID DIAGNOSIS OF SCV (STRAWBERRY CRINKLE VIRUS) ON STRAWBERRY (FRAGARIA SPP.) BY RT-PCR METHOD Ha Thi Tuyet Phuong Faculty of Agriculture and Food Technology, Tien Giang University * Corresponding Author: hathituyetphuong@tgu.edu.vn ABSTRACT The strawberries has bring high economic and stability for farmers Moreover, with more nutrients and vitamins, it is also bring a good health for customers The strawberry Crinkle Virus (SCV), causing a leaf curl disease on strawberries, is the most serious virus that infects this crop The SCV virus has been spreading rapidly by vectors, which are commonly on the strawberries farm When infected, it is difficult to detect at early stage, until occurring typical symptoms, it is impossible to recover This research has was used to verify the SCV on seedlings, serving as a source of source material for the authors propagating virus-free strawberry varieties to supply a good seedling for growing areas to help improving the yield and quality of strawberries In addition, has been introducing a rapid virus diagnostic process by RT-PCR method to early detecting of virus diseases on strawberry and other crops Resulted of SCV testing on invitro strawberries after been growing in the garden for 45 days of three varieties of My Da, My Huong and French strawberries by RT-PCR method, has received 100% virus clean The RT-PCR is a fast and accusative method for almost viral disease on crops detecting Keywords: Strawberry, SCV (Strawberry Crinkle Virus), diagnosis, RT-PCR method MỞ ĐẦU Cây dâu tây (Fragaria spp.) loại ăn giàu dinh dưỡng, có lợi cho sức khỏe người Quả dâu tây cung cấp nhiều loại chất khoáng Ca, K, P, Mg, Fe và nhiều vitamin cần thiết cho thể người vitamin A, vitamin B và vitamin C [1] Bên cạnh đó, dâu tây cịn có chất fisetin, có tác dụng chớng oxy hóa, giúp bảo vệ tế bào khỏi bị lão hóa Quả 49 Chuyên san Phát triển Khoa học và Công nghệ số (1), 2022 dâu tây nguồn cung cấp ellagic acid, chất có khả hạn chế bệnh ung thư [2] Cây dâu tây mang lại hiệu kinh tế cao ổn định Sản phẩm sử dụng từ dâu tây đa dạng Ngoài việc sử dụng dạng tươi, dâu tây dùng làm rượu vang, mứt, loại kem, sữu tươi tiệt trùng, tạo hương thơm cho các loại bánh mứt Do đó, nhu cầu tiêu thụ dâu tây ngày càng gia tăng Cây dâu tây thường nhân giớng truyền thớng cách tách thân bị tách từ thân Phương pháp nhân giớng cho hệ số nhân giống không cao, dễ bị nhiễm số bệnh từ mẹ, đặc biệt bệnh virus Trong năm gần đây, dâu tây nhân giống phương pháp nuôi cấy mô So với phương pháp nhân giống truyền thống, phương pháp ni cấy mơ có ưu điểm vượt trội hệ sớ nhân giớng cao, sử dụng nguồn mẫu ban đầu Việc sản xuất giống virus là khâu ngành trồng dâu tây [3] Do đó, việc chọn lọc giống dâu tây bệnh làm nguồn mẫu phục vụ cho công tác nhân giống dâu tây cần thiết Virus SCV (Strawberry Crinkle Virus) gây bệnh xoắn dâu tây, bệnh virus nghiêm trọng cho dâu tây [4] Virus SCV có genome RNA sợi đơn, lan truyền nhanh qua môi giới truyền bệnh Khi bị nhiễm bệnh, khó phát hiện giai đoạn sớm, biểu hiện triệu chứng bệnh khơng thể khắc phục Hiện nay, có nhiều phương pháp phát hiện virus trồng Phương pháp ELISA (enzymelinkled-immunosorbent assays), phương pháp này thực hiện khá đơn giản, cho kết nhanh Tuy nhiên trường hợp nồng độ virus tế bào thấp (vài chục pg) phương pháp này cho kết xác [5] Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) cho phép chẩn đoán các bệnh virus hại thực vật nhanh, nhạy và đặc hiệu Phương pháp PCR áp dụng trực tiếp để chẩn đoán các bệnh virus hại thực vật có genome dạng DNA Đới với bệnh virus gây hại thực vật có genome dạng RNA chẩn đoán phương pháp RT-PCR [6] Phương pháp RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction), gọi PCR phục vụ phiên mã ngược Phương pháp RT-PCR dùng để khuếch đại DNA bổ sung (cDNA) nhờ enzyme Reverse trancriptase Phân tử RNA chuyển mã ngược (reverse transcription) thành cDNA trước thực hiện phương pháp PCR thông thường [7] Trong canh tác dâu tây, việc chấn đoán nhanh virus SCV dâu tây phương pháp RT-PCR cần thiết giúp loại bỏ sớm giống dâu tây nhiễm bệnh virus SCV đồng ruộng bị nhiễm bệnh, khó phát hiện giai đoạn sớm có biểu hiện triệu chứng bệnh khơng thể khắc phục Chính vậy, nghiên cứu này thực hiện nhằm chọn dâu tây virus SCV, làm nguồn nguyên liệu phục vụ cho công tác nhân giống dâu tây bệnh virus cung cấp cho vùng trồng dâu tây, góp phần nâng cao suất chất lượng trái dâu tây Đồng thời giới thiệu quy trình chẩn đoán nhanh virus phương pháp RT-PCR phục vụ cho công tác chẩn đoán bệnh virus gây hại cho dâu tây cho loại trồng khác VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Cây dâu tây in vitro sau trồng ngoài vườn ươm 45 ngày tuổi thuộc giống dâu gồm dâu Mỹ Đá, dâu Mỹ Hương và dâu Pháp cần chẩn đoán virus SCV Cây dâu tây Mỹ Đá nhiễm virus SCV sử dụng làm đối chứng dương Vật liệu nghiên cứu cung cấp phịng Sinh học Phân tử Chọn tạo Giớng trồng Viện Sinh học Tây Nguyên 2.2 Phương pháp 2.2.1 Bố trí thí nghiệm Chẩn đoán virus SCV dâu tây in vitro sau trồng ngoài vườn ươm 45 ngày giống dâu tây Mỹ Đá, Mỹ Hương và Dâu Pháp phương pháp RT-PCR Thí nghiệm bớ trí hồn tồn ngẫu nhiên yếu tố, nghiệm thức (3 giống dâu tây), lần lặp lại Mỗi lần lặp lại kiểm tra 10 cây, giống dâu kiểm tra 30 2.2.2 Các bước thực chẩn đoán virus SCV dâu tây 2.2.2.1 Ly trích RNA 50 Chuyên san Phát triển Khoa học và Công nghệ số (1), 2022 Ly trích RNA thực theo quy trình theo kit AccPrep® Viral RNA Extraction cơng ty Bioneer Ly trích RNA thực điều kiện vơ trùng, phịng lab có nhiều RNase tự do, nên trước ly trích dụng cụ xử lý DEPC-water, khử trùng 121oC 20 phút, sấy khô 60oC ngày đêm, mặc áo blouse, mang trang, găng tay để bảo vệ mẫu RNA tinh khiết Bước 1: Cho 100 mg mẫu dâu tây vào cối có sẵn nito lỏng, nghiền mẫu thành bột mịn Bước 2: Cho mẫu nghiền vào eppendorf 1,5 ml Bước 3: Bổ sung 400 µl VB buffer (có chứa poly A hồ tan DEPC-DW) vào eppendporf, trộn nhẹ vortex 30 giây Bước 4: Ủ eppendorf nhiệt độ 30oC 10 phút Bước 5: Bổ sung 100 µl isopropanol, trộn nhẹ vortex giây, lắc đảo khoảng 10 giây Bước 6: Cho cột kéo vào tube ml Chuyển chất lỏng vào cột kéo Bước 7: Đóng nắp tube cẩn thận, ly tâm 8.000 vịng/phút 4oC phút Có thể ly tâm nhiều lần chất lỏng tách khỏi cột kéo hoàn toàn Bước 8: Sau ly tâm, chuyển cột kéo vào tube ml Bước 9: Bổ sung 500 µl W1 buffer (W1 buffer bổ sung 30 ml ethanol) vào cột kéo Đậy nắp tube cẩn thận, ly tâm 8.000 vòng/phút 4oC, phút Bước 10: Sau ly tâm, chuyển cột kéo vào tube ml Bước 11: Bổ sung 500 µl W2 buffer (W2 buffer bổ sung 80 ml ethanol) vào cột kéo Đậy nắp tube cẩn thận, ly tâm 8.000 vòng/phút 4oC, phút Bước 12: Ly tâm 13.000 vòng/phút 4oC phút để loại bỏ ethanol khỏi cột kéo hoàn toàn Đảm bảo khơng cịn giọt ethanol dính đáy cột kéo Bước 13: Sau ly tâm, chuyển cột kéo vào tube 1,5 ml Bổ sung 50 µl EL buffer (EL buffer làm nóng 60oC) vào cột kéo, để yên phút Bước 14: Tách RNA khỏi cột kéo qua ly tâm 8.000 vòng/phút 4oC, phút Bước 15: Lưu trữ RNA 4oC đến (- 20)oC 2.2.2.2 Tổng hợp cDNA Tổng hợp cDNA thực hiện theo kit RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis công ty Fermentas gồm các bước sau: Bước 1: Chuẩn bị tube 0,5 ml ủ lạnh đá bọt bổ sung theo thứ tự: µl RNA mẫu µl oligo (dT)18 primer (0,5 µg/µl) DEPC-treated water để đạt thể tích tube 12 µl Trộn nhẹ cách ly tâm 8.000 vòng/phút 4oC giây Bước 2: Ủ hỗn hợp 70oC phút Sau ủ tube đá bọt, thực hiện ly tâm 8.000 vòng/phút 4oC giây Bước 3: Ủ tube đá bọt bổ sung thành phần sau theo thứ tự: µl 5x reaction buffer µl ribolockTM ribonuclease inhibitor (20 u/µl) µl 10 mM dNTP mix Trộn nhẹ, ly tâm 8.000 vòng/phút 4oC giây Bước 4: Ủ hỗn hợp 37oC phút Bước 5: Bổ sung 1µl revertAidTM M-MuLV reverse transcriptase (200 u/µl), để đạt thể tích ći tube 20 µl Bước 6: Ủ hỗn hợp 42oC 60 phút Bước 7: Ngừng phản ứng cách ủ hỗn hợp 70oC 10 phút Bước 8: Tồn trữ cDNA 4oC đến (- 20)oC 2.2.2.3 Khuyếch đại cDNA phản ứng PCR Thành phần hóa chất để thực hiện phản ứng PCR trình bày Bảng 51 Chuyên san Phát triển Khoa học và Công nghệ số (1), 2022 Bảng Thành phần hóa chất để thực hiện phản ứng PCR Thành phần Nồng độ PCR buffer 1X MgCl2 1,5 mM dNTP 200 µM Taq DNA polymerase 1U Mồi xuôi 200 nM Mồi ngược 200 nM cDNA µl DEPC – water Tổng thể tích 50,0 µl Trình tự mồi xi: 5’ - TTCAGGACCTATTTGATGACA - 3’ Trình tự mồi ngược: 5’ - CATTGGTGGCAGACCCATCA - 3’ Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR sau: Bước 95oC – phút chu kỳ o Bước 95 C – 30 giây Bước 58oC – 30 giây 40 chu kỳ o Bước 68 C – phút Bước 68oC – phút chu kỳ Sản phẩm PCR tồn trữ tủ lạnh 4oC đến (- 20)oC 2.2.2.4 Điện di sản phẩm PCR Cho 0,3 g agarose 15 ml 0,5x TBE buffer vào bình tam giác Đun sơi dung dịch phút cho agarose tan hoàn toàn Để gel nguội 65oC, đặt lược vào khay, đổ gel vào khay cẩn thận tránh bọt khí Để gel nguội khoảng 1giờ Lấy lược cẩn thận tránh bể gel, hư giếng, ngâm ngập khoảng 1cm 0,5x TBE buffer Hút 5µl sản phẩm PCR trộn với µl loading dye giấy parafin Bơm cẩn thận hỗn hợp vào giếng Điện di với giếng thang chuẩn (DNA có kích thước 1500 bp), giếng đới chứng dương, giếng đới chứng âm (nước cất vô trùng) Chạy điện di hiệu điện 100 V 60 phút Lấy gel ngâm dung dịch ethidium bromide (0,1%) 0,5x TBE buffer 20 phút Rửa gel nước sau đặt vào máy chụp gel, xem kết phần mềm Quantity one 200 2.2.2.5 Xác định kết dự kiến Mẫu nhiễm virus SCV xuất hiện băng có kích thước 345 bp giếng tương ứng 2.2.3 Chỉ tiêu theo dõi Tỷ lệ (%) mẫu nhiễm virus SCV giống dâu tây thí nghiệm 2.2.4 Xử lý số liệu Sớ liệu thu từ thí nghiệm phân tích phần mềm MSTATC Dựa vào giá trị Prob bảng ANOVA để định trắc nghiệm hay khơng, có, dùng trắc nghiệm Duncan mức 0,05 để đánh giá kết thí nghiệm KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết thí nghiệm cho thấy mẫu dâu tây ba giống thể hiện kết âm tính, chứng tỏ khơng có hiện diện virus SCV Tỷ lệ dâu tây virus SCV ba giống Mỹ Đá, Mỹ Hương và Dâu Pháp đạt 100% (Bảng 2, Hình 1) 52 Chuyên san Phát triển Khoa học và Công nghệ số (1), 2022 Bảng Tỷ lệ dâu tây virus SCV Giống Dâu Mỹ Đá Dâu Mỹ Hương Dâu Pháp F Tỷ Lệ Mẫu Sạch Virus (%) 100,00 100,00 100,00 ns 345bp 150 500bp 0bp Hình Kết kiểm tra virus SCV dâu tây ngoài vườn ươm Giếng 1: Thang chuẩn 1500 bp; 2: Đối chứng dương; 6: Đối chứng âm; Giếng 3: Mẫu dâu Mỹ Đá; 4: Mẫu dâu Mỹ Hương; 5: Mẫu dâu Pháp Cây dâu tây virus SCV ba giống dâu tây tiếp tục chăm sóc vườn ươm Các dâu tây vừa nguồn nguyên liệu cho trình nhân giớng, vừa góp phần cung cấp nguồn giớng virus, sinh trưởng tốt cho vùng trồng dâu tây Đồng thời, dâu tây virus nguồn nguyên liệu cho nghiên cứu dâu tây Ngoài nhân giống phương pháp nuôi cấy mô, dâu tây thường nhân giớng cách tách thân bị, tách từ thân Với phương pháp nhân giớng này, dễ bị nhiễm bệnh từ mẹ, đặc biệt bệnh virus Bệnh virus lan truyền nhanh qua môi giới truyền bệnh Khi bị nhiễm bệnh, khó phát hiện giai đoạn sớm, biểu hiện triệu chứng khó khắc phục Chính vậy, để giảm rủi ro sản xuất dâu tây, cần kiểm tra cách nghiêm ngặt để đảm bảo tính bệnh virus dâu tây vườn ươm RT-PCR là phương pháp cho phép chẩn đoán các bệnh virus hại thực vật có genome dạng RNA Phân tử RNA chuyển mã ngược thành cDNA trước thực hiện phản ứng PCR thông thường [7] Một số nghiên cứu sử dụng phương pháp RT-PCR để chẩn đoán bệnh virus gây hại trồng Ứng dụng phương pháp RT-PCR chẩn đoán virus gây bệnh khảm vàng CYMV bệnh đớm vịng ORSV hoa lan Dendrobium Phalaenopsis Kết nghiên cứu cho thấy có xuất hiện đồng thời virus gây bệnh khảm vàng CYMV bệnh đớm vịng ORSV hoa lan Dendrobium Phalaenopsis thu thập từ các vườn lan invitro từ phịng thí nghiệm [8] Kiểm tra tính bệnh virus PMWaV (Pineapple mealybug wilt-associated virus) dứa Cayenne (Ananas comosus L.) in vitro sinh trưởng điều kiện vườn ươm kỹ thuật RT-PCR Kết ghi nhận 100% mẫu virus [9] Kết chẩn đoán virus SCV dâu tây in vitro sau trồng ngoài vườn ươm 45 ngày giống đâu tây Mỹ đá, Mỹ hương và dâu Pháp phương pháp RT-PCR ghi nhận 100% mẫu virus Phương pháp RT-PCR là phương pháp đáng tin cậy, cho phép chẩn đoán nhanh và đặc hiệu bệnh virus hại thực vật 53 Chuyên san Phát triển Khoa học và Công nghệ sớ (1), 2022 a b c Hình Cây dâu tây dùng test virus SCV (a: Dâu Mỹ Đá; b: Dâu Mỹ Hương; c: Dâu Pháp) ươm Hình Cây dâu tây virus SCV tiếp tục chăm sóc vườn TÀI LIỆU THAM KHẢO Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xn Chương, Nguyễn Thượng Đơng, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Toàn ((2004) Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, Việt Nam 618-619 Kjersti A., Dag E and Grete S (2007) Characterization of Phenolic Compounds in Strawberry (Fragaria x annassa) Fruits by Different HPLC Detectors and Contribution of Individual Compounds to Total Antioxidant Capacity, Department of Chemistry, Biotechnology and Food Science, Norwegian University of Life sciences: Norway 4395-4406 Trần Văn Minh (1997) Công nghệ tế bào thực vật: Giáo trình cao học nghiên cứu sinh 488 Maas J.L (1998) Compendium of Strawberry diseases, Department of Agriculture Beltsville, Maryland, USA 1-3 Hu, J S, Ferreira, S., Wang, M (1993) Detection of cymbidium mosaic virus, odontoglossum ringspot virus, tomato spotted wilt virus, and potyviruses infecting orchids in Hawaii, Plant Dis 77 464-468 Naidu R.A and Hughes A (2002) Methods for the detection of plant virus diseases, Department of plant pathology, The University of Georgia, Athens, USA 1233-260 Nguyễn Thị Lang Bùi Chí Bửu (2005) Sinh học phân tử: Giới thiệu phương pháp ứng dụng, Nhà xuất Nông nghiệp 87-95 Nguyễn Ngọc Huỳnh, Nguyễn Duy, Hồng Ngọc Trâm, Phạm Thị Mỹ Hạnh, Lý Phương Loan, Bùi Thị Thu Ngân (2007) Ứng dụng phương pháp RT-PCR chẩn đoán virus gây bệnh khảm vàng CYMV bệnh đốm vòng ORSV hoa lan Dendrobium Phalaenopsis, Hội nghị khoa học Công nghệ sinh học thực vật công tác nhân giống chọn tạo giống hoa, Nhà xuất Nơng nghiệp TP Hồ Chí Minh 231-240 Trương Bùi Nguyệt Hảo.(2006).Nghiên cứu tạo dứa Cayenne (Ananas comosus (L.) Merr) virus PMWaV (Pineapple Mealybug Wilt associated Virus) phương pháp xử lý nhiệt kết hợp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp, Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh, Việt Nam 54 ... dâu tây bệnh làm nguồn mẫu phục vụ cho công tác nhân giống dâu tây cần thiết Virus SCV (Strawberry Crinkle Virus) gây bệnh xoắn dâu tây, bệnh virus nghiêm trọng cho dâu tây [4] Virus SCV. .. thông thường [7] Trong canh tác dâu tây, việc chấn đoán nhanh virus SCV dâu tây phương pháp RT-PCR cần thiết giúp loại bỏ sớm giống dâu tây nhiễm bệnh virus SCV đồng ruộng bị nhiễm bệnh,... trình chẩn đoán nhanh virus phương pháp RT-PCR phục vụ cho công tác chẩn đoán bệnh virus gây hại cho dâu tây cho loại trồng khác VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Cây dâu tây