Ứng dụng phương pháp RT-LAMP trong chẩn đoán Tembusu virus trên vịt ở Hà Nội

Bài viết Ứng dụng phương pháp RT-LAMP trong chẩn đoán Tembusu virus trên vịt ở Hà Nội áp dụng phương pháp RT-LAMP cho chẩn đoán nhanh Tembusu virus. Việc bổ sung thêm enzym sao chép ngược trong thành phần phản ứng RT-LAMP có thể khuếch đại trực tiếp khuôn mẫu là RNA với hiệu quả cao mà không cần quá trình phiên mã ngược.

HỘI NGHỊ KHOA HỌC CHĂN NI THÚ Y TỒN QUỐC 2021 - AVS2021: 149-156 ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP RT-LAMP TRONG CHẨN ĐOÁN TEMBUSU VIRUS TRÊN VỊT Ở HÀ NỘI Mai Thị Ngân1*, Đặng Hữu Anh1, Nguyễn Văn Giáp1, Phạm Thị Lan Hương1, Phan Thị Hạnh1, Lê Khắc Duy1, Nguyễn Hữu Huân1,2, Huỳnh Thị Mỹ Lệ1 Wataru Yamazaki3 Tóm tắt Gần đây, nhiều địa phương xuất vịt có biểu nghi ngờ Tembusu virus gây giảm đẻ đột ngột, bại liệt, tiêu chảy Nghiên cứu phát có mặt Tembusu virus đàn vịt bệnh Hà Nội phương pháp PCR Tuy nhiên, phương pháp yêu cầu máy luân nhiệt với độ xác cao mà trang bị phịng thí nghiệm nhỏ Việt Nam Do vậy, nghiên cứu áp dụng phương pháp RT-LAMP cho chẩn đoán nhanh Tembusu virus Việc bổ sung thêm enzym chép ngược thành phần phản ứng RT-LAMP khuếch đại trực tiếp khuôn mẫu RNA với hiệu cao mà không cần trình phiên mã ngược Đồng thời, sử dụng thêm cặp mồi vòng lặp làm tăng tốc độ phản ứng Hơn với thị màu, kết phản ứng quan sát mắt thường Xét nghiệm 32 mẫu thực địa đối chiếu với RT-PCR cho thấy, RT-LAMP phương pháp chẩn đoán nhanh, đơn giản, có độ nhạy độ đặc hiệu cao kết dễ dàng quan sát mắt thường Do đó, kết nghiên cứu chúng tơi có tính ứng dụng cao cơng tác chẩn đoán nhanh Tembusu virus tác nhân gây bệnh khác Từ khóa: Mồi vịng lặp, RT-LAMP, RT-PCR, TMUV APPLICATION OF RT-LAMP METHOD FOR THE DETECTION OF TEMBUSU VIRUS IN DUCKS IN HANOI Abstract Recently, some farms have ducks with suspected symptoms caused by the Tembusu virus (TMUV) such as decreased egg production, paralysis, diarrhea A recent study has shown the presence of the TMUV in infected ducks in Hanoi by the reversed transcription polymerase chain reaction (RT- PCR) method However, this method requires high-precision thermal cyclers that are not equipped in small laboratories in Vietnam Therefore, in this study, we introduce the reversed transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) method for the rapid diagnosis of the Tembusu virus Adding reverse transcriptase enzyme in the reaction components of RT-LAMP can directly amplify the RNA template with high efficiency without reverse transcription process In addition, using loop primers increased the reaction speed Furthermore, with the color indicator, the results of the reaction can be observed with the naked eye In comparison with RT-PCR, results of testing 32 field samples showed that RT-LAMP is a fast, simple diagnostic method with high sensitivity and specificity and the results can be easily observed with the naked eye Therefore, our research results are highly applicable to the rapid detection of the TMUV as well as other pathogens Keywords: Loop primers, RT-LAMP, RT-PCR, TMUV ĐẶT VẤN ĐỀ Tembusu virus (TMUV), thuộc chi Flavivirus, họ Flaviviridae phân lập lần vào năm 1955 loài muỗi Culex tritaeniorhynchus Malaysia, ARN Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam; Công ty Cổ phần thuốc thú y Trung ương Navetco; Trung tâm Nghiên cứu Đông Nam Á, Đại học Kyoto, Nhật Bản; * Tác giả liên hệ: Mai Thị Ngân; Email: mtngan@vnua.edu.vn; ĐT: 0988922656 149 HỘI NGHỊ KHOA HỌC CHĂN NI THÚ Y TỒN QUỐC 2021 - AVS2021: 149-156 virus có độ dài khoảng 11 kilobases với khung đọc mở (ORF) mã hóa cho protein cấu trúc với protein không cấu trúc (Zhang cs., 2017) Virus không tác động đến vịt đẻ mà cịn lây nhiễm cho vịt thịt, gà, ngỗng chuột (Sun cs., 2019) TMUV nhóm virus truyền lây thơng qua muỗi, đe dọa chăn nuôi gia cầm sức khỏe cộng đồng Hiện người ta phát TMUV truyền lây theo đường khác mà không cần thông qua véc-tơ truyền bệnh (Yan cs., 2018) Chăn nuôi vịt Việt Nam phát triển mạnh nhiên lịch tiêm phịng vắc-xin cho đàn vịt ni tập trung vào bệnh viêm gan vịt, dịch tả vịt cúm gia cầm Thời gian gần nhiều địa phương xuất vịt có biểu bệnh nghi ngờ TMUV gây tỷ lệ đẻ giảm mạnh đột ngột, bại liệt, buồng trứng xuất huyết Nghiên cứu Đặng Hữu Anh cs (2020) có mặt TMUV gây bệnh đàn vịt khu vực Hà Nội phương pháp khuếch đại nucleic acid RT-PCR (Đặng Hữu Anh cs., 2020) Khuếch đại nucleic acid ứng dụng rộng rãi nghiên cứu y sinh học nhận biết đặc điểm di truyền, phát bệnh di truyền hay chẩn đoán bệnh truyền nhiễm (Moore, 2005) PCR phương pháp khuếch đại DNA sử dụng rộng rãi thơng qua q trình ln nhiệt làm biến tính sợi đơi DNA tạo khn cho q trình sinh tổng hợp DNA Tuy nhiên, phương pháp địi hỏi máy ln nhiệt với độ xác cao, mà không trang bị phịng thí nghiệm nhỏ Việt Nam Gần đây, với phát triển sinh học phân tử chứng minh khả khuếch đại ADN điều kiện đẳng nhiệt mà không cần thiết bị luân nhiệt LAMP (Loop-mediated Isothermal Amplification) phương pháp khuếch đại nucleic acid đẳng nhiệt thơng qua cấu trúc vịng lặp đặc hiệu, đơn giản, nhanh chóng tiết kiệm; phương pháp mô tả lần vào năm 2000 (Notomi cs., 2000) Một ưu điểm LAMP không yêu cầu khuôn mẫu DNA biến 150 tính cho q trình khuếch đại (Nagamine cs., 2001) Đặc biệt kết hợp với enzyme chép ngược, LAMP khuếch đại trực tiếp chuỗi RNA với hiệu cao mà khơng cần q trình phiên mã (Whiting Champoux, 1998) Khuếch đại phát gene hồn thành bước đơn giản cách ủ hỗn hợp phản ứng nhiệt độ cố định khoảng 600C đến 65°C Vì thế, LAMP thực cách sử dụng tủ ấm hay bể ủ nhiệt mà thiết bị đươc trang bị hầu hết phịng thí nghiệm nhỏ Việt Nam Mặc dù, LAMP phát triển ứng dụng chẩn đoán số bệnh tiêu chảy cấp lợn, hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản, bệnh Salmonella,… (Mai Thị Ngân cs., 2021; Phạm Minh Hằng cs., 2020) Tuy nhiên, nghiên cứu ứng dụng LAMP chẩn đoán bệnh virus, vi khuẩn gây Việt Nam hạn chế Do nghiên cứu đề cập đến việc ứng dụng phương pháp LAMP chẩn đoán nhanh TMUV VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu - Mẫu bệnh phẩm lấy từ vịt bị bệnh bao gồm: não, tim, phổi, gan, lách, buồng trứng thu thập từ đàn vịt nghi nhiễm TMUV tỉnh Bắc Ninh, Hà Nội, Hưng Yên - Hóa chất dùng tách tinh ARN tổng số gồm: TRIzol reagent (Invitrogen, Thermo Fischer Scientific, USA); chloroform (Merck KGaA, Darmstadt, Germany); 2-Propanol (Merck KGaA, Darmstadt, Germany); cồn 70%; nước cất xử lý 0,1% diethylpyrocarbonate (iNtRON Biotechnology, Inc Burlington, MA, USA) - Tổng hợp cDNA thực bằng: random hexamers (Invitrogen, Thermo Fischer Scientific, USA) kit M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen, Thermo Fischer Scientific, USA) - Sinh phẩm, hóa chất dùng cho phản ứng PCR: 2X PCR Master mix solution (iN- HỘI NGHỊ KHOA HỌC CHĂN NUÔI THÚ Y TOÀN QUỐC 2021 - AVS2021: 149-156 tRON Biotechnology, Inc Burlington, MA, nghiên cứu công bố (Liu cs., 2012), với USA); cặp mồi từ gen NS5 virus theo thơng tin Bảng Bảng Trình tự mồi dùng cho phản ứng RT- PCR Tên mồi NS5-F Trình tự nucleotide (5’ – 3’) TTTGGTACATGTGGCTCG NS5-R ACTGTTTTCCCATCACGTCC Kích thước (bp) 350 - Sinh phẩm, hóa chất dùng cho phản hydroxynaphthol blue - HNB (Wako Pure ứng RT-LAMP: Tris-HCl (Wako Pure Chemicals, Missouri, USA), GelGreen Chemicals, Missouri, USA), KCl, Betaine (10.000X Sol, Biotium, Fremont, California, (NH4)2SO4 (Sigma - Aldrich, Missouri, USA); mồi dùng cho trình khuếch đại USA), MgSO4 (New England Biolabs, RNA TMUV theo nghiên cứu Massachusetts, USA), Bst DNA polymerase công bố (Tang cs., 2016; Yan cs., (New England Biolabs, Massachusetts, 2012) Trình tự nucleotide cặp mồi USA), enzyme chép ngược AMV Reverse liệt kê Bảng Transcriptase (Invitrogen, California, USA), Bảng Trình tự nucleotide cặp mồi LAMP để chẩn đoán TMUV Tên mồi Trình tự nucleotide (5′ to 3′) Ví trí F3 B3 FLP BLP FIP GGGAGCATACAGACATGTGC CCTCCATCTCAGCGGTGTA TGGACGTTTTCCTTCTGCAC AAACATGCCGCCAGATTCGTT 331 - 350 526 - 544 388 - 407 484 - 504 428 - 449 (F1c-F2) BIP (B1c-B2) F3 B3 FIP (F1c-F2) BIP (B1c-B2) CTCGCTTCCGTGGAACCATGTAAGAAAGCAGAAGGCAGGAT TATTCAGCCCAGCAGTCGCTGCGGGACTTTTGGGCGTTA CCACGAGCTGCAAATGAAAG GGCGTTTGCCATTAGTCTGA AGACCCTGGAGAGAGCCTGGTTGTGGTTCCATGTCGAGAC ACAGAAACAGCATGCCTGAGCAGTCCCTCCTGTGGAAGTACA 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp chiết tách ARN tổng số ARN tổng số tách TRIzol reagent (theo hướng dẫn nhà sản xuất), với bước sau: (i) thêm 750 µl TRIzol vào 250 µl huyễn dịch mẫu 10% để giải phóng ARN, vortex để đồng nhất; (ii) tách pha ARN 200 µl chloroform, vortex để đồng nhất; (iii) tủa ARN thu bước (ii) 500 µl 2-propanol, giữ -20oC/10 phút; (iv) rửa tủa Nguồn tham khảo (Tang cs., 2016) 368 - 386 463 - 483 506 - 523 9.808 - 9.827 9.984 - 10.003 9.882 - 9.901 9.840 - 9.859 9.914 - 9.935 (Yan cs., 2012) 9.963 - 9.982 ARN 1ml cồn 75% Các bước từ (ii) đến (iv) ly tâm 12.000 vòng/phút 10 phút 4oC Hịa tan tủa ARN 30 µl nước (đã xử lý Dnase/Rnase) bảo quản -80oC Nồng độ ARN tổng số đo máy quang phổ NanoDrop 8000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Wilmington, USA) 2.2.2 Phương pháp RT-PCR ARN tổng số chuyển thành cDNA random hexamers, sử dụng kit 151 HỘI NGHỊ KHOA HỌC CHĂN NI THÚ Y TỒN QUỐC 2021 - AVS2021: 149-156 M-MLV Reverse Transcriptase với thành 2.2.3 Phương pháp RT-LAMP phần phối trộn theo hướng dẫn nhà Thành phần 25 µl phản ứng sản xuất Phản ứng tổng hợp cDNA thực RT-LAMP liệt kê bảng Hỗn 37oC 60 phút hợp phản ứng ủ bể ổn nhiệt 63oC Phản ứng PCR phát Tembusu 60 phút sau tăng lên 80oC virus thực cặp mồi NS5f/ phút để dừng phản ứng Kết phản NS5r, theo quy trình cơng bố trước (Liu cs, 2012) Phân tích sản phẩm PCR ứng RT-LAMP đánh giá trực tiếp bằng điện di thạch agarose 2% có bổ mắt thường thơng qua đổi màu thị có thành phần phản ứng sung thuốc nhuộm ADN (RedSafe) 1x Bảng Thành phần phản ứng RT-LAMP Thành phần Nồng độ gốc KCl (NH4)2SO4 Tris - HCl (pH= 8,8) MgSO4 Betain dNTP FIP/BIP F3/B3 LF/LB Bst polymerase 2.0 AMV Reverse Transcriptase HNB GelGreen 1M 1M 1M 100mM 5M 100mM 100mM 100mM 100mM 8u/ µl 15u/µl 100mM 10.000x Nồng độ 25 µl Loại hóa chất thể tích phản ứng 10mM 10mM 10X hỗn hợp 20mM dung dịch 4mM đệm 1M 1.6mM 1.6 µM 10X hỗn hợp 0.2 µM mồi 0.8 µM 8u 10X hỗn hợp enzym 0.15 u 3mM 0,35% H2O RNA Bên cạnh đó, phản ứng thực hệ thống real time PCR LightCycler 96, (Roche, Thụy Sỹ) để so sánh thời gian khuếch đại thực cặp mồi khác Chu kỳ nhiệt cho RT-LAMP tiến hành sau: 60 chu kỳ 63oC 30 giây 63oC 30 giây Các tín hiệu huỳnh quang thu thập cuối chu kỳ Sử dụng kênh FAM để đo tín hiệu huỳnh quang 2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu Để so sánh hiệu hai phương pháp RT-PCR RT-LAMP, hệ số Kappa sử dụng để đánh giá mức độ đồng thuận hai phương pháp chẩn đoán bệnh Giá trị hệ số Kappa dao động từ đến phân loại sau: 152 10X thị màu Thể tích (µl) 12,5 1,3 1 7,2 < 0,4: mức độ đồng thuận yếu 0,4 - 0,6: mức độ đồng thuận trung bình 0,61 - 0,8: mức độ đồng thuận tốt > 0,8: mức độ đồng thuận tốt KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phương pháp RT-LAMP kết hợp thị màu chẩn đoán Tembusu virus Trong nghiên cứu sử dụng enzym Bst DNA polymerase cho phản ứng LAMP enzym hoạt động tốt khoảng nhiệt độ từ 60 đến 65oC, bị bất hoạt 80oC Do đó, nhiệt độ chúng tơi lựa chọn cho phản ứng RT-LAMP nghiên cứu 63oC sử dụng nghiên cứu HỘI NGHỊ KHOA HỌC CHĂN NI THÚ Y TỒN QUỐC 2021 - AVS2021: 149-156 trước (Tang cs., 2016) Phản ứng thực bể ổn nhiệt 63oC 60 phút, sau tăng lên 80oC phút để dừng phản ứng Kết đánh giá trực tiếp mắt thông qua đổi màu thị màu kim loại HNB có thành phần phản ứng miêu tả nghiên cứu trước (Mai Thị Ngân cs., 2021; Mai cs., 2020) Kết phương pháp RT-LAMP (Hình 1B) cho kết giống với phương pháp RT-PCR (Hình 1C) Bằng A Phương pháp RT-LAMP (trước phản ứng) thay đổi màu thị màu kim loại HNB, sau phản ứng ống chuyển màu xanh lam phản ứng dương tính nồng độ Mg2+ giảm q trình khuếch đại, phản ứng âm tính giữ nguyên màu tím HNB giống trước phản ứng (Hình 1A) Sự thay đổi màu sắc thấy rõ mắt thường Việc bổ sung HNB vào dung dịch LAMP trước phản ứng chứng minh không làm ảnh hưởng đến hiệu suất khuếch đại, giúp giảm nguy gây tạp nhiễm B Phương pháp RT-LAMP (sau phản ứng) Các giếng theo thứ tự từ trái sang Các giếng theo thứ tự từ trái sang phải: đối chứng dương đối phải: đối chứng dương đối chứng âm TMUV chứng âm TMUV C Phương pháp RT-PCR Các giếng theo thứ tự từ trái sang phải: Marker, đối chứng dương đối chứng âm TMUV Hình Kết chẩn đốn TMUV Enzym DNA polymerase có hoạt tính thay mạch, tự thay giải phóng DNA mạch đơn Vì vậy, ưu điểm phương pháp LAMP khơng cấn biến tính nhiệt đoạn DNA mạch đôi thành mạch đơn (Nagamine cs, 2001) Bên cạnh thơng qua hoạt tính enzyme chép ngược, cDNA tổng hợp trực tiếp từ RNA từ đầu 3’ bắt đầu hoạt động mồi BIP mà khơng cần q trình phiên mã phương pháp RT-PCR (Whiting Champoux, 1998) Vì đoạn bổ sung gắn FIP (F1c-F2) thay có chứa trình tự bổ sung hai đầu nên tự tạo thành cấu trúc vòng lặp đầu - cấu trúc tạ Đây cấu trúc khởi đầu cho vòng khuếch đại phương pháp LAMP Cấu trúc nhanh chóng chuyển thành DNA mạch vịng tổng hợp DNA tự mồi Trong bước ban đầu phản ứng LAMP, tất bốn mồi bao gồm cặp mồi phía (FIP BIP) cặp mồi phía ngồi (F3 B3) sử dụng, sau hình thành cấu trúc vịng lặp cặp mồi phía sử dụng để tổng hợp DNA (Notomi cs, 2000) Do vậy, nồng độ mồi hai cặp mồi phía ngồi thấp (Bảng 3) 3.2 RT-LAMP BAO GỒM CẶP MỒI VÒNG LẶP Nghiên cứu Nagamine cs, 2002 cho thấy việc bổ sung thêm cặp mồi vòng lặp (LF LB) vào thành phần phản ứng làm tăng tốc độ phản ứng LAMP Vị trí mồi vịng lặp vùng F2 F1 (hoặc B1 B2) theo hướng F1 đến F2 (hoặc B1 đến B2) (http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/primer html) Do đó, nghiên cứu sử dụng hai mồi khác nhau, mồi bao gồm cặp mồi vịng lặp, mồi khơng bao gồm cặp mồi vịng lặp Q trình khuếch 153 HỘI NGHỊ KHOA HỌC CHĂN NI THÚ Y TỒN QUỐC 2021 - AVS2021: 149-156 đại thực gen TMUV thực hệ thống real time PCR LightCycler 96 với tín hiệu huỳnh quang (Flourescence) thu từ kênh FAM với có mặt thuốc nhuộm DNA GelGreen có thị màu thành phần phản ứng (Bảng 3) Kết thể hình Hình Q trình khuếch đại RT-LAMP TMUV có cặp mồi vòng lặp Việc bổ sung cặp mồi vòng lặp làm tăng số lượng điểm khởi đầu cho trình tổng hợp DNA phản ứng LAMP Với phương pháp LAMP khơng có vịng lặp, bốn vịng tạo không sử dụng Nhưng thông qua việc sử dụng cặp mồi vòng lặp, tất vịng lặp sử dụng làm điểm khởi đầu cho trình tổng hợp DNA Trong phản ứng RT-LAMP với khuôn mẫu RNA TMUV, trình khuếch đại mồi khơng có cặp mồi vòng lặp 37 phút (đường khuếch đại màu xám), mồi có thêm cặp mồi vịng lặp 19 phút (đường khuếch đại màu xanh) (Hình 2) Như vậy, phương pháp LAMP sử dụng mồi (có cặp mồi vịng lặp) thời gian phản ứng giảm gần nửa so với phương pháp LAMP mồi (khơng có mồi vịng lặp) Do đó, chúng tơi sử dụng mồi có thêm cặp mồi vịng lặp để làm tăng tốc độ khuếch đại phản ứng RT-LAMP Điều giúp cho trình chẩn đốn nhanh tác nhân gây bệnh, hỗ trợ cho cơng tác phịng chống bệnh có hiệu 3.3 Chẩn đốn TMUV từ mẫu thực địa Để kiểm tra hiệu phương pháp RT-LAMP, tiến hành xét nghiệm 154 32 mẫu bệnh phẩm hai phản ứng RTPCR RT-LAMP để chẩn đốn có mặt TMUV Kết chẩn đoán TMUV từ mẫu thực địa trình bày Bảng Kết Bảng cho thấy có mẫu dương tính với TMUV phương pháp RT-PCR cho kết dương tính với RT-LAMP, 28 mẫu âm tính với TMUV RT-PCR cho kết âm tính phương pháp RTLAMP Hệ số Kappa 1,0 cho thấy mức độ đồng thuận hai phương pháp cao RT-LAMP sử dụng mồi khác thiết kế đặc biệt nhận đến đoạn riêng biệt gen đích (Notomi cs., 2000; Nagamine cs., 2002; Nagamine cs., 2001) nên tính đặc hiệu cao Bên cạnh đó, hiệu khuếch đại cao, với lượng ADN khuếch đại đến 109 lần vịng (Nagamine cs., 2002), gây tạp nhiễm thực điện di để kiểm tra sản phẩm khuếch đại Việc bổ sụng thêm thị màu (gồm HNB GelGreen) giúp cho trình đọc kết phản ứng trực tiếp mắt thường đèn tím, hạn chế tạp nhiễm gây trình điện di Hơn GelGreen thuốc nhuộm DNA huỳnh HỘI NGHỊ KHOA HỌC CHĂN NI THÚ Y TỒN QUỐC 2021 - AVS2021: 149-156 quang màu xanh nhạy nhiều so đèn LED (Mai Thị Ngân cs., 2021) Kết với loại thuốc nhuộm DNA khác, an toàn cho thấy, phương pháp RTvới môi trường, dễ sử dụng, tín hiệu huỳnh LAMP ứng dụng rộng rãi để chẩn quang quan sát đèn cực tím đốn nhanh có mặt TMUV Bảng Kết chẩn đoán TMUV từ mẫu thực địa RT-PCR Dương tính Âm tính Tổng RT-LAMP Dương tính Âm tính Tổng Hệ số Kappa: 1,0 KẾT LUẬN Việc sử dụng thêm cặp mồi vòng lặp (LF LB) làm tăng điểm khởi đầu giúp tăng tốc độ phản ứng khuếch đại phương pháp RT-LAMP Đồng thời với việc bổ sung thêm thị màu vào thành phần phản ứng RT-LAMP trước khuếch đại giúp cho việc đọc kết trực tiếp mắt thường Phương pháp RT-LAMP cho kết chẩn đoán TMUV với mức độ đồng thuận cao với phương pháp RT-PCR từ mẫu thực địa Như vậy, RT-LAMP ứng dụng rộng rãi phịng thí nghiệm nhỏ trang bị với ưu việt nhanh, đơn giản xác chẩn đốn nhanh TMUV TÀI LIỆU THAM KHẢO Đặng Hữu Anh, Huỳnh Thị Mỹ Lệ Nguyễn Văn Giáp (2020) Một số kết nghiên cứu bước đầu Tembusu virus vịt bệnh Hà Nội Tạp chí KHKT Thú y, Tập XXVII, số Phạm Minh Hằng, Phan Thanh Hương, Phạm Thị Thu Thúy Nguyễn Viết Không (2020) Phát triển đánh giá kỹ thuật LAMP phát virus PRRS,CSF,PED PCV2 Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y, Tập XXVII, số Mai Thị Ngân, Nguyễn Văn Giáp, Cao Thị Bích Phượng, Huỳnh Thị Mỹ Lệ 28 28 28 32 Satoshi Sekiguchi (2021) Phát triển phương pháp LAMP kết hợp sử dụng thị màu kép chẩn đoán phát virus gây tiêu chảy cấp lợn Tạp chí KHKT Thú y, Tập XXVIII, số Liu, M., S Chen, Y Chen, C Liu, S Chen, X Yin, G Li and Y Zhang (2012) Adapted Tembusu-like virus in chickens and geese in China J Clin Microbiol 50(8):28072809 Moore, P (2005) PCR: replicating success Nature, 435(7039):235-238 Notomi, T., H Okayama, H Masubuchi, T Yonekawa, K Watanabe, N Amino and T Hase (2000) Loop-mediated isothermal amplification of DNA Nucleic Acids Res 28(12):E63 Tang, Yi, Hao Chen and Youxiang Diao (2016) Advanced uracil DNA glycosylase-supplemented real-time reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (UDG-rRTLAMP) method for universal and specific detection of Tembusu virus Scientific reports 6:27605-27605 Whiting, S H and J J Champoux (1998) Properties of strand displacement synthesis by Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase: mechanistic implications J Mol Biol, 278(3): 559-577 155 HỘI NGHỊ KHOA HỌC CHĂN NUÔI THÚ Y TOÀN QUỐC 2021 - AVS2021: 149-156 Yan, D., Y Shi, H Wang, G Li, X Li, B Wang, X Su, J Wang, Q Teng, J Yang, H Chen, Q Liu, W Ma and Z Li (2018) A Single Mutation at Position 156 in the Envelope Protein of Tembusu Virus Is Responsible for Virus Tissue Tropism and Transmissibility in Ducks J Virol 92(17) Yan, L., S Peng, P Yan, J Zhou, Q Teng, G Li, X Li and Z Li (2012) Comparison of real-time reverse transcription loopmediated isothermal amplification and real-time reverse transcription polymerase chain reaction for duck Tembusu virus J Virol Methods 182(12):50-55 Mai, TN., Yamazaki W, Bui TP, Nguyen VG, Huynh TML, Mitoma S, Hala ED, Emmanuel Kabali, Norimine J and Sekiguchi S (2020) A descriptive survey of porcine epidemic diarrhea in pig populations in northern Vietnam Trop Anim Health Prod 52(6): 3781-3788 156 Nagamine, K., T Hase and T Notomi (2002) Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers Molecular and Cellular Probes 16(3):223-229 Nagamine, K., K Watanabe, K Ohtsuka, T Hase and T Notomi (2001) Loopmediated isothermal amplification reaction using a nondenatured template Clinical Chemistry 47(9):1742-1743 Sun, Xuejing, Enxue Liu, Adeela Iqbal, Taozhi Wang, Xindong Wang, Abdul Haseeb, Nisar Ahmed, Ping Yang and Qiusheng Chen (2019) The dynamic distribution of duck Tembusu virus in the spleen of infected shelducks BMC veterinary research 15(1):112 Zhang, Wei, Shun Chen, Suresh Mahalingam, Mingshu Wang and Anchun Cheng (2017) An updated review of avianorigin Tembusu virus: a newly emerging avian Flavivirus Journal of General Virology 98(10):2413-2420  ... nghiên cứu ứng dụng LAMP chẩn đoán bệnh virus, vi khuẩn gây Việt Nam hạn chế Do nghiên cứu đề cập đến việc ứng dụng phương pháp LAMP chẩn đoán nhanh TMUV VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật... đồng thuận tốt KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phương pháp RT-LAMP kết hợp thị màu chẩn đoán Tembusu virus Trong nghiên cứu sử dụng enzym Bst DNA polymerase cho phản ứng LAMP enzym hoạt động tốt khoảng... thị màu vào thành phần phản ứng RT-LAMP trước khuếch đại giúp cho việc đọc kết trực tiếp mắt thường Phương pháp RT-LAMP cho kết chẩn đoán TMUV với mức độ đồng thuận cao với phương pháp RT-PCR