Nghiên cứu biểu hiện tạm thời của kháng nguyên GP5 của virus gây bệnh lợn tai xanh trong cây thuốc lá nicotiana benthamiana bằng phương pháp agro infiltration

Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 31, Số (2015) 53-61 Nghiên cứu biểu tạm thời kháng nguyên GP5 virus gây bệnh lợn tai xanh thuốc (Nicotiana benthamiana) phương pháp Agro-infiltration Hồ Thị Thương1, Nguyễn Thu Giang1, Chu Thị Kim Hồng2, Phạm Thị Vân1, Phạm Bích Ngọc1, Đinh Duy Kháng1, Chu Hồng Hà1,* Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam Đại học Sư phạm Hà Nội Nhận ngày 07 tháng 01 năm 2015 Chỉnh sửa ngày 14 tháng 01 năm 2015; Chấp nhận đăng ngày 03 tháng 03 năm 2015 Tóm tắt: Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn bệnh truyền nhiễm nguy hiểm lợn lây lan toàn giới virus PRRS (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome) gây Protein bề mặt GP5 xem mục tiêu hàng đầu dùng để thiết kế vacxin chống lại xâm nhiễm virus PRRS Trong nghiên cứu này, đoạn gen mã hóa cho protein GP5 nhân dòng vào vector pRTRA để gắn kết với promoter 35S, ELP, his-tag, cmyc-tag tạo cassette 35S-GP5-Histag-Cmyc-100xELP, sau cấu trúc ghép nối vào vector chuyển gen pCB301 biến nạp vào A tumefaciens Cấu trúc sau sử dụng để chuyển vào thuốc N.benthamiana phương pháp agro-infiltration Kết kiểm tra protein tách chiết từ mẫu biểu lai miễn dịch sau ngày biến nạp cho thấy có biểu tái tổ hợp kháng nguyên GP5, nhiên có sai khác kích thước kháng ngun GP5 so với tính tốn lý thuyết có tượng glycosyl hóa xảy q trình cải biến sau dịch mã Phân tích hàm lượng protein GP5 tái tổ hợp phần mềm ImageJ màng lai sau tinh protein từ kg tươi phương pháp sắc ký ion cố định kim loại thu hàm lượng kháng nguyên GP5 chiếm 3,125 % protein tổng số Từ khóa: Nicotiana benthamiana, PRRSV, GP5, agro-infiltration, transient expression Mở đầu∗ Bệnh lây lan vào Việt Nam đàn heo giống nhập từ Mỹ từ năm 1997 sau dịch bệnh nặng thơng báo vào đầu năm 2007, sau lây lan khắp 17 tỉnh khắp nước gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi nước [2], với tổng số 60.000 heo mắc bệnh Vì nguy hiểm thiệt hại lớn kinh tế mà virus PRRS gây ra, việc kiểm soát lây lan dịch bệnh việc cần thiết Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (PRRS, Porcine reproductive and respiratory syndrome), Việt Nam gọi bệnh “lợn tai xanh”, xem bệnh truyền nhiễm nguy hiểm lợn toàn giới ghi nhận lần Bắc Mỹ năm 1987 [1] _ ∗ Tác giả liên hệ ĐT: 84-912175636 Email: chuhoangha@ibt.ac.vn 53 54 H.T Thương nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 31, Số (2015) 53-61 Bệnh virus PRRSV thuộc loại Arterivirus, họ Arteriviridae Nodovirales gây [3] Hệ gene PRRSV có kích thước khoảng 15 kb, với khung đọc mở (ORF): 1a, 1b, 2a, 2b, 3-7 Glycoprotein (GP5) mã hóa ORF 5, thành phần hạt virus với vùng ngoại bào 40 axit amin vùng nội bào 50 đến 70 axit amin [4] GP5 có đoạn tín hiệu peptide định hướng đầu cuối N protein bị glycosyl hóa sau dịch mã từ đến vị trí N30, N33, N44 N51 [5] Vị trí glycosyl hóa quan trọng cho q trình hình thành cấu trúc trì hoạt tính protein [6] GP5 biết yếu tố kích thích việc sản sinh kháng thể trung hịa lợn vấn đề then chốt miễn dịch dịch thể Những chủng PRRSV mang đột biến loại vùng glycosyl hóa GP5 cho thấy khả kích thích sinh kháng thể trung hịa cao chủng dại Trong nghiên cứu phát triển vacxin chống lại PRRSV ghi nhận hai thập kỷ qua, việc thiết kế vacxin tiểu đơn vị tạo đáp ứng miễn dịch tế bào dịch thể đặc biệt quan trọng hai chế liên quan đến việc bảo vệ chống lại virus Trong nhiều hướng ứng dụng để phát triển loại vacxin tiểu đơn vị chống PRRSV, protein GP5 xem mục tiêu hàng đầu dùng để thiết kế loại vacxin chống lại xâm nhiễm PRRSV [7] Và hướng tạo vacxin tiểu đơn vị sử dụng hệ thống hiểu thực vật xem hướng đầy triển vọng với nhiều ưu điểm vượt trội so với hệ thống biểu khác (1) chi phí sản xuất thấp [8]; (2) cho phép thực việc định vị xác protein tái tổ hợp tế bào, cho phép protein có biến đổi sau dịch mã [9]; (3) protein tái tổ hợp tích lũy tế bào thực vật đạt mức cao: lên tới 14,4% lượng protein tổng số trưởng thành [10] (4) Protein tái tổ hợp sản xuất từ thực vật tránh tạp nhiễm virus (HIV, HBV, SV40…) vi khuẩn [11] Cho đến có đến 67 loại kháng nguyên 24 nguồn bệnh khác biểu thành công thực vật [12] Tuy nhiên protein tái tổ hợp tích lũy trồng chuyển gen thường không cao thiếu phương thức tinh protein tái tổ hợp hiệu Để khắc phục nhược điểm này, agro-infiltration phương pháp ứng dụng sinh học thực vật nhằm biểu tạm thời gen sản xuất protein tái tổ hợp mong muốn Agroinfiltration ứng dụng phổ biến hai loài Nicotiana benthamiana Nicotiana tabacum Phương pháp hữu ích biểu protein đích thực vật phương pháp nhanh, khơng bị ảnh hưởng vị trí gắn gen đích tế bào thực vật tiến hành biểu mơ biệt hóa hồn tồn [13] Promoter điều khiển phương pháp tinh protein tái tổ hợp xem yếu tố định đến hàm lượng kháng nguyên thu phục vụ cho việc sản xuất vacxin Nhiều nghiên cứu biểu sản xuất thành công kháng nguyên dung hợp với histag với hàm lượng cao điều khiển promoter CaMV (từ Cauliflower mosaic virus) tinh phương pháp sắc ký ion cố định kim loại chứng minh ví dụ biểu GP5 thuốc chuyển gen với hàm lượng 155 mg/kg tươi [14] Đặc biệt, gắn protein tái tổ hợp với Elastin-like polypeptids (ELP), protein tái tổ hợp tích lũy lên tới 25% protein tổng số hạt [15] Trong nghiên cứu này, chúng tơi trình bày kết nghiên cứu biểu tạm thời kháng nguyên GP5 PRRSV thuốc (N benthamiana) phương pháp agro-infiltration H.T Thương nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 31, Số (2015) 53-61 Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu Vật liệu thực vật: Cây thuốc N benthamiana Phịng Cơng nghệ tế bào, Viện Cơng nghệ sinh học cung cấp Các vector cặp mồi: Vector pGEM-PRRSV mang gen glycoprotein (GP5) phân lập từ chủng PRRSV VN1421 phòng Vi sinh vật phân tử, Viện Công nghệ sinh học cung cấp; vector 55 pRTRA35S-TBAG-100xELP điều khiển promoter 35S chứa gen kháng kháng sinh ampicilin, trình tự 100xELP cmyctag, his-tag Vector chuyển gen pCB301 có chứa gen kháng kháng sinh kanamycin, dùng để tạo cấu trúc chuyển gen mã hóa GP5 [16] Vector pMON65305/Hc-Pro chứa gen mã hóa cho protein Hc-Pro gen kháng kháng sinh spectinomycin rifamycin dùng để đồng biểu thí nghiệm biểu tạm thời với vector đích tái tổ hợp Bảng Danh sách cặp mồi Tên mồi Trình tự (5’-3’) GP5-BamHI-F AGGGATCCGCCAGCAACAACAAC GP5-BamHI-R AGGGATCCGAGACGACCCCATTG 35S-SQF CACTGACGTAAGGGATGACGC 35Sterm CTGGGAACTACTCACACA Chủng vi khuẩn: E coli chủng DH5α dùng để chọn dòng nhân dòng gen Chủng A tumefaciens C58C1 mang pGV2260 [17] 2.2 Phương pháp Nhân dòng gen Đoạn gen GP5 nhân phản ứng PCR sử dụng khuôn plasmid pGEMPRRS (VN1421) với cặp mồi đặc hiệu GP5BamHI-F & R (bảng 1) Phản ứng PCR tiến hành điều kiện: 50 µl hỗn hợp bao gồm 0,3 µM primers (Bảng 1), 0,2 µM dNTPs, 2,5U Pwo SuperYield DNA polymerase, µl đệm 10X Pwo SuperYield PC 20 ng khn Q trình nhân đoạn gồm bước sau: 94oC/3 phút; 32 chu kỳ lặp lại bước 94oC/30 giây, 55oC/50 giây, 72oC/1 phút; 72oC/10 phút, sản phẩm giữ 4oC điện kiểm tra gel agarose 0,8% Sản phẩm PCR thu plasmid pRTRA 35S-TBAG-100xELP tinh Kích thước sản phẩm PCR (bp) 526 Gen +250 phân cắt BamHI loại bỏ gốc phosphate với Shrimp alkaline phosphatase (SAP) Sản phẩm ghép nối đoạn GP5 vào vector pRTRA biến nạp vào tế bào E.coli DH5α Chọn lọc khuẩn lạc môi trường thạch LB bổ sung carbenicilin 50 mg/l Plasmid sau tách chiết giải trình tự tự động theo phương pháp Sanger cộng sử dụng cặp mồi đặc hiệu bảng Các trình tự nucleotide phân tích BioEdit 7.0 Lasergen (DNAstarinc., Madison, WI, USA) Thiết kế cấu trúc biểu cho chuyển gen thực vật Vector pRTRA có chứa biểu kháng nguyên GP5 pCB301 phân cắt HindIII loại bỏ gốc phosphate với SAP Sản phẩm ghép nối DNA vào vector pCB301 biến nạp vào tế bào E.coli DH5α chọn lọc khuẩn lạc mơi trường thạch LB có bổ sung kanamycin 50 mg/l Plasmid tái tổ hợp 56 H.T Thương nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 31, Số (2015) 53-61 pCB301-GP5/ELP sau chọn dòng PCR cắt cặp enzyme giới hạn NcoI biến nạp vào vi khuẩn A.tumefaciens C58C1/pGV2260 phương pháp xung điện theo quy trình [18] để phục vụ cho thí nghiệm biểu tạm thời với mục đích hỗ trợ biểu protein thực vật blotter (Thermoscientific) 25V, 1.3A 20 phút Sau blocking sữa tách béo 5% giờ, màng ủ với kháng thể kháng cmyc qua đêm trước ủ với kháng thể anti-mouse IgG cộng hợp HRP Sự có mặt GP5 gắn cmyc mẫu phát nhờ phản ứng màu chất Biểu tạm thời thuốc N benthamiana Tinh protein dựa vào sắc ký ion cố định kim loại (Immobilized metal ion chromatography- IMAC) Lấy khuẩn lạc chủng A.tumefaciens mang vector chứa gen mã hóa cho protein Hc-pro khuẩn lạc chủng A.tumefaciens mang vector tái tổ hợp pCB301GP5/ELP vào bình ml LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc phù hợp Vi khuẩn nuôi lắc 120 rpm/phút, 14-16 28oC Tiếp tục chuyển toàn dịch khuẩn ni cấy vào bình chứa 50 ml LB tiếp tục nuôi khoảng 4-6 OD600 đạt 0,5-1, khuẩn thu nhận cách ly tâm 5000 rpm/phút 10 phút 4oC Cặn khuẩn hai chủng trộn với hòa tan đệm MES (10 mM MgCl2, 10 mM MES, pH 5,6) tới OD600 đạt Dịch huyền phù vi khuẩn dùng cho biến nạp vào N benthamiana hút chân không thời gian phút, 27 inches, atm Các thuốc sau biến nạp đưa trở lại vào nhà lưới để tiếp tục phát triển Sau ngày biến nạp, toàn thu bảo quản -80 oC Kiểm tra biểu GP5 kỹ thuật Western blot Mẫu thuốc nghiền máy Mixer Mill MM 300 (Retsch, Haan, Germany), sau hịa tan đệm mẫu SDS (50 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 0,1% (w/v), Bromophenolblue, 10% (v/v) Glycerol), biến tính mẫu 95oC, 10 phút ly tâm 19,000 rpm, 30 phút, 4oC 10-30 ug protein sau phân tách điện di SDS-PAGE (10% polyacrylamide), sau chuyển lên màng nitrocellulose máy chuyển màng Fast Thu kg thuốc biểu GP5, làm lạnh nitơ lỏng nghiền thành dạng đồng máy xay sinh tố Protein tổng số tách chiết đệm 50 mM Tris (pH 8,0) Dịch chiết phân tách ly tâm (18,000 rpm, 30 phút, oC), lọc qua màng lọc trộn với agarose gắn Ni-NTA Hỗn hợp trộn 30 phút, 4oC đưa vào cột sắc ký Rửa cột chứa hỗn hợp với lít đệm rửa (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 30 mM Imidazole, pH 8,0) Protein tái tổ hợp sau hịa tan từ cột đệm hòa tan (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 125 mM Imidazole, pH 8,0) cô lại Concentrator iCON TM bảo quản -20 oC Kết thảo luận 3.1 Thiết kế vector tách dòng pRTRA 35S-GP5Histag-Cmyc-100xELP Kết PCR khuếch đại gene mã hóa protein GP5 PRRSV sử dụng mồi GP5BamHI- F/ GP5-BamHI-R thu phân đoạn DNA có kích thước khoảng 0,5 kb tính tốn lý thuyết (Hình 1A) Đoạn gen gắn vào vector tách dòng pRTRA dịng hóa vào tế bào E.coli DH5α Sau q trình chọn dịng colony-PCR (Hình 1B) kiểm tra chiều với mồi GP5-BamHI-R/35SSQF cắt kiểm tra enzyme cắt giới hạn BamHI (Hình 1C), chúng tơi thu dịng H.T Thương nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 31, Số (2015) 53-61 khuẩn lạc mang plasmid mong muốn Ba dòng khuẩn mang plasmid tái tổ hợp giải trình tự với mồi 35S-SQF/35Sterm kết giải trình tự cho thấy tách dịng gắn kết Kb M 57 thành công gen mã hóa protein GP5 PRRSV với promoter 35S, Elastin like-polypeptide (ELP), Cmyc His-tag M 10 11 12 13 14 15 M Kb 5,05 0,53 0,5 0,75 0,53 A B C Hình Kết thiết kế vector pRTRA tái tổ hợp (A)-PCR nhân gen mã hóa protein GP5 PRRSV; (B)-Colony-PCR kiểm tra chiều; (C)-Xử lý vector pRTRA enzyme cắt giới hạn BamHI 3.2 Thiết kế cấu trúc vector chuyển gen pCB301 35S-GP5-Histag-Cmyc-100xELP 3.3 Đánh giá biểu tạm thời GP5 thuốc Western-blot Đoạn vector có kích thước khoảng 5,6 kb cassette 35S-GP5-Histag-Cmyc-100xELP có kích thước 2,94 kb thu nhận từ việc cắt tương ứng từ vector pCB301 pRTRA 35SGP5-Histag-Cmyc-100xELP enzyme HindIII gắn kết lại với xúc tác enzyme T4 ligase Plasmid chuyển gen tái tổ hợp pCB301 35S-GP5-Histag-Cmyc100xELP dịng hóa thành công vào tế bào E.coli DH5α Enzyme NcoI sử dụng để kiểm tra chiều đoạn DNA chuyển vào so với chiều vector pCB301 Vector tái tổ hợp có chứa đoạn DNA chuyển vào ngược chiều lựa chọn sau cắt kiểm tra với NcoI sau biến nạp thành cơng vào tế bào A tumefaciens C58C1 Các phản ứng cắt enzyme giới hạn HindIII NcoI thu phân đoạn tính tốn lý thuyết minh chứng cho điều (Hình A, B, C) Sự biểu kháng nguyên GP5 virus PRRS thuốc N benthamiana sau hút chân không ngày được phát kỹ thuật Westerm-blot Sự biểu kháng nguyên GP5 virus PRRS khác có độ tuổi khác Lá non, với tốc độ tăng trưởng mạnh, sinh tổng hợp protein mạnh hơn, biểu protein đích cao so với già (Hình 3) Tuy nhiên, protein tái tổ hợp thu cao so với kích thước tính tốn lý thuyết protein kháng ngun GP5 gắn kết với ELP (65,91 kDa) Điều liên quan đến trình cải biến sau dịch mã, protein GP5 bị glycosyl hóa sau từ đến vị trí N30, N33, N44 N51 [5] Thực nghiệm cho thấy glycosy hóa làm xuất băng vạch protein cao so với tính tốn lý thuyết 70 kDa 100 kDa (hình 3), khơng có tồn băng vạch thuốc không chuyển gen Để có minh chứng rõ ràng biểu kháng nguyên GP5, tiến hành tinh kháng nguyên GP5 PRRSV phương pháp IMAC H.T Thương nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 31, Số (2015) 53-61 9) HI ( 7776) 18 m ( (7 Ba Nco I o riV S P35 8000 P n 2,65 Trf 1,59 pCB301-GP5 of PRRSV-ELP 8465 bp 2000 60 00 2,94 6,88 4,88 3,59 10 0x E L P 10 A 10 70 00 cm 20 00 10 yc II pt G Hi s am B HI 1 96 EL KD I (5 dI I H in 00 30 00 ) A B r M ot e Kb om n p tI II la c Te N c Z - r N o I ( 87 ) os Pr M ta g Kb i de pe pt na l Hin dIII (8253) Si g ) 77 00 58 No s C Hình Thiết kế cấu trúc vector chuyển gen (A) Cắt Plasmid pRTRA 35S-GP5-Histag-Cmyc-100xELP enzyme giới hạn HindIII; (B) Cắt plasmid pCB301 35S-GP5-Histag-Cmyc-100xELP sản phẩm enzyme NcoI: B-1 Sản phẩm cắt xuôi chiều B2 Sản phẩm cắt ngược chiều, (C) Bản đồ cấu trúc vector chuyển gen pCB301 35S-GP5-Histag-Cmyc100xELP ngược chiều kDa 170 M (-) 100 70 Hình Kết Western-blot với dịch chiết thơ phát kháng thể anti-cmyc Lá non; Lá bánh tẻ; Lá già; (-) thuốc khơng chuyển gen (30 µg/giếng) 3.4 Tinh định lượng kháng nguyên tái tổ hợp GP5 Để loại bỏ ảnh hưởng protein không đặc hiệu đến biểu kháng nguyên đích GP5, phương pháp tinh protein sắc ký ion cố định kim loại (niken) sử dụng Đây phương pháp hiệu để tinh protein tái tổ hợp liên kết với histag Phương pháp dựa xu hướng tự nhiên histidine tạo thành phức hợp với kim loại hóa trị II (ví dụ niken) pH trung tính Sự tương tác protein liên kết histag với kim loại phụ thuộc vào pH Protein đích liên kết với cột hịa tan để tách khỏi cột cách giảm pH tăng nồng độ đệm ion nồng độ đệm bao gồm EDTA imidazole Sự biểu kháng nguyên GP5 sau tinh phát thành công điện di SDS-page phương pháp Western-blot với vạch theo kích thước với lý thuyết kháng nguyên GP5 gắn kết với ELP 65.91 kDa (hình A, B) Như vậy, sau tinh phương pháp IMAC, phân tử glucose bị loại bỏ khỏi protein đích Mặc dầu, q trình glycosyl hóa quan trọng cho hình thành cấu trúc trì hoạt tính protein Tuy nhiên, chủng PRRSV mang đột biến loại vùng glycosyl hóa GP5 chứng minh có khả kích thích kháng thể trung hịa cao chủng dại [6] H.T Thương nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 31, Số (2015) 53-61 kDa M 3 M 59 90 85 72 65,9 50 A B C Hình Đánh giá kết tinh định lượng protein GP5 (A).Điện di SDS-PAGE: 1A- Dịch chiết thô chứa protein GP5-ELP; 2A- Dịch khỏi cột sau đưa dịch thô qua cột tinh sạch; 3A: Protein GP5-ELP sau tinh sạch; (B) Kết Western-blot: 1B- Dịch chiết thô chứa protein GP5-ELP; 2B- Dịch khỏi cột sau đưa dịch thô qua cột tinh sạch; 3B: Protein GP5-ELP sau tinh sạch; (C) Định lượng protein GP5 Western-blot sử dụng phần mềm ImageJ: 1C, 2C, 3C, 4C: đối chứng dương 50, 100, 150, 200 ng/giếng; 5C: Dịch chiết thô chứa protein GP5-ELP trước xử lý; 6C: GP5-ELP tinh (30µg protein tổng số/ giếng) Từ kg mẫu tươi sau tinh protein theo phương pháp IMAC cô lại Concentrator iCON TM, nồng độ protein tổng số định lượng theo phương pháp Bradford protein GP5 định lượng phần mềm ImageJ màng lai Kết thu 250 mg protein GP5 tinh sạch/ gam protein hoàn tan tổng số, với tỷ lệ phần trăm protein GP5/ protein hòa tan tổng số 3.125 %, tương đương với nồng độ kháng nguyên GP5 250 mg/ kg tươi Kết thu cho thấy biểu kháng nguyên GP5 thuốc N benthamiana thí nghiệm biểu tạm thời tương đối cao, so sánh với biểu kháng nguyên GP5 thuốc chuyển gen Min cộng (2011) [14] định lượng phương pháp Elisa với hàm lượng kháng nguyên GP5 155 mg/kg tươi Kết góp phần chứng minh thành công phương pháp biểu tạm thời phương pháp tinh kháng nguyên GP5 virus PRRS từ thuốc N benthamiana thời gian ngắn Ngoài phương pháp tinh protein liên kết với histag nhờ xu hướng tự nhiên histidine tạo thành phức hợp với niken pH trung tính phương pháp tinh protein qua vào màng mITC dựa vào gắn kết Elastin-like polypeptids (ELP) với protein cần biểu xem phương pháp để nâng cao hiệu trình tinh Scheller cộng (2006) [15] tạo protein dung hợp scFv trình tự 100xELP hạt Kết cho thấy tích lũy protein dịch hợp tăng đáng để tới 40 lần so với mức bình thường, gần 25% protein tổng số Floss cộng (2007) [12] sử dụng phương pháp tương tự đề xuất việc sử dụng chiến lược dung 60 H.T Thương nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Cơng nghệ, Tập 31, Số (2015) 53-61 hợp ELP tăng cường biểu kháng thể trung hịa HIV biểu hạt Phan Trọng Hồng (2013) [16] chứng minh biểu HA hạt thuốc N benthamiana tăng cường dung hợp HA với ELP Những nghiên cứu tiền đề để tiến hành tinh protein dung hợp với 100xELP dựa vào phương pháp mITC Kết luận Đã biểu tinh thành công kháng nguyên GP5 virus PRRS từ thuốc N benthamiana phương pháp sắc ký ion cố định kim loại với hàm lượng cao 250 mg/kg tươi Kết góp phần chứng minh thành cơng thí nghiệm biểu tạm thời kháng nguyên GP5 PRRSV thuốc N.benthamiana đồng thời tạo tiền đề cho thí nghiệm biểu tạm thời protein tái tổ hợp khác mơ hình thuốc Lời cảm ơn Cơng trình hồn thành với kinh phí từ đề tài phịng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ Sinh học: ‘Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên virus gây bệnh lợn tai xanh thuốc N benthamiana phương pháp agroinfiltration’ Đề tài có sử dụng trang thiết bị phịng cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Cơng nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Tài liệu tham khảo [1] Goyal S.M., Porcine reproductive and respiratory syndrome, J Vet.Diagn Invest (1993) 656–664 [2] Đậu Ngọc Hào, Văn Đăng Kỳ, Nguyễn Văn Long, Tiêu Quang An, Một số đặc điểm dịch tễ hội chúng rối loạn sinh sản hô hấp lợn từ cuối tháng đến đầu tháng 7/2008 số tỉnh nước Khoa học kỹ thuật thú y, tập XV, (2008) 14-20 [3] Meulenberg J.J., Hulst M.M., de Meijer E.J., Moonen P.L., den Besten, A., de Kluyver, E.P., Wensvoort, G., Moormann, R.J Lelystad virus, the causative agent of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (PEARS), is related to LDV and EAV, Virology 192 (1993) 62–72 [4] Dea S., Gagnon C.A., Mardassi H., Pirzadeh B., Rogan D., Current knowledge on the structural proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus: comparison of the North American and European isolates, Arch Virol.145 (2000), 659 -688 [5] Zhou YJ, Yu H, Tian ZJ, Li GX, Hao XF, Yan LP, Peng JM, An TQ, Xu AT, Wang YX, Wei TC, Zhang SR, Cai XH, Feng L, Li X, Zhang GH, Zhou LJ, Tong GZ , Genetic diversity of the ORF5 gene of porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates in China from 2006 to 2008, Virus Res 144 (2009) 136– 144 [6] Ansari I.H., Kwon B., Osorio F.A., Pattnaik A.K, Influence of N-linked glycosylation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP5 on virus infectivity, antigenicity, and ability to induce neutralizing antibodies, J Virol 80 (2006) 3994–4004 [7] Xiaodong Zhang G L., Lei Gao, Lianzhi Mu, Lichun Zhang, Yanlong Cong, Zhuang Ding, Positive inductive effect of IL-18 on virusspecific immune responses induced by PRRSVGP5 DNA vaccine in swine, Res Vet Sci (94) (2013) 346–353 [8] Schillberg S., Fischer R., and Emans N, Molecular farming of recombinant antibodies in plants Cell.Mol Life.Sci 60 (2003) 433-445 [9] Wagner B., Fuchs H., Adhami F., Ma Y., Scheiner O., and Breiteneder H Plant virus expression systems for transient production of recombinant allergens in Nicotiana benthamiana, Methods 32 (2004) 227-234 [10] Verwoerd T.C., Van Paridon P.A., Van Ooyen A.J., Van Lent J.W., Hoekema A., and Pen J., Stable accumulation of Aspergillus niger phytase in transgenic tobacco leaves, Plant Physiology 109 (1995) 1199-1205 [11] Daniell H, Streatfield SJ, Wycoff K Medical molecular farming: production of antibodies, H.T Thương nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 31, Số (2015) 53-61 biopharmaceuticals and edible vaccines in plants, Trends Plant Sci (2001) 219-226 [12] Floss D.M., Falkenburg D., and Conrad U Production of vaccines and therapeutic antibodies for veterinary applications in transgenic plants: an overview, Transgenic Res 16 (2007) 315-332 [13] Fischer R., Schumann D., Zimmermann S., Drossard J., Sack M., and Schillberg S, Expression and characterization of bispecific single-chain Fv fragments produced in transgenic plants, Eur J Biochem 262 (1999) 810-816 [14] Min-Yuan Chia, S.-H H., Hui-Ting Chan, et al., Evaluation of the immunogenicity of a transgenic tobacco plant expressing the recombinant fusion protein of GP5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and B subunit of Escherichia coliheat-labile enterotoxin in pigs, Vet Immunol Immunop 140 (2011) 215–225 61 [15] Scheller J., Leps M., and Conrad U., Forcing single-chain variable fragment production in tobacco seeds by fusion to elastin-like polypeptids Plant Biotechnol J (2006) 243249 [16] Phan HT, Pohl J, Floss DM, et al., ELPylated haemagglutinins produced in tobacco plants induce potentially neutralizing antibodies against H5N1 viruses in mice [Journal Article, Research Support, Non-U.S Gov't, Plant Biotechnol J 11 (5) (2013) 582-93 [17] Deblaere R., Bytebier B., De Greve, H., Deboeck F., Schell J., Van Montagu M., and Leemans J., Efficient octopine Ti plasmidderived vectors for Agrobacterium-mediated gene transfer to plants, Nucleic Acids Res 13 (1985) 4777-4788 [18] Mersereau M., Pazour G.J., and Das A, Efficient transformation of Agrobacterium tumefaciens by electroporation, Gene 90 (1990) 149-151 Study on the Transient Expression of Glycoprotein GP5 of PRRSV in Nicotiana benthamiana Using agro-Infiltration Hồ Thị Thương1, Nguyễn Thu Giang1, Chu Thị Kim Hoàng2, Phạm Thị Vân1, Phạm Bích Ngọc1, Đinh Duy Kháng1, Chu Hồng Hà1 Institute of Biotechnology, Vietnam Academy of Science and Technology nd Hanoi Pedagogical University Abstract: Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) is one of the most dangerous swine dissease worldwide Glycoprotein (GP5) is the leading target for the development of vaccines against porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) infection In this study, GP5 coding gene was cloned into pRTRA vector for generating cassette 35S-GP5-Histag-Cmyc-100xELP, then inserted into binary vector pCB301 This construct was transformed into Nicotiana benthamiana by using agro-infiltration for transient expression assay Then this construct was used to confirm expression of GP5 in N benthamiana on 5th day following agro-infiltration However, it has been also demonstrated that there was a bigger size of GP5 with molecular weight of 100 kDa and 70 KDa because of post translation modification GP5 was purificated from kg fresh tobacco leaf using immobilized metal ion chromatography method and evaluated by Image J software with 3.125 % of total soluble protein Keywords: Nicotiana benthamiana, PRRSV, GP5, agro-infiltration, transient expression 62 H.T Thương nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 31, Số (2015) 53-61 ... lượng phương pháp Elisa với hàm lượng kháng nguyên GP5 155 mg/kg tươi Kết góp phần chứng minh thành cơng phương pháp biểu tạm thời phương pháp tinh kháng nguyên GP5 virus PRRS từ thuốc N benthamiana. .. với nồng độ kháng nguyên GP5 250 mg/ kg tươi Kết thu cho thấy biểu kháng nguyên GP5 thuốc N benthamiana thí nghiệm biểu tạm thời tương đối cao, so sánh với biểu kháng nguyên GP5 thuốc chuyển... 25% protein tổng số hạt [15] Trong nghiên cứu này, chúng tơi trình bày kết nghiên cứu biểu tạm thời kháng nguyên GP5 PRRSV thuốc (N benthamiana) phương pháp agro- infiltration H.T Thương nnk