Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 34, Số (2018) 1-8 Nghiên cứu biểu tinh chế -glucuronidase có nguồn gốc vi khuẩn cỏ dê tế bào Esccherichia coli Lê Ngọc Giang1, Lê Tùng Lâm1, Trần Thị Loan1,2, Đỗ Thị Huyền1, Trương Nam Hải1,* Viện Công nghệ sinh học, Viện HLKHCN Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Hà Nội, Việt Nam Bộ môn Vi sinh vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, 334 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội, Việt Nam Nhận ngày 13 tháng năm 2017 Chỉnh sửa ngày 16 tháng năm 2018; Chấp nhận đăng ngày 16 tháng năm 2018 Tóm tắt: α-1,2-Glucuronidase GH67 enzyme có khả phân cắt chuỗi bên 4-Omethylglucuronic acid ((Me)GlcA) glucuronoarabinoxylan để làm tăng chuyển hóa lignocellulose thành đường đơn cho lên men sản xuất cồn chất có giá trị từ sinh khối thực vật Trong nghiên cứu này, gen Gglc1 dài 1908 nucleotide mã hóa cho enzyme α-1,2glucuronidase GH67 trưởng thành có nguồn gốc từ vi khuẩn cỏ dê biểu thành công chủng E coli Roseta Hầu hết enzyme biểu dạng tan chủng tái tổ hợp nuôi cấy mơi trường TB, PE có 0,05 mM IPTG 25 oC, 30oC Enzym tinh chế thành công sắc ký lực với độ tinh 90% Hoạt tính enzyme đánh giá sơ dựa chuyển hóa (Me)GlcA birchwood xylan thành 4-O-methyl-Dglucuronic acid D-glucuronic acid làm thay đổi pH dung dịch phát bromothymol blue Enzyme tiếp tục đánh giá tính chất để xem xét khả bổ sung vào hỗn hợp enzyme cho chuyển hóa hiệu sinh khối thực vật thành đường Từ khóa: -glucuronidase, biểu gen, Escherichia coli, DNA metagenome, Gglc1 Mở đầu nghiệp, y dược [1] Sinh khối lignocellulose bao gồm ba thành phần cellulose, hemicellulose lignin liên kết với thành khối rắn Việc phân hủy lignocellulose cần đến tham gia nhiều loại enzyme có nhóm enzyme cellulase thủy phân cellulose thành đường glucose, nhóm hemicellulase thủy phân hemicellulose thành nhiều loại đường 5C, 6C Các đường đơn sử dụng cho lên men sản xuất sản Gỗ mềm sinh khối lignocellulose từ phế phụ phẩm nơng nghiệp nguồn sinh khối tái tạo có giá trị cho sản xuất lượng sinh học, giấy sản phẩm có giá trị cơng _ Tác giả liên hệ ĐT.: 84-24-37917980 Email: tnhai@ibt.ac.vn https://doi.org/10.25073/2588-1140/vnunst.4491 L.N Giang nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Cơng nghệ, Tập 34, Số (2018) 1-8 phẩm đích cồn sinh học hay hóa chất, enzyme Trong cấu trúc hemicellulose gỗ mềm, glucuronoarabinoxylan (GAX) chiếm 815% tổng trọng lượng carbohydrate khơ phụ thuộc vào lồi thực vật [2] Tuy nhiên, GAX xylan nói chung hấp thụ bám chặt vào sợi cellulose vi thể, đồng thời liên kết cộng hóa trị với lignin, làm cản trở cellulase tiếp cận với cellulose q trình chuyển hóa [3–5] GAX có cấu trúc phức tạp bao gồm khung xylan hình thành từ tiểu đơn vị xylopyranosyl liên kết β-1,4 (Xylp) chuỗi bên arabinofuranosyl theo liên kết α-1,3 (Araf), 4-O-methylglucuronic acid (MeGlcA) qua mối liên kết α -1,2 Trung bình, MeGlcA chiếm khoảng 14% phân tử xylan [6] Việc loại bỏ gốc glucuronic acid cấu trúc xylan trở ngại lớn cho việc chuyển hóa nguồn sinh khối [7] Vì vậy, việc tìm kiếm enzyme thủy phân gốc glucuronic acid để hỗ trợ chuyển hóa sinh khối cần thiết α-Glucuronidase enzyme thuộc họ glycoside hydrolases (EC 3.2.1.-) bao gồm GH4, GH67 GH115 Cho đến nay, nhà khoa học chứng minh α-1,2-glucuronidase GH67 hoạt động chuỗi xylan ngắn chứa (Me)GlcA cắt từ đầu không khử [8, 9] α-Glucuronidase thuộc GH115 hoạt động mạch polymer xylan kích thước lớn chuỗi oligosaccharide ngắn [10, 11] Từ nguồn liệu DNA metagenome vi sinh vật cỏ dê, khung đọc mở (ORF) đầy đủ dài 1977 nucleotide khai thác ORF không tương đồng với gen ngân hàng gen NCBI, mã hóa cho enzyme gồm 658 aa có độ tương đồng cao 64% so với enzyme alpha-glucuronidase Bacteroides vulgatus Khung đọc mở có 69 nucleotide phía đầu 5' mã hóa cho tín hiệu tiết Phần gen alphaglucuronidase (Gglc1) mã hóa cho protein trưởng thành có chức sinh học bao gồm 1908 amino acid tối ưu mã cho biểu tốt E coli, sau tổng hợp nhân tạo đưa vào vector biểu pET-22b(+) điểm cắt enzyme hạn chế NcoI XhoI để tạo thành vector pET22-Gglc1 Trong báo này, gen Gglc1 nghiên cứu biểu E coli tiến hành tinh chế làm nguyên liệu cho đánh giá đặc điểm sinh học enzyme Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu Chủng vi khuẩn E coli BL21 Rosetta (DE3) sử dụng thí nghiệm biểu gen; vector pET22b(+) mang gen Gglc1 dùng làm vector biểu 2.2 Phương pháp nghiên cứu Biểu gen Gglc1 Vector pET22-Gglc1 biến nạp vào chủng vi khuẩn E coli BL21 Rosetta (DE3) phương pháp sốc nhiệt [12] Khuẩn lạc E coli mang vector pET22-Gglc1 nuôi cấy mơi trường LB lỏng có bổ sung ampicillin đến nồng độ cuối 100 µg/ml (mơi trường LBA), lắc 200 vịng/phút 37oC qua đêm Sau đó, dịch nuôi cấy chuyển sang môi trường (môi trường khảo sát môi trường LBA, PEA, TBA, TBcbA) để đạt OD600 ban đầu 0,1 nuôi tiếp khoảng 37oC OD600 đạt 0,4 – 0,6 tiến hành bổ sung thêm IPTG để cảm ứng sinh tổng hợp enzyme tái tổ hợp Thành phần môi trường sau: LB gồm 0,5% cao nấm men, 1% bacto tryptone, 1% NaCl; TB gồm 2,4% cao nấm men, 1,2% peptone, 0,4% glycerol, 0,17 M KH2PO4, 0,72 M K2HPO4; TBcb gồm 2,4% cao nấm men, 1,2% peptone, 0,24% D-glucose, 0,17 M KH2PO4, 0,72 M K2HPO4; PE gồm 2% peptone, 1% cao nấm men Nồng độ IPTG khảo sát khoảng từ đến mM Mẫu nuôi cấy tiếp điều kiện lắc 200 vòng/phút nhiệt độ khác để lựa chọn nhiệt độ thích hợp Dịch tế bào ly tâm 5000 vòng/phút, 10 phút để loại bỏ dịch Tủa tế bào hòa lại đệm PBS (8 g NaCl; g KCl; 0,24 g KH 2PO4; 1,42 g Na2HPO4 bổ sung nước lít) L.N Giang nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 34, Số (2018) 1-8 cho OD600=10 để tiện so sánh Tế bào giữ -80oC đến phân tích Protein tế bào kiểm tra điện di gel polyacrylamide 12,6% Phân tách protein pha tan pha không tan Để đánh giá protein tái tổ hợp biểu pha tan hay không tan, tế bào từ -80oC làm tan nhanh nước ấm (40-50oC) sau phá vỡ siêu âm với chu kỳ giây siêu âm giây nghỉ tổng thời gian 10 phút Dịch siêu âm ly tâm 8000 vòng/phút 10 phút để tách protein pha tan pha không tan Pha tan phần dịch thu lại, phần cặn pha khơng tan hịa trở lại PBS với thể tích thể tích phần dịch vừa hút Mẫu kiểm tra điện di SDS-PAGE [13] Tinh chế enzyme -glucuronidase tái tổ hợp Enzyme tái tổ hợp đưa vào pET22b(+) dạng dung hợp với hexahistidine có sẵn vector, enzyme tinh chế sắc ký lực với cột HiChap Chelating HP ml Cột tinh có chứa hạt gel gắn sẵn với Ni2+ bảo quản lạnh cồn 20% lấy rửa nước deion với thể tích 10 lần thể tích cột Sau gel cột cân với đệm gắn cột (imidazole 20 mM, NaCl 500 mM, PBS 5X) với thể tích lần thể tích cột Dịch sau phá tế bào (45 ml) bổ sung thêm muối NaCl, imidazol đệm PBS cho nồng độ cuối tương đương với đệm gắn cột sau đưa vào cột Dịch qua cột thu lại để phân tích Mẫu protein cột rửa với đệm rửa (thể tích lần thể tích cột) có thành phần tương tự đệm gắn cột thay đổi nồng độ imidazol 50 mM 100 mM Sau đó, protein tái tổ hợp đẩy khỏi cột đệm thu mẫu có thành phần tương tự đệm gắn cột có nồng độ imidazol cao 300, 500 mM Mẫu thu phân đoạn, phân đoạn ml Protein phân đoạn kiểm tra điện di SDS-PAGE Độ enzyme sau tinh chế đánh giá phần mềm Quantity One 7.1 Phương pháp đánh giá định tính hoạt tính enzyme Bromothymol blue chất thị pH, sử dụng phổ biến để đánh giá thay đổi pH với độ nhạy cao Khi bổ sung bromothymol blue vào dung dịch, dung dịch chuyển từ màu xanh thẫm đến màu vàng đậm pH chuyển từ cao xuống thấp Theo nguyên lý, nước có mặt -glucuronidase, (Me)GlcA birchwood xylan bị chuyển thành 4-O-methyl-D-glucuronic acid + Dglucuronic acid [14] Các acid làm chuyển màu bromothymol blue nên dễ dàng quan sát để đánh giá sơ hoạt tính enzyme Xylan (Sigma) 1% chuẩn bị nước de ion đun sơi để phá vỡ cấu trúc bó sợi xylan Phản ứng enzyme chất tiến hành 1000 l bao gồm 200 l xylan, 100 l xylanase (Sigma, g), 500 l dịch protein pha tan có chứa enzyme -glucuronidase Mẫu đối chứng có thành phần tương tự dịch enzyme -glucuronidase thay protein pha tan chủng đối chứng Mẫu đối chứng có thành phần tương tự dịch enzyme -glucuronidase chất ủ riêng rẽ trộn trước bổ sung bromothymol blue Phản ứng enzyme chất diễn 40oC qua đêm Sau đó, mẫu bổ sung với 200 µl bromothymol blue Quan sát đổi màu dung dịch mẫu Kết thảo luận 3.1 Biểu gen Gglc1 chủng E coli Rosetta Gen Gglc1 vector pET22b(+) nhận từ hãng Genscript giải trình tự để kiểm tra Kết quả, trình tự gen 100% so với trình tự đặt tổng hợp Plasmid biến nạp vào E coli Rosetta tiến hành biểu 30oC với 0,05 mM IPTG Theo tính tốn lý thuyết, GGLC1 có kích thước L.N Giang nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 34, Số (2018) 1-8 khoảng 74 kDa Kết quả, enzyme glucuronidae có kích thước cao protein chuẩn (băng kích thước 66,2 kDa) biểu dòng E coli Rosetta cảm ứng với IPTG dịng đối chứng khơng cảm ứng với IPTG khơng có protein (Hình 1) (-) M kDa 116 OD600 sau nuôi cấy cảm ứng Nồng độ IPTG (mM) A GGLC1 66,2 45,0 35,0 25,0 B Hình Phân tích sản phẩm biểu gen Gglc1 gel polyacrylamide 12,6% M: Protein chuẩn (Fermentas); (-): Dịng khơng cảm ứng IPTG (đối chứng); 1, 2, 3: Các dòng nuôi cấy cảm ứng với IPTG Ảnh hưởng nồng độ IPTG lên khả biểu gen Gglc1 Để nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng IPTG lên khả tổng hợp αglucuronidase, chủng tái tổ hợp nuôi 200 ml môi trường TBA lỏng 37 oC 1,5 để đạt đến OD600 từ 0,4-0,6 Dịch tế bào chia vào bình, bình 20 ml có bình khơng cảm ứng IPTG dùng làm đối chứng Sáu bình cịn lại bổ sung lượng IPTG thích hợp cho nồng độ IPTG cuối bình 0,05 mM, 0,1 mM, 0,2 mM, 0,5 mM, 0,8 mM mM Tất bình sau ni lắc với tốc độ 200 vịng/phút, biểu 20oC thu mẫu sau Hình Ảnh hưởng nồng độ IPTG lên khả sinh trưởng (A) tổng hợp α-glucuronidase (B) chủng E coli tái tổ hợp M: Protein chuẩn (Fermentas); (-) : Dịng khơng cảm ứng IPTG (đối chứng); S: Protein pha tan; P: Protein pha không tan Kết (Hình 2A) cho thấy, sinh khối tế bào thu sau cảm ứng giảm mạnh nồng độ IPTG tăng dần Điển hình sinh khối tế bào giảm tới lần tế bào cảm ứng với nồng độ IPTG từ 0,5 đến Trong đó, kết điện di sản phẩm protein pha tan pha không tan tế bào E coli nồng độ chất cảm ứng IPTG khác (Hình 2B) cho thấy nồng độ chất cảm ứng IPTG tăng protein ngoại lai tổng hợp nhiều Mặt khác, kết Hình 2A 2B cho thấy mức độ tổng hợp enzyme cao ảnh hưởng tới trình trao đổi chất tế bào chủ làm cho chúng phát triển Enzyme biểu pha tan thường có cấu trúc có hoạt tính sinh học So L.N Giang nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 34, Số (2018) 1-8 sánh α-glucuronidase pha tan biểu nồng độ IPTG khác nhau, nhận thấy nồng độ 0,05 mM, protein tan nhiều, gần tương đương với lượng enzyme tan cảm ứng 0,8 mM IPTG Trong đó, sinh khối tế bào thu sau cảm ứng với 0,05 mM IPTG cao gần lần so với sinh khối tế bào cảm ứng 0,8 mM IPTG Vì vậy, nồng độ IPTG 0,05 mM lựa chọn cho nghiên cứu biểu gen thí nghiệm Khảo sát nhiệt độ biểu Hình Điện di đồ kiểm tra biểu enzym α-glucuronidase tế bào biểu E coli Rosetta nhiệt độ khác gel polyacrylamide 12,6% (-): Dịng tế bào biểu khơng cảm ứng IPTG; M: Protein chuẩn (Fermentas); S: Protein pha tan; P: Protein pha tủa Nhiệt độ yếu tố vô quan trọng ảnh hưởng đến khả sinh trưởng chủng biểu khả tan protein Trong nghiên cứu này, tiến hành khảo sát biểu nhiệt độ khác 25oC, 30oC 37oC Kết cho thấy, sau nuôi cấy môi trường TBA cảm ứng, OD600 mẫu không cảm ứng đạt 13,49, OD600 mẫu cảm ứng ni cấy 25oC, 30oC 37oC thấp hơn, đạt tương ứng 9,3; 7,4 6,4 Bình thường E coli sinh trưởng tốt 37oC nên sinh khối thường đạt cao nhiệt độ Tuy nhiên, nghiên cứu, sinh khối đạt cao sau nuôi 25oC Chứng tỏ thời điểm sau nuôi cấy, chủng nuôi nhiệt độ 30, 37oC giai đoạn thối hóa, vào pha chết Kết phân tích protein biểu nhiệt độ khác cho thấy enzyme -glucuronidase biểu chủ yếu pha tan nuôi cấy cảm ứng chủng nhiệt độ 25oC, 30oC mắt thường thấy nửa enzyme có kích thước 74 kDa biểu pha khơng tan ni cấy chủng 37oC (Hình 3) OD600 sau nuôi cấy cảm ứng Khảo sát môi trường biểu Mơi trường ni cấy A B Hình Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên khả sinh trưởng (A) tổng hợp GGCL1 (B) chủng E coli tái tổ hợp M: Protein chuẩn (Fermentas); (-) : Dịng khơng cảm ứng IPTG (đối chứng); TS: Protein tổng số từ thể tích mơi trường; S: Protein pha tan từ thể tích mơi trường; P: Protein pha khơng tan từ thể tích mơi trường 6 L.N Giang nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 34, Số (2018) 1-8 Môi trường biểu nơi cung cấp dinh dưỡng cho tăng sinh biểu protein tế bào chủ Một môi trường biểu phù hợp giúp cho tế bào chủ sinh trưởng cách tốt đồng thời hỗ trợ tối ưu cho việc biểu protein ngoại lai tế bào Vì sau chọn nhiệt độ nồng độ chất cảm ứng IPTG phù hợp, tiếp tục khảo sát biểu E coli Rosetta mang vector pET22b(+) chứa gen mã hóa α-glucuronidase môi trường khác LB, PE TB Nhìn vào giá trị đo OD600 sau thu mẫu thấy E coli Rosetta mang gen mã hóa αglucuronidase sinh trưởng tốt mơi trường TB, với giá trị OD600 vượt trội hẳn so với hai mơi trường cịn lại Tuy nhiên, thể tích mơi trường mơi trường PE TB chủng tái tổ hợp tổng hợp tốt enzyme -glucuronidase tương đương lượng enzyme biểu pha tan tương đương (Hình 4) Trong môi trường LB, α-glucuronidase biểu thấp Nếu tính kinh tế mơi trường PE môi trường đơn giản, dễ chuẩn bị thành phần đơn giản mơi trường TB sử dụng môi trường PE cho biểu enzyme cho thí nghiệm tinh chế Enzyme α-glucuronidase nghiên cứu biểu với lượng lớn tinh chế với điều kiện khác thay đổi nồng độ imidazol đệm lên cột (20 mM, 50 mM, 70 mM), đệm rửa (50 mM, 100 mM, 150 mM) Kết cho thấy quy trình tinh chế sử dụng đệm lên cột có nồng độ imidazole 70 mM, đệm rửa có nồng độ imidazole 100 mM đệm rửa giải chứa 300 mM imidazole cho kết tinh chế tốt lượng protein tái tổ hợp thu lẫn protein tạp chất (Hình 5A) Sản phẩm α-glucuronidase sau tủa lại dung dịch (NH4)SO4 80% bão hịa loại muối thơng qua cột sắc kí lọc gel kiểm tra độ phần mềm QuantityOne (Biorad) Kết cho thấy tổng hàm lượng protein đường chạy 7,56 g GGLC1 có hàm lượng 6,8 g Vì độ enzyme sau tinh chế 90% (Hình 5B) αGlucuronidase thể hoạt tính phân cắt chuỗi bên (Me)GlcA birchwood xylan thành 4-O-methyl-D-glucuronic acid + Dglucuronic acid làm chuyển màu bromothymol blue sang màu vàng nên dễ dàng quan sát để đánh giá sơ hoạt tính enzyme Ống đối chứng (-) C1 khơng có enzyme ống đối chứng âm C2 bổ sung enzyme enzyme bị bất hoạt nên khơng thể hoạt tính dẫn đến dung dịch có màu xanh Nghiên cứu tinh chế α-glucuronidase C1 A B C2 GGLC1 C Hình Đánh giá độ tinh α-glucuronidase (GGLC1) SDS-PAGE (A) phần mềm QuantityOne (B) kiểm tra hoạt tính enzyme chất xylan (C) M: Protein chuẩn (Fermentas); 1: Mẫu α-glucuronidase tinh chế; C1: mẫu chứng không chứa enzyme; C2: Mẫu chứng enzyme bổ sung trước bổ sung thị màu L.N Giang nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 34, Số (2018) 1-8 Kết luận Gen Gglc1 mã hóa -glucuronidase có nguồn gốc từ vi khuẩn cỏ dê biểu thành công E coli pha tan mơi trường TB, PE có 0,05 mM IPTG 25, 30oC Enzym tinh chế thành công sắc ký lực với độ tinh 90% có hoạt tính chuyển hóa mạch bên xylan Lời cảm ơn Cơng trình thực nguồn kinh phí Đề tài độc lập “Nghiên cứu metagenome của số hệ sinh thái mini tiềm nhằ m khai thác gen mã hóa hệ enzyme chuyển hóa hiệu lignocelluloses“, mã số ĐTĐLCN.15/14 trang thiết bị Phòng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ gen Tài liệu tham khảo [1] Z Anwar, M Gulfraz, M Irshad, Agro-industrial lignocellulosic biomass a key to unlock the future bio-energy: A brief review, Journal of Radiation Research and Applied Sciences (2014) 163 [2] S Willför, A Sundberg, J Hemming, B Holmbom, Polysaccharides in some industrially important softwood species, Wood Science and Technology 39 (2005) 245 [3] T.J Bosmans, A.M Stépán, G Toriz, S Renneckar, E Karabulut, L Wågberg, P Gatenholm, Assembly of debranched xylan from solution and on nanocellulosic surfaces, Biomacromolecules 15 (2014) 924 [4] M.A Kabel, H van den Borne, J.P Vincken, A.G.J Voragen, H.A Schols, Structural differences of xylans affect their interaction with cellulose, Carbohydrate Polymers 69 (2007) 94 [5] Å Linder, R Bergman, A Bodin, P Gatenholm, Mechanism of assembly of xylan onto cellulose surfaces, Langmuir 19 (2003) 5072 [6] A Escalante, A Gonỗalves, A Bodin, A Stepan, C Sandström, G Toriz, P Gatenholm, Flexible oxygen barrier films from spruce xylan, Carbohydrate Polymers 87 (2012) 2381 [7] L.S McKee, H Sunner, G.E Anasontzis, G Toriz, P Gatenholm, V Bulone, F Vilaplana, L Olsson, A GH115 α-glucuronidase from Schizophyllum commune contributes to the synergistic enzymatic deconstruction of softwood glucuronoarabinoxylan, Biotechnology for Biofuels (2016) [8] G Golan, D Shallom, A Teplitsky, G Zaide, S Shulami, T Baasov, V Stojanoff, A Thompson, Y Shoham, G Shoham, Crystal structures of Geobacillus stearothermophilus α-glucuronidase complexed with its substrate and products MECHANISTIC IMPLICATIONS, Journal of Biological Chemistry 279 (2004) 3014 [9] D Nurizzo, T Nagy, H.J Gilbert, G.J Davies, The structural basis for catalysis and specificity of the Pseudomonas cellulosa α-glucuronidase, GlcA67A, Structure 10 (2002) 547 [10] P.M Martínez, M.M Appeldoorn, H Gruppen, M.A Kabel, The two Rasamsonia emersonii αglucuronidases, ReGH67 and ReGH115, show a different mode-of-action towards glucuronoxylan and glucuronoxylo-oligosaccharides, Biotechnology for Biofuels (2016) [11] B Cobucci-Ponzano, A Strazzulli, R Iacono, G Masturzo, R Giglio, M Rossi, M Moracci, Novel thermophilic hemicellulases for the conversion of lignocellulose for second generation biorefineries, Elsevier 78 (2015) 63 [12] J Sambrook, D.W Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSHL Press, 2001 [13] U.K Laemmli, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature 227 (1970) 680 [14] A Rogowski, A Baslé, C.S Farinas, A Solovyova, J.C Mortimer, P Dupree, H.J Gilbert, D.N Bolam, Evidence that GH115 αglucuronidase activity, which is required to degrade plant biomass, is dependent on conformational flexibility, The Journal of Biological Chemistry 289 (2014) 53 8 L.N Giang nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 34, Số (2018) 1-8 Expression and Purification of -glucuronidase Derived from Bacteria in Doats Rumen from Recombinant Escherichia coli Rosetta (DE3) Le Ngoc Giang1, Le Tung Lam1, Tran Thi Loan1,2, Do Thi Huyen1, Truong Nam Hai1 Institute of Biotechnology, Vietnam Academy of Science and Techology Biology Faculty, VNU University of Science, 334 Nguyen Trai, Thanh Xuan, Hanoi, Vietnam Abstract: α-1,2-Glucuronidase GH67 plays an important role in the degradation of 4-Omethylglucuronic acid ((Me)GlcA) side chain in glucuronoarabinoxylan to enhance lignocellulose converstion into fermentable sugars for production of bioethanol and value-added products from plant biomass In this study, a gene Gglc1 of 1908 nucleotides coding for mature α-1,2-glucuronidase GH67 derived from bacteria in goats rumen was sucessfully expressed in E coli Roseta Most of recombinant enzyme was soluble fraction when the host cultured in TBA, PEA media containing 0.05 mM IPTG at 25oC or 30oC The recombinant enzyme was purified by His-tag affinity chromatography with purity of 90% Preliminarily, the enzyme exhibited activity to converse (Me)GlcA present in birchwood xylan into 4-O-methyl-D-glucuronic acid and D-glucuronic acid to reduce pH which was detected by pH indicator bromothymol blue In future, the recombinant enzyme will be characterized for supplementation into enzyme cocktail for effective lignocellulose conversion into sugar Keywords: -glucuronidase, expression, Escherichia coli, DNA metagenome, Gglc1 ... mã hóa -glucuronidase có nguồn gốc từ vi khuẩn cỏ dê biểu thành công E coli pha tan môi trường TB, PE có 0,05 mM IPTG 25, 30oC Enzym tinh chế thành công sắc ký lực với độ tinh 90% có hoạt tính... khối tế bào cảm ứng 0,8 mM IPTG Vì vậy, nồng độ IPTG 0,05 mM lựa chọn cho nghiên cứu biểu gen thí nghiệm Khảo sát nhiệt độ biểu Hình Điện di đồ kiểm tra biểu enzym α- glucuronidase tế bào biểu E coli. .. mã cho biểu tốt E coli, sau tổng hợp nhân tạo đưa vào vector biểu pET-22b(+) điểm cắt enzyme hạn chế NcoI XhoI để tạo thành vector pET22-Gglc1 Trong báo này, gen Gglc1 nghiên cứu biểu E coli tiến