PHÂN BIỆT các LOẠI THỊT HEO, bõ, cừu BẰNG PHƯƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN BIỆT CÁC LOẠI THỊT HEO, BÕ, CỪU BẰNG PHƢƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: TRỊNH THỊ THANH HUYỀN Thành phố Hồ Chí Minh 09/2007 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN BIỆT CÁC LOẠI THỊT HEO, BÕ, CỪU BẰNG PHƢƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR Giáo viên hƣớng dẫn: PGS TS NGUYỄN NGỌC TUÂN KS LƢƠNG QUÝ PHƢƠNG Sinh viên thực hiện: TRỊNH THỊ THANH HUYỀN Thành phố Hồ Chí Minh 09/2007 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến: Thầy PGS.TS Nguyễn Ngọc Tuân, Giảng viên khoa Chăn nuôi thú y, trƣờng Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Cơ PGS.TS Trần Thị Dân, Giảng viên khoa Chăn nuôi thú y, trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh KS Lƣơng Quý Phƣơng, Trung tâm Phân tích thí nghiệm hóa sinh trƣờng Đại Học Nơng Lâm Đã tận tình hƣớng dẫn, ủng hộ giúp đỡ tơi thực hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trƣờng Đại Học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, tất quý thầy cô truyền đạt kiến thức quý báu cho suốt thời gian học trƣờng - Ban giám đốc, thầy cô cán cơng chức Trung tâm phân tích thí nghiệm hóa sinh trƣờng Đại Học Nơng Lâm, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi thực tập hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp - Thầy Đinh Xn Phát nhiệt tình giúp đỡ, động viên tơi q trình học tập nhƣ thực khóa luận Tập thể bạn sinh viên lớp Công nghệ sinh học 29 - Trƣờng Đại học Nông Lâm TP HCM ln bên tơi lúc khó khăn, tơi chia sẻ vui buồn q trình học q trình thực khóa luận Và đặc biệt xin thành kính ghi ơn Cha Mẹ sinh thành, dƣỡng dục nên ngƣời, để đƣợc nhƣ ngày hôm iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 09 năm 2007 Sinh viên: Trịnh Thị Thanh Huyền TÓM TẮT KHÓA LUẬN TRỊNH THỊ THANH HUYỀN, thực khóa luận “Phân biệt ba loại thịt heo, bò cừu phƣơng pháp multiplex PCR” Hƣớng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Ngọc Tuân KS Lƣơng Quý Phƣơng Thời gian thực từ tháng 2/2007 đến tháng 8/2007, Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa – Sinh, trƣờng Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Để tạo tiền đề việc giải vấn đề gian lận thƣơng mại sản phẩm thịt tƣơi thịt chế biến, bƣớc đầu chúng tơi tiến hành thiết lập quy trình phân biệt ba loại thịt heo, bò, cừu phƣơng pháp multiplex PCR Kết đạt đƣợc nhƣ sau: 1) Tách chiết DNA từ thịt tƣơi thịt xử lý nhiệt nhiệt độ: 800C/15’, 1200C/15’, 1200C/30’, 1300C/15’ với tỷ số OD trung bình 2,0 (thịt tƣơi), 1,9 (thịt xử lý nhiệt)- tinh sạch, đạt tiêu chuẩn 2) Sau tiến hành tối ƣu hóa phản ứng multiplex PCR việc thử nghiệm nhiều quy trình (gồm quy trình Matsunaga ctv (1998) thử nghiệm điều chỉnh thành phần hóa chất, nhiệt độ thời gian chu trình nhiệt, nồng độ mồi phản ứng), chúng tơi xác định đƣợc quy trình thích hợp, nồng độ MgCl2 2mM, lƣợng FSIM: RP: RB: RS lần lƣợt 0,4: 0,83: 0,24: 0,17 M, nhiệt độ thời gian chu kỳ nhiệt giai đoạn lặp lại là: biến tính (940C/1phút), bắt cặp (540C/45giây), kéo dài (720C/1phút) 3) Sử dụng quy trình nultiplex PCR vừa tìm đƣợc hỗn hợp DNA ba lồi nồng độ DNA bị, cừu giảm dần xác định đƣợc nồng độ thịt cừu, bị mà quy trình cịn phát đƣợc 1ng/ l 4) Chúng tiếp tục thực quy trình hỗn hợp thịt xử lý nhiệt nhiệt độ khác rút kết luận nhiêt độ biến tính 800C/15’, 1200C/15’, 1200C/30’, 1300C/15’ cịn phân biệt đƣợc ba loài LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 5) Thực quy trình với bột thịt hãng CE, A, VY, kết bột thịt hãng có nguồn gốc lần lƣợt là: heo, bò, bò SUMMARY TRINH THI THANH HUYEN in subject “Identifying meat of three meat species: pig, bovine, sheep by multiplex PCR” Suspervisors : PhD Nguyen Ngọc Tuan BCs Luong Quy Phuong To primarily resolve economic faudulent at meat products, we establish protocol to identify meat of three species (pig, bovine, sheep) by multiplex PCR The results: 1) Extraction DNA from raw meats and heated meats (at temperatures: 800C/15 min, 1200C/15 min, 1200C/30 min, 1300C/15 min), average ratio of OD were 2,0 (raw meat) and 1,9 ( heated meat) were pure, standard quality 2) After optimizing procedures including protocol of Matsunaga et al.(1998) and changing volume of reaction, element of chemical, temperature and time of thermal cycle, concentration of primer), we established the suitable multiplex PCR protocol This protocol was MgCl2 mM; concentration of primers FSIM: RP: RB: RS were 0,4: 0,83: 0,24: 0,17 M, temperature and thermal cycle (denature 940C/1 min, anealing 540C/45 sec, elongation 720C/1 min) 3) Aplying the multiplex PCR protocol to analyse mix DNA from three meat with descending concentration on bovine DNA and sheep DNA, the limits of DNA sample detected were 1ng/ l for bovine and sheep 4) Using the protocol for mix heated meats to reach the conlusion that at processing temperatures: 800C/15 min, 1200C/15min, 1200C/30 min, 1300C/15min the meats of pig, bovine, sheep were still identified Meat and bone meal from three companies (CE, A, VY) were examined by the established protocol, the products of those company were meat from pig, bovine and bovine, respectively LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC NỘI DUNG TRANG Bìa i Trang tựa ii Lời cảm tạ iii Tóm tắt khóa luận iv Summary v Mục lục vi Danh sách chữ viết tắt x Danh sách bảng xi Danh sách hình biểu đồ xii Chƣơng MỞ ĐẦU .1 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích 1.3 Yêu cầu Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lƣợc thịt chế biến .3 2.1.1 Giới thiệu thịt 2.1.2 Giới thiệu thịt chế biến 2.1.3 Tình hình sản xuất tiêu thụ thịt chế biến 2.1.3.1 Tình hình gian lận thị trƣờng thịt tƣơi thịt chế biến giới LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2.1.3.2 Tình hình xuất nhập động vật sản phẩm chế biến từ động vật Việt Nam 2.2 Một vài đặc điểm tế bào động vật .6 2.3 Cơ sở để phân biệt loại thịt chế biến phƣơng pháp multiplex PCR 2.4 Các phƣơng pháp phân biệt loại thịt 2.4.1 Phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi quang học 2.4.2 Miễn dịch liên kết enzym (ELISA) 2.4.3 Protein array 2.4.4 Điện di chiều 2.4.5 Giới thiệu chung phƣơng pháp PCR (polymerase chain reaction) .10 2.4.6 Nguyên tắc multiplex PCR .16 2.5 Các cơng trình nghiên cứu phát loài thịt chế biến phƣơng pháp multiplex PCR 16 Chƣơng NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1 Nội dung thực 18 3.2 Thời gian địa điểm tiến hành 18 3.3 Vật liệu 19 3.3.1 Nguồn mẫu tách chiết DNA .19 3.3.2 Đoạn mồi 19 3.3.3 Hóa chất 19 3.3.3.1 Hóa chất dùng tách chiết DNA .19 3.3.3.2 Hóa chất dùng điện di 19 3.3.3.3 Hóa chất dùng phản ứng PCR .20 3.3.3.4 Thiết bị dụng cụ 20 3.4 Phƣơng pháp tiến hành 20 3.4.1 Lấy bảo quản mẫu 20 3.4.2 Phối hợp loại thịt để tạo hỗn hợp thịt xử lý nhiệt 20 3.4.3 Tách chiết DNA 21 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3.4.4 Thực phản ứng s-PCR .22 3.4.5 Tối ƣu hóa phản ứng m-PCR 24 3.4.5.1 Thực phản ứng m-PCR theo quy trình Matsugana ctv (1998) .24 3.4.5.2 Thí nghiệm điều chỉnh thành phần phản ứng 24 3.4.5.3 Thí nghiệm điều chỉnh chu trình nhiệt 24 3.4.5.4 Thí nghiệm điều chỉnh nồng độ mồi phản ứng 25 3.4.6 Thực phản ứng m-PCR hai lồi (heo, bị heo, cừu) nồng độ DNA khác 26 3.4.7 Thực phản ứng m-PCR cho hỗn hợp DNA heo, bò, cừu 27 3.4.8 S-PCR DNA thịt xử lý nhiệt nhiệt độ khác nhau: 800C/15 phút, 1200C/15 phút, 1200C/30 phút, 1300C/15 phút 27 3.4.9 M-PCR để phát thịt heo, bò, cừu hỗn hợp thịt xử lý nhiệt nhiệt độ khác 28 3.4.10 M-PCR đối cới bột thịt 28 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1 Kết tách chiết 29 4.2 Kết s-PCR thịt tƣơi lồi theo quy trình Matsugana ctv (1998) 31 4.3 Kết phản ứng m-PCR lồi theo quy trình Matsugana ctv (1998) .32 4.4 Kết trình thiết lập tối ƣu hóa phản ứng m- PCR 33 4.4.1 Điều chỉnh thể tích phản ứng 33 4.4.2 Kết thí nghiệm điều chỉnh nồng độ Mg2+ 33 4.4.3 Kết thí nghiệm điều chỉnh chu trình nhiệt 34 4.4.4 Kết thí nghiệm điều chỉnh nồng độ mồi 36 4.4.5 Kết kiểm tra tính ổn định quy trình .38 4.5 Kết m-PCR loài 39 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 4.6 Kết m-PCR hỗn hợp DNA có nồng độ giảm dần DNA bị, cừu 40 4.7 Kết s-PCR thịt xử lý nhiệt 40 4.8 Kết m-PCR hỗn hợp thịt xử lý nhiệt 43 4.9 Kết m-PCR bột thịt .45 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .47 5.1 Kết luận 47 5.2 Đề nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC 51 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng Tỉ lệ mơ loại thịt (%tính theo khối lƣợng thịt xẻ) Bảng Tỷ lệ loại thịt hỗn hợp thịt 21 Bảng Thành phần hóa chất PCR 23 Bảng 3 Nồng độ mồi ngƣợc loại thịt s-PCR 23 Bảng Chu trình nhiệt phản ứng 23 Bảng Thành phần hóa chất PCR 24 Bảng Chu trình nhiệt phản ứng trƣớc sau điều chỉnh .25 Bảng Điều chỉnh nồng độ mồi RS (giảm) 25 Bảng Điều chỉnh nồng độ mồi RP (tăng) 26 Bảng Phối hợp DNA heo bò nồng độ khác 26 Bảng 10 Phối hợp DNA heo cừu nồng độ khác 27 Bảng 11 Thành phần hỗn hợp DNA heo, bò, cừu 27 Bảng 12 Hỗn hợp thịt nhiệt độ xử lý khác 28 Bảng Tỷ số OD hàm lƣợng DNA thịt bò, heo, cừu 29 Bảng Tỷ số OD hàm lƣợng DNA tách chiết từ thịt tƣơi thịt xử lý nhiệt .30 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com C3.1 C3.2 C3.3 C3.4 C3.5 C3.6 Band bò (274bp) Band heo Band cừu (398bp) (274bp) Tạp Hình 4.18 Kết m – PCR hỗn hợp thịt xử lý nhiệt ở1200C/15 phút Kết m-PCR hỗn hợp thịt xử lý nhiệt 1200C/30 phút (hình 4.19) C4.1 C4.2 C4.3 C4.4 C4.5 C4.6 Band bò (274 bp) Band heo Band cừu (398 bp) (331 bp) Tạp Hình 4.19 Kết m-PCR hỗn hỗn hợp xử lý nhiệt 1200C/30 phút 44 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Kết m-PCR hỗn hợp thịt xử lý nhiệt 1300C/15 phút – điện di với ladder để đối chứng (hình 4.20) Lad C5.1 C5.2 C5.3 C5.4 C5.5 C5.6 Band bò (331 bp) Band cừu Band heo (274 bp) (398 bp) Tạp Hình 4.20 Kết m-PCR hỗn hợp thịt xử lý nhiệt 1300C/15 phút Các kết cho thấy, quy trình m-PCR chúng tơi hồn tồn có khả ứng dụng để phát ba loại thịt heo, bò, cừu hỗn hợp thịt xử lý nhiệt Với quy trình này, tỷ lệ 1% thịt bò, cừu hỗn hợp thịt (C2.6, C3.6, C4.6, C5.6) xử lý từ 800C đến 1300C/15 phút phát đƣợc 4.9 Kết m-PCR bột thịt Khi xác định đƣợc quy trình hồn tồn phù hợp để xác định thịt xử lý nhiệt, tiến hành m-PCR đối tƣợng bột thịt sở: CE, A, VY Qua điện di ba mẫu PCR bột thịt với ba đối chứng sản phẩm s-PCR DNA thịt heo, bò, cừu (mục 4.2), kết thu đƣợc: bột thịt CE có nguồn gốc từ thịt heo, cịn bột thịt A VY có nguồn gốc từ thịt bị (hình 4.21) 45 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com đối chứng T.heo T.bò T.cừu CE A VY Band heo (398 bp) Band bị (274 bp) Tạp Hình 4.21 Sản phẩm m-PCR bột thịt 46 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Tách chiết DNA thành công thịt tƣơi thịt xử lý nhiệt 800C/15 phút, 1200C/15 phút, 1200C/30 phút, 1300C/15 phút với độ tinh cao Thiết lập đƣợc quy trình m-PCR tối ƣu để phát ba lồi heo, bị, cừu hỗn hợp thịt chế biến Quy trình áp dụng cho thịt tƣơi thịt xử lý nhiệt nhiệt độ: 800C/15 phút, 1200C/15 phút, 1200C/30 phút, 1300C/15 phút Quy trình phát đƣợc nồng độ DNA thịt cừu thịt bò mức ng/ l tỉ lệ hỗn hợp thịt 1% Quy trình áp dụng đƣợc việc phân tích bột thịt làm nguyên liệu cho thức ăn gia súc 5.2 Đề nghị Thử nghiệm quy trình m-PCR hỗn hợp thịt xử lý nhiệt độ cao Tối ƣu hóa quy trình để thử nghiệm với nồng độ DNA nhỏ Thử nghiệm với nhiều loại thịt gia súc gia cầm khác để tiến tới quy trình kiểm nghiệm kiểm sốt lồi bột thịt nhập vào nƣớc ta Xây dựng quy trình định lƣợng DNA loài hỗn hợp thịt chế biến phƣơng pháp real time PCR (RT- PCR) 47 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tài liệu tiếng Việt Bùi Thị Cúc, 2006 Tình hình xuất nhập động vật sản phẩm động vật Cục Thú y /Department of animal heath of Việt Nam Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 2002 Sinh Học Phân Tử (Khái Niệm - Phương Pháp - ứng Dụng) Tái lần 2, NXB Giáo Dục, Thành Phố Hồ Chí Minh Hồ Thị Nguyệt Thu, 2003 Giáo trình mơn học chế biến thịt Giáo trình mơn học, khoa công nghệ thực phẩm trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Lƣơng Quý Phƣơng, 2006 Sản xuất kit tách chiết DNA kit PCR phát gen halothan heo Khóa luận tốt nghiệp kỹ sƣ công ngệ sinh học, Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam Nguyễn Đình Trung, Nguyễn Minh Tâm, 2005 Giáo trình Giải phẩu sinh ký vật nuôi NXB Hà Nội Tr 38-39 Nguyễn Ngọc Tuân, Lê Thanh Hiền, 2004 Chế biến bảo quản thịt sữa NXB Nông nghiệp, Thành Phố Hồ Chí Minh Tr 11- 16 Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu, 1999 Sinh học phân tử Giới thiệu ứng dụng Nhà xuất Nơng nghiệp TP Hồ Chí Minh Nguyễn Văn Uyển, 1995 Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật, Tập Nhà xuất nông nghiệp Phạm Văn Ty, 2001 Miễn dịch học Nhà xuất Đại học Quốc Gia Hà Nội 10 Trần Nhật Phƣơng, 2004 Protein array Tài liệu giảng dạy, môn công nghệ sinh học, trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Tr 6-10 11 Trần Thị Xô, Nguyễn Thị Lan, 1999 Cơ sở di truyền công nghệ gen NXB Khoa Học Kỹ Thuật Hà Nội Tr 163-169 48 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 12 Xmolxki N.T., 1997 Hóa sinh học thịt gia súc NXB KHKT, Hà Nội (Đặng Đức Dũng dịch) 165 trang  Tài liệu tiếng nƣớc 13 Ali A., Irfan O., Calicioglu M , 2005 Effect of method of cooking on identification of heat processed beef using polymerase chain reaction (PCR) technique Meat science 72: 326-330 14 Garfin E David, 2000 Electrophoretic Methods Academic Press, A Harcourt Science and Technology Company 109 p 15 Rybicki E.D., Purves M., 2003 SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-page) Deft Microbiology, University of Cape Town 51 pg 16 Romans R John, Costello J William, Carson C Wendell, Greaser L Mairon, Kevin W Jones, 1999 The meat we eat Interstate publishers, INC 593p 17 Myers J Michael, Farrell E Dorothy; Heller N David, Yancy F Haile, 2004 Development of a polymerase chain reaction-based method to identify species-specific components in dog food Food and drug Administration 18 Davidson W Michael, 2005 Molecular expressions cell biology and Microscopy structure and fuction of cell and viruses: animal cell structure The Florida State University 19 Montiel-Sosa JF, Ruiz-Pesini E, Montoya J, Roncalés P, López-Pérez MJ, Pérez-Martos A, 2000 Direct and highly species-specific detection of pork meat and fat in meat products by PCR amplification of mitochondrial DNA Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular, Facultad de Veterinaria, Universidad de Zaragoza, E-50013 Zaragoza, Spain 20 Murray BW, McClymont RA, Strobeck C, 1995 Forensic identification of ungulate species using restriction digests of PCR-amplified mitochondrial DNA Department of Biology, McMaster University, Hamilton, Ontario, Canada 21 Sambrook Joseph and Russell W David, 2001 Molecular cloning (A laboratory manual) 3rd edition, Cold Spring Harbor laboratory press, New York, USA Vol.2: p 8.23, Vol.3: p A8.13 49 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 22 Sawyer M, Rensen G, Smith W, Yee M, Wong A, Osburn B, Cullor J, 1997 Overcoming RNA inhibition in the fluorescent polymerase chain reaction assay to enhance detection of bovine DNA in cattle feeds Department of Population Health and Reproduction, School of Veterinary Medicine, University of California, Sawyer, California 95616, USA 23 Matsugana T., Chikuni K., Tanabe R., Muroya S., Shibata K, Yamada J., Shinmura Y.,1998 A quick and simple method for the identification of meat species and meat products by PCR assay Meat science 51: p 143148 24 Yale T., 1997 Troubleshooting for PCR and multiplex PCR 25 Wayne RK., Geffen E., Girman DJ., Koepfli KP., Lau LM., Marshall CR., 1997 Molecular systematics of the Canidae Department of Biology, University of California, Los Angeles, California 90095, USA 26 Cheng Y.H., Wen C.M., Ding S.T., Kao C.C., Kuo T.Y., 2003 Detecting meat – bone meal in ruminant’s feeds by species – specific PCR Journal of Animal and Sciences, 12, 2003, 851-860  Tài liệu internet: 27 http:// www.cucthuy.gov.vn> 28 http://mmsawyer@ucSawyer.edu> 29 http://www.europa.eu.int/comm/food/fs/bse/index-in.html> 30 http://www.business.gov.vn/LicenseDetail.aspx?id=883 - 37k> 31 http://www.blackwell-synergy.com/doi/abs/10.1111/j.17454573.2006.00046.x 32 http://archive.food.gov.uk/maff/archive/food/insheet/1999/N0167/176 meat.htm 50 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHỤ LỤC Phụ lục 1: 30/08/07 03:05:53 PM Page Analysis of Variance for TTTBT.tsod - Type III Sums of Squares Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level MAIN EFFECTS A:TTTBT.mau 0819391 0819391 1.374 2457 RESIDUAL 3.6984594 62 0596526 TOTAL (CORRECTED) 3.7803984 63 missing values have been excluded All F-ratios are based on the residual mean square error 30/08/07 03:06:52 PM Page Table of Least Squares Means for TTTBT.tsod 95% Confidence Level Count Average Stnd Error for mean - LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com GRAND MEAN 64 1.9848438 0305298 1.9238016 32 2.0206250 0431757 1.9342984 32 1.9490625 0431757 1.8627359 2.0458859 A:TTTBT.mau t 2.1069516 c 2.0353891 - 30/08/07 03:07:39 PM Page Multiple range analysis for TTTBT.tsod by TTTBT.mau Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups c 32 1.9490625 X t 32 2.0206250 X contrast difference t - c 0.07156 +/- limits 0.12208 * denotes a statistically significant difference Phụ lục 2: 30/08/07 03:08:40 PM Page Analysis of Variance for TTTBT.NDDND - Type III Sums of Squares - LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level MAIN EFFECTS A:TTTBT.mau 7331641 7331641 26.615 0000 RESIDUAL 1.7078977 62 0275467 TOTAL (CORRECTED) 2.4410618 63 missing values have been excluded All F-ratios are based on the residual mean square error 30/08/07 03:09:12 PM Page Table of Least Squares Means for TTTBT.NDDND 95% Confidence Level Count Average Stnd Error for mean GRAND MEAN 64 2660625 0207465 2245814 32 3730938 0293400 3144306 32 1590312 0293400 1003681 3075436 A:TTTBT.mau t 4317569 c 2176944 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 30/08/07 03:09:52 PM Page Multiple range analysis for TTTBT.NDDND by TTTBT.mau Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups c 32 1590312 t 32 3730938 X X contrast difference t - c 0.21406 +/- limits 0.08296 * * denotes a statistically significant difference Phụ lục 3: 30/08/07 03:36:41 PM Page Analysis of Variance for BPS.tisood - Type III Sums of Squares Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level MAIN EFFECTS A:BPS.mau 1804513 0902256 785 4637 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com RESIDUAL 4.1364154 36 1149004 TOTAL (CORRECTED) 4.3168667 38 missing values have been excluded All F-ratios are based on the residual mean square error 30/08/07 03:37:08 PM Page Table of Least Squares Means for BPS.tisood 95% Confidence Level Count Average Stnd Error for mean GRAND MEAN 39 2.0166667 0542786 1.9065591 13 1.9269231 0940133 1.7362111 13 2.0915385 0940133 1.9008265 13 2.0315385 0940133 1.8408265 2.1267743 A:BPS.mau b 2.1176350 p 2.2822504 s 2.2222504 30/08/07 03:37:42 PM Page Multiple range analysis for BPS.tisood by BPS.mau LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups b 13 1.9269231 X s 13 2.0315385 X p 13 2.0915385 X contrast difference +/- limits b - p -0.16462 0.26971 b - s -0.10462 0.26971 p - s 0.06000 0.26971 * denotes a statistically significant difference Phụ lục 4: 30/08/07 03:14:08 PM Page Analysis of Variance for BPS.dna - Type III Sums of Squares Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level MAIN EFFECTS A:BPS.mau 4887762 2443881 12.075 0001 RESIDUAL 7286095 36 0202392 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TOTAL (CORRECTED) 1.2173857 38 missing values have been excluded All F-ratios are based on the residual mean square error 30/08/07 03:14:37 PM Page Table of Least Squares Means for BPS.dna 95% Confidence Level Count Average Stnd Error for mean GRAND MEAN 39 3005128 0227805 2543010 13 1544615 0394570 0744204 13 3206154 0394570 2405742 13 4264615 0394570 3464204 3467246 A:BPS.mau b 2345027 p 4006565 s 5065027 30/08/07 03:15:05 PM Page Multiple range analysis for BPS.dna by BPS.mau Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com b 13 1544615 X p 13 3206154 X s 13 4264615 X contrast difference +/- limits b - p -0.16615 0.11320 * b - s -0.27200 0.11320 * p - s -0.10585 0.11320 * denotes a statistically significant difference LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... quy trình phân biệt ba loại thịt heo, bị, cừu hỗn hợp thịt chế biến phƣơng pháp multiplex PCR 1.2 Mục đích Bƣớc đầu xây dựng quy trình multiplex PCR phát phân biệt thịt heo, bò, cừu Ứng dụng quy... tế bào động vật .6 2.3 Cơ sở để phân biệt loại thịt chế biến phƣơng pháp multiplex PCR 2.4 Các phƣơng pháp phân biệt loại thịt 2.4.1 Phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi quang... phẩm thịt tƣơi thịt chế biến, bƣớc đầu chúng tơi tiến hành thiết lập quy trình phân biệt ba loại thịt heo, bò, cừu phƣơng pháp multiplex PCR Kết đạt đƣợc nhƣ sau: 1) Tách chiết DNA từ thịt tƣơi thịt